李升星，陳家林，張?zhí)R 笑，劉小珍，張漢堯

(1.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

基于ITS序列分析的部分榕屬植物系統(tǒng)樹構(gòu)建

李升星1，陳家林2，張?zhí)?，賀 笑2，劉小珍1，張漢堯1

(1.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

以榕屬中黃金榕、橡皮樹、小葉榕3個(gè)樹種為研究對(duì)象，以其葉片為試材提取基因組DNA，進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，在NCBI上選取同源率較高的27個(gè)樹種的ITS序列與其進(jìn)行同源比較，并建立系統(tǒng)樹分析它們之間的親緣進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明：30種榕屬植物基于ITS序列分析與傳統(tǒng)分類學(xué)略有差異，通過結(jié)合ITS鑒定與形態(tài)分類相結(jié)合可以為以后榕屬的分類提供借鑒。

榕屬；ITS序列分析；系統(tǒng)樹構(gòu)建

榕屬(FicusLinn.)隸屬?？?，常綠、稀落葉，喬木或灌木，有時(shí)匍匐或攀援狀，在生態(tài)圈中，是包含喬木、灌木和藤本的形態(tài)變化較大的一屬。本屬約1000種，主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。我國(guó)約98種3亞種43變種2變型，廣泛分布于西南部至東部。榕屬植物為低維護(hù)性景觀植物，韌皮纖維可作麻類代用品，其中有些種類的榕果可藥用或食用，在諸多醫(yī)學(xué)著作中均有記載，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。榕屬植物在文化方面或是實(shí)用性上有相當(dāng)關(guān)聯(lián)，根據(jù)相關(guān)資料顯示榕屬植物并沒有很明確的化石留存，然而現(xiàn)存的主要樹種的輻射適應(yīng)已經(jīng)發(fā)生在最近的20～40萬(wàn)a。根據(jù)榕屬植物的生活習(xí)性、繁殖系統(tǒng)、花序果的著生位置將其分為4個(gè)亞屬，制定了早期的榕屬分類系統(tǒng)。由于該屬植物具有形態(tài)特征變異幅度大，種間界限難以界定的特點(diǎn)導(dǎo)致該屬植物分類比較困難，如無花果為隱頭花序，難以觀察其花器官，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于該屬植物系統(tǒng)進(jìn)化方面的報(bào)道尚少[1-4]。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(Internal Transcribed Spacer)由保守的18S、5.8S 和28S 基因編碼區(qū)以及非編碼的各種間隔區(qū)組成。ITS 片段在絕大多數(shù)真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，因此在ITS 序列上即使是親緣關(guān)系非常接近的2 個(gè)種也能表現(xiàn)出較為明顯的差異，顯示出最近的進(jìn)化特征。由于ITS區(qū)具有較豐富的信息位點(diǎn)和變異位點(diǎn)，目前已有文獻(xiàn)證實(shí)ITS是研究許多被子植物類群系統(tǒng)與進(jìn)化的重要分子標(biāo)記，例如ITS序列分析對(duì)竹種進(jìn)行系統(tǒng)分類的研究及對(duì)各種中藥材植物的鑒定等[5-6]。由于ITS能較好地反映出科內(nèi)、屬間、種間的親緣關(guān)系，所以被廣泛應(yīng)用于植物的系統(tǒng)演化及親緣關(guān)系的研究[7-17]。

本研究以云南省昆明市內(nèi)3種不同榕屬樹種為試材，通過提取DNA，選取ITS-PCR產(chǎn)物直接測(cè)序方法獲得其序列，從NCBI上下載同源率較高的序列，并利用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)榕屬植物進(jìn)行分析，從分子水平上對(duì)榕屬植物進(jìn)行系統(tǒng)分類，以期對(duì)該屬植物的系統(tǒng)分化和系統(tǒng)分類提供依據(jù)，為種質(zhì)資源的利用和對(duì)其遺傳改良工作提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 榕屬植物材料

以昆明市金色俊園小區(qū)的3種榕屬植物黃金榕(F.microcarpacv.GoldenLeaves)、橡皮樹(F.elastica)、小葉榕(F.concinna)新鮮葉片為試驗(yàn)材料。

1.2 葉片DNA提取

將采集的葉片在硅膠中干燥7 d后，用振蕩機(jī)振蕩成粉末狀，用BioTeKe 新型快速植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，并對(duì)提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 ITS序列擴(kuò)增及測(cè)序

根據(jù)GenBank中榕屬的ITS基因序列選取ITS2和4組合特異性引物擴(kuò)增樣品ITS基因，上游引物ITS2的序列為：5’—AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG—3’，下游引物ITS4的序列為：5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3’。以10個(gè)樹種的DNA為模板，采用25 μL反應(yīng)體系即1 μL DNA模板、1 μL ITS2、1 μL ITS4、12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix和9.5 μL dd H2O，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸5 min；產(chǎn)物于4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物和1 μL上樣緩沖液混勻后于1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用凝膠成像儀拍照[7]。剩余的PCR產(chǎn)物(約)20 μL委托昆明碩陽(yáng)科技有限公司，采用雙向測(cè)序方法進(jìn)行測(cè)序。

1.4 ITS序列分析及形態(tài)標(biāo)記聚類分析

將測(cè)序得到的榕屬3個(gè)樹種的ITS序列用ContigExpress軟件進(jìn)行拼接后，提交NCBI公用數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank，利用NCBI軟件的BLAST進(jìn)行網(wǎng)上對(duì)比。對(duì)所測(cè)得的3個(gè)樹種和從GenBank得到的樹種用系統(tǒng)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析軟件MEGA 5進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。對(duì)建樹的30種榕樹植物的葉形、葉質(zhì)、果形、果實(shí)著生方式通過查閱文獻(xiàn)[18]進(jìn)行記錄并作為聚類指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

以榕屬10種植物的葉片為材料，使用試劑盒提取的DNA，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示所提取的DNA質(zhì)量較高，條帶單一且無拖帶現(xiàn)象。

2.2 ITS-PCR擴(kuò)增結(jié)果

以榕屬3種植物的基因組DNA為模版，使用引物ITS1與ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果(圖1)顯示使用該引物擴(kuò)增效果較好，可以得到穩(wěn)定的條帶。根據(jù)電泳結(jié)果可知，擴(kuò)增出來的DNA片段的長(zhǎng)度約為700 bp。

2.3 ITS序列分析

將擴(kuò)增獲得的榕屬3種植物的ITS序列與GenBank的ITS序列進(jìn)行比對(duì)找到與樣本同源種的ITS序列27個(gè)，其所對(duì)應(yīng)的GenBank序列登記號(hào)、長(zhǎng)度和G+C含量見表1。供試榕屬3種植物擴(kuò)增獲得的ITS序列全長(zhǎng)位于757～782 bp之間，通過在GenBank對(duì)比找到的27種序列，ITS序列全長(zhǎng)均在684～804 bp之間。

每個(gè)樹種DNA中G+C含量的數(shù)值是恒定的，不會(huì)因外界環(huán)境條件的改變而發(fā)生變化，且在同屬不同種間，G+C含量的數(shù)值也不會(huì)有很大差異。由表1可知，供試榕屬3種植物的ITS序列中，黃金榕、橡樹G+C含量均為62%，小葉榕G+C含量為63%，平均G+C含量為62.3%；在全部53種榕屬植物中，整體G+C含量在61%～66%范圍內(nèi)，整體平均G+C含量為62.9%，因此整體含量差異不明顯，適于作遺傳分析。

表1 榕屬植物的GenBank序列登記號(hào)、ITS序列長(zhǎng)度、G+C含量

2.4 系統(tǒng)發(fā)育與形態(tài)標(biāo)記聚類分析

將供試的榕屬10種植物與在GenBank中同源搜索獲得的43個(gè)近緣種的ITS序列，用MEGA 5.05進(jìn)行完全比對(duì)，再采用鄰接距離矩陣法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行形態(tài)標(biāo)記聚類分析(圖2)。選用Kimura2-parameter 參數(shù)模型，計(jì)算所得的遺傳距離(由于圖表過大，在此只統(tǒng)計(jì)遺傳距離數(shù)據(jù))。

由榕屬30種植物的系統(tǒng)樹及形態(tài)標(biāo)記熱圖可以看出：榕屬的30個(gè)種以100%的支持率被分為2大支。其中供試的3種榕屬植物全部聚在一支上，而聚類分析色塊圖也與所建的系統(tǒng)發(fā)育樹大部分相吻合。該結(jié)果與傳統(tǒng)分類基本相符，但并不完全一致。如：小葉榕與巖木瓜、綠黃葛樹、筆管榕、菩提樹、龍州榕同為榕亞屬下榕組，但從圖中可以看出：小葉榕與其他幾種不聚在一支上，系統(tǒng)發(fā)育樹和聚類圖表明小葉榕與這幾種榕屬植物關(guān)系較遠(yuǎn)。而聚在一大支上的巖木瓜、綠黃葛樹、筆管榕、菩提樹、龍州榕理應(yīng)聚在一小支上，但是巖木瓜單獨(dú)與無花果亞屬的竹葉榕、壺托榕、異葉榕及平塘榕聚為一小支上，從系統(tǒng)發(fā)育樹上看巖木瓜應(yīng)歸為無花果亞屬。

榕屬中30個(gè)種的遺傳距離在0.01～0.08之間，絕大多數(shù)的遺傳距離<0.6，表明30個(gè)榕屬植物的親緣關(guān)系較近。其中小葉榕與黃金榕、勁直榕的遺傳距離分別是0.005、0.003，表明小葉榕與這2種榕樹的親緣關(guān)系非常近。

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)分類學(xué)上主要以花果為特征進(jìn)行分類，榕屬植物現(xiàn)有的分類系統(tǒng)亦然，但由于榕屬植物為隱頭花序，雌雄同株或異株，繁殖器官材料難觀察，在分類中困難重重，其中存在爭(zhēng)議問題頗多。榕屬植物復(fù)雜多樣的變異通過傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)很難揭示榕屬性狀的演化特點(diǎn)，單就葉的形狀而言，就有橢圓形、長(zhǎng)圓形、卵形、心形等，如果過分的依賴某一個(gè)或幾個(gè)形態(tài)標(biāo)記進(jìn)行分類，可能會(huì)出現(xiàn)誤差，準(zhǔn)確性和可靠性不高。本文通過ITS序列分析的方法可以為榕屬的分類提供很好的借鑒。從構(gòu)建的系統(tǒng)樹與形態(tài)標(biāo)記熱圖聯(lián)合來看，雖然與傳統(tǒng)分類大體一致但也出現(xiàn)了一些不相符之處，如小葉榕屬于榕屬榕組，但是它與榕屬環(huán)紋榕組的黃金榕、勁直榕親緣關(guān)系非常近。原因可能是傳統(tǒng)分類學(xué)上過分突出某一個(gè)形態(tài)特征。

植物學(xué)家們一直在努力尋找從多學(xué)科手段上可用于系統(tǒng)分類的證據(jù)。近年來，ITS序列分析已廣泛應(yīng)用于植物科、亞科、族、屬和種間系統(tǒng)學(xué)研究[19—22]，但在不同的分類等級(jí)上，ITS序列所具有的價(jià)值是不一樣的。對(duì)大多數(shù)被子植物來說，ITS序列具有十分明顯的同步進(jìn)化，其眾多拷貝已變得高度相似或一致化，因此在一定程度上克服了非同源的障礙，另外在許多類群內(nèi)ITS序列的替代速率是基本穩(wěn)定的[23]。這樣通過ITS構(gòu)建的系統(tǒng)分支樹就能夠反映植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。陳紀(jì)云[24]針對(duì)榕屬植物63種，228個(gè)樣本，基于5個(gè)葉綠體基因片段和1個(gè)核基因片段(ITS)，計(jì)算了遺傳距離并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹來檢驗(yàn)所選取基因片段對(duì)樹種鑒定的能力，王雙[25]利用MP、ML和BI 3種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)田婕[26]2006年從ITS序列矩陣的 MP和Bayesian分析結(jié)果來看，ITS在榕屬系統(tǒng)發(fā)育學(xué)中的適用性基本得到了肯定。Weiblen[27]2000年就使用ITS作為研究?？崎艑僦参锏姆肿訕?biāo)記應(yīng)用到榕屬植物的系統(tǒng)學(xué)研究中，對(duì)Corner的系統(tǒng)提出了質(zhì)疑，并證明對(duì)于榕屬這樣一個(gè)廣泛分布于世界各地的大類群，是比較合適使用ITS 作為研究其整個(gè)類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分子標(biāo)記。

本研究表明，供試的3個(gè)榕屬樹種(黃金榕、橡皮樹、小葉榕)及同屬27個(gè)樹種ITS序列分析與傳統(tǒng)分類學(xué)略有差異，通過這種差異可以更好地對(duì)榕屬系統(tǒng)分類提供一種可行的分類方法借鑒。筆者認(rèn)為在對(duì)榕屬植物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究時(shí)，可以結(jié)合傳統(tǒng)分類和ITS提供的信息對(duì)榕屬植物系統(tǒng)進(jìn)化做更為精確劃分，能使我們對(duì)榕屬系統(tǒng)進(jìn)化的認(rèn)識(shí)又向前跨了一步，為榕屬植物的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究提供參考。

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Construction of Phylogenetic Tree Based on ITS Sequence Analysis of someFicusSpecies

LI Sheng-xing1，CHEN Jia-lin2，ZHANG Tai-kui2，HE Xiao2，LIU Xiao-zhen1，ZHANG Han-yao1

(1.KeyLaboratoryforForestGeneticandTreeImprovement&PropagationinUniversitiesofYunnanProvince，SouthwestForestryUniversity，Kunming650224，Yunnan，China；2.KeyLaboratoryofBiodiversityConservationinSouthwestChina，StateForestAdministration，SouthwestForestryUniversity，Kunming650224，Yunnan，China)

Using the leaves ofFicusmicrocarpa，F(xiàn).elastic，F(xiàn).concinna，F(xiàn) for ITS-PCR amplification，and then sequencing analysis was carried on.The ITS sequences (27 ITS sequences which had high scores with homology comparison were downloaded from NCBI) was used to build a phylogenetic tree to analyze their genetic evolutionary relationships.Resμlts showed that：It is different between based on ITS sequence analysis and traditional taxonomy，By combining the ITS identification and morphological classification can provide a reference for future classification ofFicus.

Ficus；ITS sequence analysis；Phylogenetic tree

2015-06-02；

2015-09-01

國(guó)家林業(yè)局948項(xiàng)目(2012-4-62)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360404)

李升星(1989—)，女，江西宜春人，西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在讀碩士研究生，從事林業(yè)生物技術(shù)研究。E-mail：shengxing_555@126.com。

張漢堯(1975—)，男，福建永定人，西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事植物和微生物分子遺傳研究。E-mail：hanyaoz@163.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.01.002

Q949

A

1002-7351(2016)01-0009-05