鐘雅婷，羅 輯，蔣學(xué)建，黃華艷

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院、廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，廣西 南寧 530002)

油桐尺蛾中腸上皮細胞的原代培養(yǎng)

鐘雅婷，羅 輯，蔣學(xué)建，黃華艷

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院、廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，廣西 南寧 530002)

為建立可供油桐尺蛾基礎(chǔ)生物學(xué)研究的油桐尺蛾中腸上皮原代細胞系，采用組織塊法、胰酶消化法和機械分散法分別對油桐尺蛾中腸上皮組織細胞進行體外培養(yǎng)。結(jié)果表明：組織塊法培養(yǎng)效果最佳，細胞貼壁較好且生長旺盛。細胞移入培養(yǎng)瓶72 h可觀察到細胞從組織塊中遷移出來，呈細長梭形，隨后數(shù)量增多形成網(wǎng)狀集落，可維持良好的生長狀態(tài)達60 d。說明油桐尺蛾中腸上皮原代細胞的最佳培養(yǎng)方法為組織塊法。

油桐尺蛾；原代細胞培養(yǎng)；組織塊法；中腸上皮細胞

隨著昆蟲細胞培養(yǎng)技術(shù)的飛速發(fā)展以及分子生物學(xué)、基因工程學(xué)研究的不斷深入，昆蟲細胞系越來越廣泛地應(yīng)用于細胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)以及細胞工程學(xué)等多個領(lǐng)域。鱗翅目昆蟲如暴發(fā)成災(zāi)在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中可產(chǎn)生較大危害，因此建立鱗翅目昆蟲細胞系能夠為體外進行體細胞遺傳、昆蟲抗性機制研究等提供可靠的實驗細胞模型，還可通過對昆蟲病毒在昆蟲細胞內(nèi)的感染和復(fù)制機制進行研究，從而探索殺滅害蟲的新途徑。

油桐尺蛾又名油桐尺蠖(Buzurasuppressaria)，屬鱗翅目(Lepidoptera)尺蛾科(Geometridae)的一種食葉性害蟲，廣泛分布于我國湖南、江西、安徽、浙江、福建、廣東、廣西、四川、貴州以及海南等地，是油桐、茶樹、柑桔以及桉樹等經(jīng)濟林木的主要害蟲[1-3]。目前，已成功建立了多種鱗翅目昆蟲細胞系，但對油桐尺蛾細胞培養(yǎng)系的研究還相對較少。為了建立可供油桐尺蛾基礎(chǔ)生物學(xué)研究的油桐尺蛾組織原代細胞系，本研究開展了油桐尺蛾中腸上皮細胞原代培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)條件的選擇試驗，初步建立適合油桐尺蛾中腸上皮細胞的原代培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

1.1.1 材料來源 油桐尺蛾6齡期幼蟲為本實驗室采用人工室內(nèi)孵化飼養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 Grace′s昆蟲細胞培養(yǎng)基和胎牛血清均購自gibco公司；試驗其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 油桐尺蛾中腸上皮組織材料的獲取

將油桐尺蛾6齡期幼蟲浸泡于裝有2%次氯酸鈉溶液的滅菌器皿內(nèi)10～15 min，再用75%乙醇溶液浸泡消毒15～20 min，用滅菌水洗滌2～3次，之后將蟲體置于無菌濾紙上吸干其表面水分。在無菌操作臺上用已消毒的眼科剪和鑷子將幼蟲的腸道取出并清除其內(nèi)容物、圍食膜以及黏連的脂肪組織等，將腸道轉(zhuǎn)移至無血清Grace′s昆蟲細胞培養(yǎng)液中，洗滌3次，備用。

1.3 中腸上皮組織原代細胞培養(yǎng)

1.3.1 組織塊法 將腸道組織用無血清Grace′s昆蟲細胞培養(yǎng)液洗滌2～3次后縱向剪開并平展于培養(yǎng)皿中，用已消毒的眼科剪將其剪成面積約為5 mm×5 mm大小的腸道植塊。將植塊的內(nèi)膜面朝下平貼于細胞培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面上，之后將細胞瓶放入28 ℃細胞培養(yǎng)箱中靜置1.5～2 h(干貼壁)，隨后向其中加入含有15%滅活標準胎牛血清和青鏈霉素混合液(青霉素100 U·mL-1，鏈霉素0.1 mg·mL-1)以及2.5 μg·mL-1兩性霉素B的Grace′s昆蟲細胞培養(yǎng)液。將細胞培養(yǎng)瓶置于28 ℃細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天對細胞的生長情況進行觀察，于接種7 d后更換培養(yǎng)液，之后視細胞生長情況進行處理。

1.3.2 胰酶消化法 將腸道組織用無血清Grace′s昆蟲細胞培養(yǎng)液洗滌2～3次后，用已消毒的眼科剪將之剪碎成大小為1.0 mm3大小的組織塊，放入裝有5倍體積0.25%胰蛋白酶的平皿中進行消化；于37 ℃消化1 h后將消化的細胞懸液連同組織塊一起收集于離心管中，1000 r·min-1離心10 min并棄掉上清液，向其中加入Grace′s昆蟲細胞培養(yǎng)液后用吸管溫柔吹打分散細胞，之后按1×106個·mL-1細胞密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中；向培養(yǎng)瓶中加入含有15%滅活標準胎牛血清和100 U·mL-1青、鏈霉素以及2.5 μg·mL-1兩性霉素B的Grace′s昆蟲細胞培養(yǎng)液。隨后操作同1.3.1。

1.3.3 機械分散法 將處理好的腸道組織剪碎成0.5～1 mm3大小的組織塊，向其中加入Grace′s昆蟲細胞培養(yǎng)液并用滅菌吸管溫和抽吸吹打，之后直接將懸液連同組織塊一起接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入含15%滅活標準胎牛血清和100 U·mL-1青、鏈霉素及2.5 μg·mL-1兩性霉素B的Grace′s昆蟲細胞培養(yǎng)液。隨后操作同1.3.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 油桐尺蛾中腸上皮原代細胞生長特點

在倒置顯微鏡下觀察剛接種的油桐尺蛾腸道組織細胞懸液，可見游離的細胞懸浮其中，形態(tài)以較規(guī)則的圓形和橢圓形為主，未消化完全的組織塊則沉于瓶底；培養(yǎng)72 h后，大多數(shù)細胞貼壁，其內(nèi)充滿顆粒樣物質(zhì)(圖1)；5～10 d時可觀察到貼壁的細胞明顯拉伸，形狀不規(guī)則，且一端伸展呈絲狀，細胞核較大，為長橢圓形(圖2)；15～20 d后觀察到細胞開始逐漸集聚、融合，游離的細胞減少，細胞與細胞間的絲狀拉伸相互連接，從而使細胞質(zhì)相互溝通，最后形成一個細胞質(zhì)均一的組織塊(圖3)，這種組織塊通常易在細胞生長密集區(qū)域形成，而在細胞稀疏的地方則形成較晚或不形成；培養(yǎng)40 d后細胞顏色逐漸由透明變暗，聚集拉伸不顯著，出現(xiàn)老化現(xiàn)象，新生細胞未見增多，部分細胞發(fā)生萎縮，細胞內(nèi)顆粒物質(zhì)較多(圖4)；培養(yǎng)60 d后觀察到部分細胞老化變圓，邊緣發(fā)黑，細胞核萎縮呈圓形，最終細胞發(fā)生脫落，另一部分貼壁細胞則生長呈花瓣狀，最后發(fā)生崩解(圖5)。

圖1 培養(yǎng)72h(20×)圖2 培養(yǎng)5～10d(20×)圖3 培養(yǎng)15～20d(40×)圖4 培養(yǎng)40d(40×)

2.2 不同培養(yǎng)方法比較

本研究分別采用了組織塊法、胰酶消化法及機械分散法對油桐尺蛾中腸上皮細胞進行培養(yǎng)。其中，組織塊法培養(yǎng)72 h左右可見部分細胞沿組織塊邊緣爬出，呈纖細的長梭形，隨后數(shù)量逐漸增多并緩慢向外擴張形成網(wǎng)狀集落，細胞貼壁較牢，生長狀況較好；胰酶消化法能獲得大量的懸浮細胞，多數(shù)細胞呈圓形或橢圓形，大小不一，但較難貼壁或貼壁不牢，培養(yǎng)14 d后仍可見大量游離細胞存在；機械分散法可觀察到培養(yǎng)液中有大量組織塊及少量懸浮細胞存在，培養(yǎng)3～4 d后可見少量細胞從組織塊邊緣探出，但由于組織塊不貼壁或少量貼壁，因此細胞生長緩慢且貼壁不牢。

3 結(jié)論與討論

本研究采用組織塊法、胰酶消化法和機械分散法分別對油桐尺蛾中腸上皮細胞進行體外培養(yǎng)實驗，結(jié)果表明組織塊法的培養(yǎng)效果最好，為下一步進行油桐尺蛾中腸上皮細胞分化，最終篩選出穩(wěn)定傳代的細胞系奠定基礎(chǔ)。

自Grace[4]于1962年建立桉蠶蛾(Antheraeaeucalypti)細胞系至今，研究者們已先后建立了500多株昆蟲細胞系。昆蟲細胞系在昆蟲生理生化研究、生物反應(yīng)器及其表達基因產(chǎn)物的探索方面發(fā)揮了重要作用，作為一種研究工具越來越多地應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)以及生物學(xué)等領(lǐng)域[5-6]。這些已建立的昆蟲細胞系大部分源自于雙翅目和鱗翅目昆蟲，主要為昆蟲的胚胎、卵巢、精巢、初孵的幼蟲、血液以及脂肪體等組織和器官，而其中又以卵巢和胚胎組織多見。目前已建立的油桐尺蛾細胞系為血球細胞系(WIV-BS-02)[7]以及成蟲卵巢細胞系(Bs484)[8]，但目前還尚未有油桐尺蛾中腸上皮細胞進行原代培養(yǎng)的報道。為建立可供油桐尺蛾基礎(chǔ)生物學(xué)研究的原代細胞系，本研究進行油桐尺蛾中腸上皮組織細胞的培養(yǎng)，初步建立適合油桐尺蛾中腸上皮組織原代細胞培養(yǎng)的技術(shù)方法。

中腸上皮細胞的分離，通常采用貼壁組織塊或細胞在細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中離體培養(yǎng)的方法。細胞在貼附和伸展因子的誘導(dǎo)下附著于細胞培養(yǎng)面，由層粘連蛋白與膠原家族分子共同作用促進其生長和分化[9]。組織塊培養(yǎng)法在培養(yǎng)昆蟲其他組織(如脂肪體和卵巢組織)均取得了很好的效果[10]。張欣[11]運用組織塊培養(yǎng)的方法成功將來源于黃粉蟲的脂肪體細胞以及喙尾琵琶甲的精巢細胞培養(yǎng)成有限細胞系，最長存活超過20個月。Zhang等通過組織塊法分別對棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)和甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)脂肪體細胞進行培養(yǎng)，成功建立了IOZCAS-Ha-I[12]以及IOZCAS-Spex-II、IOZCAS-Spex-III細胞系[13]。Shao等[14]采用組織塊法成功建立了棉鈴蟲表皮細胞系HaEpi。劉淑珊等[15]通過對柞蠶卵巢細胞進行原代培養(yǎng)，認為組織塊培養(yǎng)法較懸浮細胞培養(yǎng)法效果更好。本研究亦采用組織貼塊法對油桐尺蛾中腸上皮細胞進行分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細胞較易貼壁生長，最終獲得了良好的原代培養(yǎng)細胞，但由于組織塊體積較大，因此需要很長一段時間來等待細胞從組織塊中遷移出來。有研究認為盡管采用上述2種方法易獲得均一的單層細胞懸液，但用胰蛋白酶以及EDTA等對昆蟲組織進行解離可能會造成其受到損傷[16]，而機械分散法則可能使組織在處理過程中由于研磨過度而發(fā)生細胞破碎，形成較多雜質(zhì)。但同時亦有報道表明，用胰酶消化法和機械分散法是培養(yǎng)昆蟲組織原代細胞的最佳方法[17-18]。因此，從培養(yǎng)結(jié)果來看，上述3種方法對不同昆蟲組織的影響各有區(qū)別，具體該采用何種方法應(yīng)根據(jù)不同昆蟲的不同組織來定。而在本研究中對于油桐尺蛾中腸上皮細胞來說，組織塊法處理的細胞較胰酶消化法以及機械分散法要好。

昆蟲的消化道由前腸、中腸以及后腸組成，鱗翅目昆蟲的前腸和后腸均源自外胚層，而中腸則來源于內(nèi)胚層[9]。中腸是昆蟲分泌消化酶從而對食物進行消化吸收的重要部位，但由于中腸組織是由多層細胞構(gòu)成，所以初代培養(yǎng)時也難免有其他組織混雜其中，如脂肪體和馬氏管等，因此細胞呈多形性。井上元等[19]研究發(fā)現(xiàn)，這些昆蟲細胞培養(yǎng)中形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為細胞分化所形成的有節(jié)律性收縮的肌肉組織，是細胞分裂的重要場所。另有研究者認為，當細胞貼附在支持物上之后，它們原先在生物體內(nèi)時的特征即喪失，通常表現(xiàn)為形態(tài)上呈單一化，并反映其胚層的起源，即“返祖現(xiàn)象”，例如來源于內(nèi)、外胚層的細胞多呈上皮型，而來源于中胚層的細胞則呈成纖維細胞型[20]。本研究所培養(yǎng)的中腸上皮細胞來源于內(nèi)胚層，因此上述理論對其培養(yǎng)具有重要的參考價值。

血清因其內(nèi)含有豐富的生長因子、脂類、蛋白質(zhì)以及無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素，故而是昆蟲細胞培養(yǎng)中用量最大的天然添加劑，對細胞的生長和增殖發(fā)揮著重要作用[21]。Castagnola等[22]在培養(yǎng)煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)中腸原代細胞的過程中發(fā)現(xiàn)，向細胞培養(yǎng)液中添加一定量的血清能夠增加中腸干細胞的分化。但另有研究表明，由于血清中含有的纖粘連蛋白能夠選擇性促進成纖維細胞增殖，但對上皮細胞則產(chǎn)生抑制作用，所以在體外進行初代細胞培養(yǎng)時不可多加血清[23]。因此，對不同組織來源的昆蟲細胞進行培養(yǎng)時，血清的用量應(yīng)仔細斟酌，視細胞的生長狀況而定。

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Primary Culture of Midgut Epithelial Cell fromBuzurasuppressaria

ZHONG Ya-ting，LUO Ji，JIANG Xue-jian，HUANG Hua-yan

(GuangxiZhuangAutonomousRegionForestryResearchInstitute，GuangxiKeyLaboratoryofSuperiorTimberTreesResourceCultivation，GuangxiZhuangAutonomousRegion，Nanning530002，Guangxi,China)

This study was aim to establish midgut epithelial cellline ofBuzurasuppressariaGuenee for basic biology research. Midgut fragements of the moth were isolated and cultured with block explant culture technique，trypsin enzymatic digestion or mechanical dispersion in vitro. The results showed：the best cultivation was found from cells cultured with block explant culture technique，assessed by good cell adherence and growth.Epithelial cells started to migrate out from tissue blocks after 72 hours culture, shaped as fusiform and later reticular coloney growth with higher number.The cells could grow well until 60th day.We conclude that the explant culture technique using tissue blocks is best suited for primary cell culture ofB.suppressariaGuenee midgut epithelial cells .

Buzurasuppressaria；primary cell culture；tissue explant；midgut epithelial cell

2015-10-28；

2015-12-03

廣西林業(yè)科技項目(桂林科字[2014]第17號)；廣西優(yōu)良用材林資源培育實驗室自主研究課題(13-A-04-01)

鐘雅婷(1985—)，女，廣西桂林人，廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院工程師，碩士研究生，從事森林病蟲害研究。E-mail：zhongya528@163.com。

羅輯(1985—)，男，湖南長沙人，廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院副研究員，博士，從事森林病蟲害研究。E-mail：luoji00531ji@hotmail.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.03.004

S763.42

A

1002-7351(2016)03-0015-05