郭亞威 王長遠(yuǎn) 孫長怡 賀明軼 曹濤

基礎(chǔ)研究

姜黃素緩解小鼠高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)肥胖的相關(guān)機(jī)制研究

郭亞威 王長遠(yuǎn) 孫長怡 賀明軼 曹濤

目的 研究姜黃素緩解高脂誘導(dǎo)肥胖的作用及其相關(guān)機(jī)制。方法 選用8周齡C57BL/6雄性小鼠24只，隨機(jī)分為3組，分別飼喂低脂日糧（對照組）、高脂日糧（模型組）和高脂日糧并灌服姜黃素（姜黃素組）。試驗(yàn)期為8周。結(jié)果 與模型組小鼠相比，姜黃素組小鼠體重、肝臟和附睪脂肪組織重量降低了13.8%、26.2%和61.0%（P<0.05）；與模型組小鼠相比，姜黃素組小鼠棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶（cpt1）、?；o酶A脫氫酶（acdam）和過氧化物酶增值體激活受體γ輔激動子1α（pgc1α）表達(dá)提高了950%、1752%和642%，P<0.05），而叉頭蛋白O1（FOXO1）表達(dá)降低了83.6%（P<0.05）。結(jié)論 姜黃素通過抑制FOXO1途經(jīng)，促進(jìn)脂肪酸氧化和提高線粒體功能，從而抑制肥胖的發(fā)生。

姜黃素； 肥胖； FOXO1

近年來肥胖者日漸增多，且肥胖通常伴發(fā)多種代謝綜合征，如2型糖尿病、胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝和心血管疾病等，因此肥胖及其伴發(fā)的代謝綜合征已成為全球科研工作者研究的焦點(diǎn)[1]。姜黃素是從姜黃中提取的一種主要活性物質(zhì)，長期被廣泛當(dāng)作食用調(diào)味品和色素添加到咖喱、馬鈴薯片等食物中。國內(nèi)外研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑制脂肪沉積、降血糖和降血脂等作用，且姜黃素具有低毒副作用和低不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[2,3]。此外，姜黃素還可以通過調(diào)節(jié)肝臟和脂肪組織中脂肪代謝相關(guān)酶來減少機(jī)體脂肪沉積[4]。但是，目前關(guān)于姜黃素如何緩解高脂飲食導(dǎo)致肥胖的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過利用高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肥胖來研究姜黃素對肝臟脂肪代謝和線粒體功能的影響，進(jìn)一步探討姜黃素的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料 SPF（specific pathogen Free）級8周齡C57BL/6雄性小鼠24只購自上海思萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。姜黃素購自美國Sigma公司；小鼠高脂日糧購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司；小鼠實(shí)驗(yàn)用引物利用primer 5軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 8周齡小鼠（22 g左右）飼喂1周（作為適應(yīng)期）后，隨機(jī)分為3組：飼喂低脂日糧（對照組），飼喂高脂日糧灌胃生理鹽水（模型組），飼喂高脂日糧并以姜黃素200 mg/kg灌胃。小鼠自由采食和飲水，室內(nèi)溫度維持在（22±1）℃，光照時(shí)間為8：00-20：00。

1.3 實(shí)驗(yàn)采樣 每隔兩天記錄小鼠采食量，每個(gè)星期記錄小鼠體重，試驗(yàn)期為8周。試驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算小鼠每日平均采食量和實(shí)驗(yàn)期總增重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠禁食4 h后斷頸處死，開腹腔采肝臟樣品，預(yù)冷的生理鹽水洗凈后迅速放入液氮凍存，后轉(zhuǎn)入-80℃保存用于后續(xù)分析。

1.4 熒光定量分析 肝臟組織液氮研磨后，加入Trizol等試劑提取組織RNA；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明獲得cDNA；利用primer 5設(shè)計(jì)需檢測目的基因的引物，引物序列見表1。熒光定量分析采用10μl體系：5 μl SYBR Green mix，0.2 μl Rox，3 μl去離子H2O及上下游引物各0.4μmol/L。反應(yīng)條件為：95℃ 變性10 s；擴(kuò)增和定量，40循環(huán)（95℃5 s，60℃ 20 s）?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量計(jì)算方法利用2-ΔΔCt公式，ΔΔCt=（Ct目的基因－CtGAPDH）處理組－Ct目的基因－CtGAPDH）對照組。

1.5 Western bloting分析 肝臟組織液氮研磨后，加入按凱基試劑盒說明配制的裂解液，冰上放置15 min后，4 ℃、13 000×g條件下離心 10 min，取上清，根據(jù)BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。蛋白在SDS-PAGE膠上電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜后，TBST清洗3次，二抗室溫孵育2 h后，加EZECL后拍照獲得蛋白條帶。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié)果

表2 姜黃素對高脂飼喂小鼠采食量和體重的影響（±s）

表2 姜黃素對高脂飼喂小鼠采食量和體重的影響（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05

組別 例數(shù) 初重（g） 末重（g） 采食量（kJ/d） 肝臟重量（g） 附睪脂肪（mg）對照組 8 23.2±0.6 24.5±1.4 52.1±3.8 0.93±0.22 219±47模型組 8 23.3±0.4 28.9±1.2a59.9±4.4a1.45±0.16a807±53a姜黃素組 8 22.7±0.6 24.9±0.8 60.7±3.5a1.07±0.12 315±69

2.1 姜黃素對采食量、體重、肝臟和脂肪重量的影響 模型組和姜黃素組采食量顯著高于對照組（P<0.05）；與對照組相比，模型組小鼠體重顯著增加（P<0.05），而姜黃素組小鼠無顯著變化（P>0.05）；與對照組相比，模型組小鼠肝臟和附睪脂肪組織重量顯著增加（P<0.05），而姜黃素組小鼠無顯著變化（P>0.05）。見表2。

2.2 姜黃素對肝臟脂肪代謝和線粒體功能基因表達(dá)的影響 與對照組相比，模型組小鼠肝臟中棕櫚?；D(zhuǎn)移酶（carnitinepalmitoyltransferase 1A，cpt1）和酰基輔酶A脫氫酶（acyl-Coenzyme A dehydrogenase，acadm） 基因表達(dá)顯著降低（P<0.05），而姜黃素組小鼠上述酶基因表達(dá)顯著升高（P<0.05）；模型組小鼠乙酰CoA羧化酶（acetylcoA carboxylase，acc）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，fas）表達(dá)顯著升高（P<0.05），而姜黃素組小鼠上述酶基因表達(dá)顯著降低（P<0.05）；模型組小鼠肝臟中過氧化物酶增值體激活受體γ輔激動子 1α （peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha，pgc1α） 基因表達(dá)顯著降低（P<0.05），而姜黃素組小鼠pgc1α基因表達(dá)顯著升高（P<0.05）。見表 3。

2.3 姜黃素對肝臟和脂肪組織中FOXO1蛋白表達(dá)的影響與對照組相比，模型組小鼠肝臟和脂肪組織中叉頭蛋白O1（FOXO1）表達(dá)顯著升高（P<0.05），而姜黃素組小鼠FOXO1蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。見表 4。

表3 姜黃素對肝臟脂肪代謝和線粒體功能基因表達(dá)的影響（±s）

表3 姜黃素對肝臟脂肪代謝和線粒體功能基因表達(dá)的影響（±s）

注：cpt1：棕櫚?；D(zhuǎn)移酶；acadm：?；o酶A脫氫酶；acc：乙酰CoA羧化酶；fas：脂肪酸合成酶；pgc1α：過氧化物酶增值體激活受體γ輔激動子1α。與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

組別 例數(shù) cpt1 acadm acc fas pgc1α對照組 8 1.00±0.13 1.00±0.09 1.00±0.11 1.00±0.13 1.00±0.14模型組 8 0.34±0.08a0.23±0.11a2.03±0.17a2.33±0.19a0.36±0.11a姜黃素組83.57±0.32ab4.26±0.41ab0.36±0.05ab0.27±0.04ab2.67±0.36ab

表4 姜黃素對肝臟中FOXO1蛋白表達(dá)的影響（±s）

表4 姜黃素對肝臟中FOXO1蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：表中數(shù)值為蛋白條帶的相對光密度值。FOXO1：叉頭蛋白O1。與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

組別 例數(shù) FOXO1（肝臟） FOXO1（脂肪）對照組 8 1.00±0.16 1.00±0.05模型組 8 4.69±0.47a2.17±0.40a姜黃素組 8 0.77±0.14ab0.85±0.13ab

3 討論

國內(nèi)外研究表明，姜黃素可顯著抑制肥胖發(fā)生，并緩解2型糖尿病的多種癥狀。姜黃素可提高高脂日糧誘導(dǎo)小鼠的葡萄糖耐受性以及緩解氧化應(yīng)激[5]。姜黃素還可通過降低肝臟脂肪合成以及脂肪組織炎癥來改善高脂誘導(dǎo)引起的胰島素抵抗[4]。此外，姜黃素可顯著降低脂肪在肝臟和脂肪組織中的沉積[6]，而這一作用可能是通過抑制脂肪合成和脂肪細(xì)胞分化來實(shí)現(xiàn)的[7-9]。但是，目前關(guān)于姜黃素對肝臟和脂肪組織中脂肪酸氧化尤其是線粒體功能的影響報(bào)道相對較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂誘導(dǎo)后小鼠肝臟中脂肪酸合成相關(guān)acc和fas表達(dá)顯著升高，而脂肪酸氧化相關(guān)酶cpt1和acdam表達(dá)顯著降低；此外，線粒體功能相關(guān)基因cytc、nrf1、pgc1α和UCP2等表達(dá)顯著降低。這些結(jié)果表明，高脂飼喂小鼠肝臟脂肪生成增加且線粒體功能降低。實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素可能通過促進(jìn)肝臟脂肪酸氧化和提高線粒體功能來發(fā)揮降低脂肪沉積的作用。

叉頭蛋白O1（FOXO1）可通過影響基因表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和代謝等。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1一方面可通過影響脂肪合成基因來調(diào)節(jié)肝臟脂肪代謝[10]，另一方面可通過影響脂肪組織中ucp2和pgc1α等基因表達(dá)來調(diào)節(jié)能量的儲存和消耗[11]。此外，還有報(bào)道稱抑制FOXO1可以通過提高線粒體功能，從而發(fā)揮改善肥胖和胰島素抵抗等代謝綜合征發(fā)生時(shí)肝臟的脂肪代謝[12]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼喂小鼠添加姜黃素后肝臟中FOXO1蛋白表達(dá)均降低，表明姜黃素可能通過抑制FOXO1途徑來抑制肥胖的發(fā)生。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明了姜黃素緩解高脂誘導(dǎo)肥胖的作用機(jī)制，即姜黃素通過抑制FOXO1途經(jīng)，進(jìn)而促進(jìn)肝臟中脂肪酸氧化和提高線粒體功能。

［1］ Weisberg SP， Leibel R， Tortoriello DV.Dietary curcumin significantly improves obesity associated inflammation and diabetes in mouse models of diabesity.Endocrinology，2008，149：3549-3558.

［2］邵琳琳，戴雅玥，馮文煥，等.姜黃素治療代謝綜合征的研究進(jìn)展.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13：3988-3992.

［3］鄭佳，聞穎.姜黃素與炎癥誘導(dǎo)的肥胖、糖尿病關(guān)系的研究進(jìn)展.預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2013，29：804-807.

［4］Shao W，Yu Z，Chiang Y，et al.Curcumin prevents high fat diet induced insulin resistance and obesity via attenuating lipogenesis in liver and inflammatory pathway in adipocytes.PLoS One，2012，7：e28784.

［5］He HJ，Wang GY，Gao Y，et al.Curcumin attenuates Nrf2 signaling defect，oxidative stress in muscle and glucose intolerance in high fat diet-fed mice.World J Diabetes，2012，3：94-104.

［6］Asai A，Miyazawa T.Dietary curcuminoids prevent high-fat dietinduced lipid accumulation in rat liver and epididymal adipose tissue.J Nutr，2001，131：2932-2935.

［7］Ejaz A，Wu D，Kwan P，et al.Curcumin inhibits adipogenesisin 3T3-L1 adipocytes and angiogenesis and obesity in C57/BL mice.J Nutr，2009，139：919-925.

［8］聞穎，孫長顥，劉榮.姜黃素對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖分化的影響.中國臨床康復(fù)，2006，10：117-119.

［9］秦培潔，張東偉，莫芳芳，等.姜黃素對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖分化的影響及機(jī)制研究.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，38：272-274.

［10］Zhang W，Patil S，Chauhan B，et al.FoxO1 regulates multiple metabolic pathways in the liver:effects on gluconeogenic，glycolytic， and lipogenic gene expression.J BiolChem，2006，281：10105-10117.

［11］Nakae J，Cao Y，Oki M，et al.Forkhead transcription factor FoxO1 in adipose tissue regulates energy storage and expenditure.Diabetes，2008，57：563-576.

［12］Cheng Z，Guo S，Copps K，et al.Foxo1 integrates insulin signaling with mitochondrial function in the liver.Nat Med，2009，15：1307-1311.

The mechanism of the curcumin relieving high-fat diet-induced obesity in mice

GUO Ya-wei，WANG Chang-yuan，SUN Chang-yi，et al.Department of Emergency，Xuanwu Hospital Capital Medical University，Beijing 100053，China

Objective The present study was conducted to investigate the effects of curcumin on high-fat induced obesity and its related mechanism.Methods 24 male C57BL/6 mice at 9 weeks old were randomly assigned to three treatments:mice fed low-fat diet（Control group），mice fed high-fat diet（Model group），and mice fed high-fat diet and supplemented with curcumin（Curcumin group）.The experiment lasted for 8 weeks.Results The results showed that when compared with micefedhigh-fat，weight gain，liver and epididymal fat weight in mice fed curcumin significantly decreased by 13.8%，26.2%and 61%（P<0.05）.Compared with mice fed high-fat，expression of mitochondrial genes［peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha（pgc1α） and fatty acid oxidation related genes（carnitinepalmitoyltransferase 1A（cpt1a） and acyl-Coenzyme A dehydrogenase（acadm）］were significantly increased by 642%，950%and 1752%（P<0.05），while forkhead box protein O1（FOXO1）was significantly decreased by 83.6%（P<0.05）.Conclusion Our results suggested that curcumin may attenuate high-fat induced obesity through decreasing lipogenesis and improving mitochondrial function via FOXO1 pathway in liver.

Curcumin； High-fat； FOXO1

CAO Tao，E-mail：taocao88@sina.com

100053 北京市，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院急診科

曹濤，E-mail：taocao88@sina.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．07．020

Q95-33；R54

A

1672-5301（2016）07-0651-04

2016-04-28）