劉文賢，劉騰飛，張?chǎng)?，侯蓓蓓，余?/p>

（1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)科，四川瀘州646000；2四川省人民醫(yī)院康復(fù)科）

不同強(qiáng)度重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)腦梗死大鼠條件性恐懼記憶的影響*

劉文賢1，劉騰飛2，張?chǎng)?，侯蓓蓓2，余茜1

（1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)科，四川瀘州646000；2四川省人民醫(yī)院康復(fù)科）

目的:研究不同強(qiáng)度重復(fù)經(jīng)顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation,，rTMS）對(duì)腦梗死大鼠條件性恐懼記憶的影響。方法:雄性成年SD大鼠40只，體重200～250 g，采用改良Zea longa線栓法對(duì)大鼠制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞的腦梗死模型。建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組及40%（0.76 T）、60%（1.14 T）、80%（1.52 T）強(qiáng)度刺激組，每組8只，另外假手術(shù)組8只。各刺激組大鼠于建模成功后第5 d開始按照設(shè)定參數(shù)分別接受磁刺激，連續(xù)5 d，假手術(shù)組和模型組置于相同磁場(chǎng)環(huán)境，但不接受磁刺激。治療結(jié)束后，給予各組大鼠相同足底電擊（55 V，2 s），在24 h后檢測(cè)大鼠在5 min內(nèi)的僵直持續(xù)時(shí)間。結(jié)果:各刺激組大鼠在接受足底電擊24 h后的僵直持續(xù)時(shí)間均明顯高于模型組（P＜0.01）,并且隨著刺激強(qiáng)度的增加，大鼠在24 h后的僵直持續(xù)時(shí)間也明顯增長(zhǎng)（P＜0.01）。結(jié)論:rTMS能促進(jìn)腦梗死大鼠記憶功能的恢復(fù)，并隨著刺激強(qiáng)度的加強(qiáng)，大鼠記憶能力的恢復(fù)程度亦增強(qiáng)。

腦梗死；重復(fù)經(jīng)顱磁刺激；恐懼記憶

腦梗死（cerebral infarction）是指因腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧所導(dǎo)致的局限性缺血性壞死或軟化[1]。作為一種高發(fā)病率和高致殘率的疾病，腦梗死給人類健康和生命帶來威脅的同時(shí)也影響患者日常生活能力，給社會(huì)及家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激技術(shù)（repetitive transcranial magnetic stimulation,，rTMS）是一種利用脈沖磁場(chǎng)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（主要是大腦），改變皮層神經(jīng)細(xì)胞的膜電位，使之產(chǎn)生感應(yīng)電流，影響腦內(nèi)代謝和神經(jīng)電活動(dòng)，從而引起一系列生理生化反應(yīng)的磁刺激技術(shù)，作為一種新的精神神經(jīng)系統(tǒng)治療技術(shù)，具有無痛、無創(chuàng)、安全和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于治療帕金森病、癲癇、抑郁癥、腦梗死、脊髓損傷等疾病的臨床治療中，并取得了較好的療效[2-3]。條件性恐懼的形成是一種學(xué)習(xí)和記憶的過程，本研究旨在通過對(duì)腦梗死后大鼠條件性恐懼記憶的觀察來研究rTMS對(duì)腦梗死后大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)作用，同時(shí)探索其治療強(qiáng)度與功能恢復(fù)程度的關(guān)系，為rTMS將來更好地應(yīng)用于臨床腦梗死患者的治療提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)成年SD雄性大鼠，體重約200～250 g（由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），鼠齡12周，在飼養(yǎng)籠里給予12 h光/暗周期，可自由采食水和食物，隨機(jī)取8只作為假手術(shù)組，其余大鼠制成右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞腦梗死模型，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組及40%（0.76 T）、60%（1.14 T）、80%（1.52 T）強(qiáng)度刺激組，每組8只。

1.2 儀器

武漢依瑞德公司生產(chǎn)的磁場(chǎng)刺激儀（CCY-1型）；自主設(shè)計(jì)制成的恐懼記憶條件訓(xùn)練箱[4]：訓(xùn)練箱材料為有機(jī)玻璃（20 cm×20 cm×20 cm），箱底由13根直徑為5 mm（間隔10 mm）不銹鋼絲作為電極的電極板。

1.3 腦梗死動(dòng)物模型的制作

參照改良Zea longa線栓法[5]制成右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血模型。動(dòng)物蘇醒后表現(xiàn)為提尾時(shí)左側(cè)前肢內(nèi)收屈曲；同側(cè)Horner氏征；爬行時(shí)向左劃圈；站立時(shí)左側(cè)傾倒。凡具有上述體征者列入研究對(duì)象。共用大鼠100只，有32只符合入選條件并存活到規(guī)定時(shí)間。假手術(shù)組僅作右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎，術(shù)后無病理行為學(xué)改變。

1.4 治療方法

刺激組在造模成功后第2 d行rTMS治療，將大鼠頭部固定，使其在刺激過程中保持清醒、安靜和舒適。磁場(chǎng)線圈中心處于大鼠囟門右旁開0.5 cm處。設(shè)計(jì)刺激參數(shù)為：刺激頻率1 Hz，刺激強(qiáng)度為40%（0.76 T）、60%（1.14 T）、80%（1.52 T）輸出強(qiáng)度；3組/ d，5序列/組，20次/序列，每個(gè)序列間隔10 s，每組間隔60 s，連續(xù)刺激5 d，每天于14:00～15:00實(shí)施刺激，假手術(shù)組和模型組置于相同磁場(chǎng)環(huán)境，但不接受磁刺激。

1.5 記憶能力評(píng)價(jià)[6]

實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練和檢測(cè)兩個(gè)部分，各組大鼠均于治療結(jié)束后第2 d行場(chǎng)景性條件性恐懼實(shí)驗(yàn)。每次使用電擊箱前用95%乙醇擦拭箱底和鋼絲，將大鼠分別置于無聲，無特殊氣味的測(cè)試箱中，適應(yīng)3 min后，開始給予短暫足底電擊（55 V，2 s）共6次，2次足底點(diǎn)擊時(shí)間間隔平均為90 s（60～120 s隨機(jī)變化），最后1次電擊結(jié)束后30 s將大鼠放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練結(jié)束24 h后進(jìn)行記憶形成和保持能力的測(cè)試，將大鼠放入同一電擊箱中無電刺激呈現(xiàn)，觀察并用秒表記錄大鼠5 min內(nèi)僵直（Freezing）反應(yīng)時(shí)間。僵直的判定標(biāo)準(zhǔn)是動(dòng)物接受刺激信號(hào)后,除呼吸運(yùn)動(dòng)外,全身其他軀體運(yùn)動(dòng)全部停止的狀態(tài)。在這一行為模型中，僵直反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短反映大鼠對(duì)電擊這一場(chǎng)景的恐懼記憶程度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每組樣本數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠恐懼記憶能力明顯下降，rTMS組大鼠恐懼記憶能力均明顯高于模型組，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,在刺激組中，隨著刺激強(qiáng)度的增加，大鼠在24 h的僵直時(shí)間也明顯增長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 不同強(qiáng)度rTMS對(duì)腦梗死后大鼠條件性恐懼記憶的影響

3 討論

重復(fù)經(jīng)顱磁刺激（rTMS）是1991年在經(jīng)顱磁刺激基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的神經(jīng)電生理技術(shù)，無痛無創(chuàng)、操作方便、安全可靠，能影響局部和遠(yuǎn)隔皮層功能，實(shí)現(xiàn)皮層功能區(qū)域性重建，影響多種神經(jīng)遞質(zhì)和基因表達(dá)水平，目前在抑郁癥、帕金森病、癲癇、神經(jīng)性疼痛、脊髓損傷和腦卒中等疾病臨床治療中得到廣泛的應(yīng)用。臨床研究表明，rTMS能促進(jìn)腦梗死患者肢體功能的恢復(fù)和提高患者的日常生活能力[7]。目前研究中腦梗死大鼠學(xué)習(xí)記憶行為評(píng)估實(shí)驗(yàn)多以Y型迷宮和水迷宮為主[8-9]，條件性恐懼的形成也是一種學(xué)習(xí)和記憶的過程，本研究以條件性恐懼記憶作為學(xué)習(xí)記憶評(píng)估實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示rTMS能促進(jìn)腦梗死大鼠記憶功能的恢復(fù)，并隨著刺激強(qiáng)度的加強(qiáng)，腦梗死大鼠記憶能力的恢復(fù)程度亦增強(qiáng)。

目前，有關(guān)rTMS能促進(jìn)腦梗死大鼠記憶能力恢復(fù)可能的機(jī)制研究較多。已有研究報(bào)道[10]，rTMS能促進(jìn)腦梗死大鼠海馬突觸素（Syn）的表達(dá)，Syn是突觸囊泡的一種特異標(biāo)志性膜蛋白，其數(shù)量和分布密度可間接反映突觸的密度，突觸作為神經(jīng)元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的部位，其密度增多，海馬區(qū)神經(jīng)元之間的傳遞和聯(lián)系隨之增強(qiáng)；此外，磁刺激也可增加腦梗死側(cè)皮層腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元再生,刺激軸突的芽生和新突觸的形成，抑制促凋亡蛋白Bax、BAD等，從而對(duì)腦梗死部位產(chǎn)生多種神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[11]；另有研究報(bào)道[12]，rTMS治療也能抑制缺血組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和增加神經(jīng)可塑性，可用于腦梗死后亞急性期記憶功能恢復(fù)的治療；另外，rTMS能調(diào)節(jié)miR-25/p57信號(hào)通路，能促進(jìn)腦梗死后腦室下區(qū)成體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，加強(qiáng)腦梗死后的自我修復(fù)能力[13]。

rTMS對(duì)腦梗死患者療效作用與許多因素有關(guān)，主要因素則是刺激參數(shù)的設(shè)置如強(qiáng)度、頻率、刺激持續(xù)時(shí)間等，本實(shí)驗(yàn)在保證除強(qiáng)度外的其它參數(shù)相同的前提下發(fā)現(xiàn)隨著刺激強(qiáng)度的加強(qiáng)，大鼠記憶能力的恢復(fù)程度亦增強(qiáng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，這可能與磁刺激能影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移有關(guān)，且隨著刺激強(qiáng)度的增強(qiáng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移能力也增強(qiáng)[14]。在保證治療安全的前提下，本研究?jī)H探討不同強(qiáng)度重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)腦梗死后大鼠條件性恐懼記憶的影響，對(duì)其余參數(shù)如頻率、刺激總量等對(duì)腦梗死治療的量效關(guān)系有待進(jìn)一步基礎(chǔ)和臨床研究。

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（2016-04-23收稿）

Effects of repetitive transcranial magnetic stimulation with different intensity on the conditioned fear memory in rats with cerebral infarction

Liu Wenxian1,Liu Tengfei2,Zhang Xin2,Hou Beibei2，Yu Qian11Department of Thoracic Surgery,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan Province，646000,China；2Department of Thoracic Surgery Sichuan Province Peoples Hospited

Objective:To study the effect of repetitive transcranial magnetic stimulation（repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS）with different intensity on the conditioned fear memory in rats with cerebral infarction.Methods:Forty male adult sprague-dawley rats,weighing 200～250 g,were performed right middle cerebral artery occlusion（MCAO）by modified Zea longa suture method to create cerebral infarction model.Model rats were randomly divided into a model group,40%（0.76 T）,60%（1.14 T）,80%（1.52 T）intensity stimulation group,and a sham operation group（n=8 in each group）.The rats in the rTMS group were treated with magnetic stimulation on the day after the infarction for a total of 5 days.The sham group and the model group were placed in the same magnetic field environment,but were not given any magnetic stimulation.At the end of treatment, each group was given the same foot shock,and the duration of Stupor response was recorded for 5 minutes after 24 h.Results:The duration of stupor response in rTMS groups receiving foot shock after 24 h was significantly longer than those in the model group（P＜0.01），and in rTMS groups,with the increasing intensity of the stimulation the durations of stupor response after 24 h were also significantly increased（P＜0.01）.Conclusion：rTMS can promote the memory recovery in rats with cerebral infarction,and with the increasing intensity of the stimulation the degree of memory recovery is also enhanced.

Cerebral infarction;Repetitive transcranial magnetic stimulation;Fear memory

R743.31

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.018

*四川省科技廳科研基金資助項(xiàng)目（編號(hào):2014JY0032）

劉文賢（1991-），女，住院醫(yī)師，碩士生

余茜（1968-），女，教授，博士，現(xiàn)四川省人民醫(yī)院康復(fù)科工作。E-mail：Ygswcll@163.com