張方圓，林　晨，吳凌濤，王李平，蔡大川，張志軍，方　麗（中國廣州分析測試中心，廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東廣州510070）

中心復合設計法優(yōu)化-氣相色譜-質譜法檢測奶粉中壬基酚

張方圓，林晨，吳凌濤，王李平*，蔡大川，張志軍，方麗
（中國廣州分析測試中心，廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東廣州510070）

目的：建立氣相色譜-質譜法測定奶粉中壬基酚的分析方法。方法：先通過對比實驗選擇合適的萃取劑和凈化小柱，再以色譜峰面積為響應值，采用中心復合設計對壬基酚的衍生化溫度，衍生試劑量和衍生化時間進行優(yōu)化，采用氣相色譜-質譜法進行測定。結果：選擇乙腈為蛋白沉淀劑和萃取劑，F(xiàn)lorisil柱為固相萃取柱，N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（1%三甲基氯硅烷）為衍生試劑；當反應溫度72℃，衍生試劑量為215 μL，反應時間為27 min，壬基酚的衍生效果最佳。在此優(yōu)化條件下，壬基酚濃度范圍為10.70～1369 ng/mL時，其線性良好，檢出限為24.0 μg/kg，回收率為90.6%～105.2%，RSD為2.7%。結論：該方法準確、靈敏、基質干擾小，適用于奶粉中壬基酚的測定。

氣相色譜-質譜法，中心復合設計，壬基酚，奶粉

壬基酚（Nonylphenol）是非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚的生物代謝產物，是一種典型的環(huán)境內分泌干擾物，具有雌激素活性，能夠干擾動物體內激素的合成、釋放、運輸、代謝及功能的表達等一系列生物過程，從而協(xié)同或拮抗天然內源性內分泌激素的作用［1］。壬基酚廣泛用于塑料增塑劑、紡織整理劑、工業(yè)和家用洗滌劑、農藥和印染乳化劑等。壬基酚等環(huán)境激素廣泛用于塑料增塑劑、紡織整理劑、工業(yè)和家用洗滌劑、農藥和印染乳化劑等，很容易通過食物鏈進入動植物人體，在生物體內積累。奶粉中，由于其動物性奶源中可能會有壬基酚等雌激素的存在或是生產和包裝過程中受到壬基酚的污染，而存在被壬基酚污染的可能性。這類環(huán)境激素進入人體，在機體內積累，對生殖能力造成嚴重影響，如性早熟、免疫力低下等，危害人們的身體健康［2］，現(xiàn)在已經引起社會的關注和重視。

目前報道的壬基酚的檢測方法主要有氣相色譜-質譜法（GC-MS），高效液相色譜法（HPLC）以及液相色譜-質譜法（HPLC-MS）。GC-MS因其較高的靈敏度和選擇性，被廣泛應用于環(huán)境樣品中烷基酚的檢測［3-5］。而有關奶與奶制品中壬基酚的檢測方法的報道則較少。隨著三聚氰胺事件的發(fā)生，奶與奶制品的質量安全問題引起了人們廣泛的關注，奶與奶制品壬基酚等雌激素的存在或污染危害人們的身體健康，而我國尚無奶粉中壬基酚殘留量的限量標準。因此，嚴格控制奶制品中壬基酚污染或添加，建立可靠、有效和完善的檢驗方法是非常必要的。

GC-MS雖然對烷基酚有良好的靈敏度和選擇性，由于壬基酚屬極性有機物，影響了GC-MS的靈敏度［6］，而衍生化后其靈敏度有明顯的提高［7］，但是衍生化反應往往效果不好，且重現(xiàn)性較差［8］。中心復合設計（Central Composite Designs，CCDs），是近年來應用較多的一種改進和優(yōu)化產品或實驗設計的一種重要方法［9］。它是由2k因子設計、軸點設計與零水平的中心點重復實驗三部分構成，可用非線性數(shù)學模型進行擬合，具有設計簡單、實驗次數(shù)少、預測性好等優(yōu)點［10］。因此，本文建立GC-MS法測定奶粉中壬基酚的分析方法，針對奶粉樣品的特點，對影響壬基酚萃取效率的因素進行分析，采用中心復合實驗設計對壬基酚的衍生條件進行優(yōu)化，并應用于奶粉樣品的測定，以期為奶粉中壬基酚建立適用、可靠的檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

壬基酚混合標準品（Dr.Ehrenstorfer GmbH 99%）

用甲醇配成標準貯備液（2.14 mg/mL），于-4℃冰箱保存，臨用前用乙醇逐級稀釋成應用液；N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA） 上海阿拉丁試劑有限公司；三甲基氯硅烷（TMCS） 上海阿拉丁試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

Aglient7890A-5975C氣質聯(lián)用儀美國安捷倫公司；毛細管色譜柱：DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；固相萃取柱（SPE柱）北京迪馬科技有限公司，1000 mg/6 mL；電熱鼓風干燥箱上海一恒科技儀器有限公司；KQ-600E超聲波清洗儀昆山超聲儀器有限公司；TD25-WS多管架自動平衡離心機湖南賽特湘儀；氮吹儀Organomation Associates，Jnc.；XW-80A旋渦混合器上海琪特分析儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1萃取劑的選擇平行稱取4份奶粉樣品于50 mL離心管中，均加入壬基酚標準液（2.14 μg/mL）1 mL，分別用乙腈、二氯甲烷、甲醇和1%三氯乙酸作提取劑。加入20.0 mL提取劑渦旋混勻，超聲提取20 min，離心（3500 r/min）4 min，收集上清液。取5.0 mL上清液過經活化處理的Florisil柱，用5.0 mL蒸餾水淋洗，10.0 mL正己烷洗脫，收集洗脫液于10 mL比色管中，在氮氣流下緩慢吹干。加入200 μL BSTFA （1%TMCS），用丙酮定容0.5 mL，70℃反應30 min，備分析用。

1.2.2凈化柱的選擇平行稱取4份奶粉樣品于50 mL離心管中，均加入壬基酚標準液（2.14 μg/mL）1 mL，加入20.0 mL乙腈渦旋混勻，超聲提取20 min，離心（3500 r/min）4 min，收集上清液。各取5.0 mL上清液過經活化處理的Florisil柱、Silica柱、C18柱和陽離子交換柱，用5.0 mL蒸餾水淋洗，10.0 mL正己烷洗脫，收集洗脫液于10 mL比色管中，在氮氣流下緩慢吹干。加入200 μL BSTFA（1%TMCS），用丙酮定容至0.5 mL，70℃反應30 min，備分析用。

1.2.3壬基酚測定方法的確定

1.2.3.1壬基酚的衍生化流程分別取1 mL壬基酚標準液（2.14 μg/mL）于10 mL比色管中，氮氣吹干，加入BSTFA（1%TMCS），用丙酮定容至0.5 mL，恒溫反應備分析用。

1.2.3.2中心復合實驗設計根據(jù)中心復合設計的原理，采用3因素3水平的響應曲面分析方法。通過分析和綜合文獻對壬基酚硅烷化衍生的單因素實驗，選取影響壬基酚衍生效果的3個主要因素：衍生溫度、衍生試劑用量和衍生時間進行響應面優(yōu)化實驗設計，確定了各因素水平范圍，因素水平見表1［3，5，11］。

表1　壬基酚衍生化因素水平Table 1　The factors and levels of the derivatization of nonylpbenol

1.2.4壬基酚的測定稱取2.0 g奶粉于50 mL離心管中，加入20.0 mL乙腈渦旋混勻，超聲提取20 min，離心（3500 r/min）4 min，收集上清液。取5.0 mL上清液過經活化處理的SPE柱，用5.0 mL蒸餾水淋洗，10.0 mL正己烷洗脫，收集洗脫液于10 mL比色管中，在氮氣流下，加入215 μL BSTFA（1%TMCS），用丙酮定容0.5 mL，恒溫72℃，反應27 min，備分析用。

1.3儀器工作參數(shù)

GC條件：以He為載氣，恒流流速1.0 mL/min，進樣口溫度280℃；升溫程序：初始溫度為60℃，保持2 min，然后以15℃/min升至260℃，保持5 min。脈沖不分流進樣，進樣體積1.0 μL。

MS條件：接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，EI源，電子轟擊能量70 eV；信號采集方式為全掃描（Scan，30～350amu）和選擇離子掃描（SIM）（m/z 179、193、221、292）。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 8.0.5軟件對中心復合設計的數(shù)據(jù)進行分析。

2　結果與討論

2.1樣品前處理的條件選擇與優(yōu)化

2.1.1萃取劑的選擇奶粉樣品中成分較復雜，基質干擾較大，其中蛋白質的沉淀和待測組分的提取是樣品前處理的關鍵。通過對比實驗，結果表明壬基酚在1%三氯乙酸中幾乎不溶；二氯甲烷回收率較低；甲醇沉淀蛋白效果較差；而乙腈提取，既能很好的沉淀蛋白，且回收率滿足分析要求。因此方法采用乙腈作為萃取劑。

2.1.2凈化柱的選擇采用固相萃取柱進行樣品前處理時，不同SPE柱的萃取效率和吸附保留容量、不同洗脫劑和用量都會影響待測組分的提取和富集效率，按“1.2.2”方法進行實驗，結果見圖1。由圖1可知，F(xiàn)lorisil柱的效果最佳，當以正己烷為洗脫劑，洗脫量為10 mL時，回收率可達98%。正相固相萃取是動物源性食品中痕量組分富集凈化常用的方法，對比Florisil柱凈化前后的奶粉樣品色譜圖（圖2），發(fā)現(xiàn)Florisil柱能夠較好的去除奶粉中基質的干擾，達到凈化目的。故選用Florisil柱對奶粉中的壬基酚進行凈化和富集。

圖1　不同SPE柱對壬基酚的回收率Fig.1　Recoveries of nonylpbenol with different solid-phase extraction cartridges

圖2　奶粉樣品經Florisil柱凈化前后的色譜圖Fig.2　The chromatogram of milk powder sample before and after solid-phase extraction with florisil extraction cartridge

2.2中心復合設計優(yōu)化壬基酚衍生化條件

由于壬基酚的極性大且沸點高，故采用硅烷化衍生，將其轉化為沸點更低的物質，再進行GC-MS測定，以獲得更高的靈敏度。

采用中心復合設計對壬基酚的衍生條件進行優(yōu)化，實驗設計和結果見表2。

表2　實驗設計與實驗結果Table 2　Experimental arangements of central composite design and the corresponding response

利用Design Expert 8.0.5對表2的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到響應值對3個因素的多元回歸方程：

Y=11911.88+1299.71A+973.01B+1081.72C-1408.38AB+267.84AC-1356.13BC-1808.45A2-1224.20B2-590.28C2

對響應面數(shù)據(jù)進行方差分析（表3），可得該模型“Prof＞F”=0.0411＜0.05，說明此模型差異顯著；失擬項“Prof＞F”=0.126＞0.05，失擬項不顯著，說明模型在整個回歸區(qū)域的擬合度良好，模型建立合理。

表3　回歸方程方差分析Table 3　ANOVA for the response surface quadratic regression model

為了進一步研究衍生溫度，衍生試劑用量和衍生時間的交互作用對響應值的影響，繪制了相應的三維響應曲面圖（圖3）。響應圖可以直觀反映兩兩因素對響應值的影響，衍生效果隨著其中兩因素的增大先上升，當達到一定水平時，衍生效果上升緩慢，隨后下降。響應曲面傾斜度越大說明交互作用越大，因素對反應的影響較為顯著，實驗結果表明，反應溫度（A）和衍生試劑用量（B）對此衍生反應的影響較明顯。

圖3　壬基酚衍生效果的響應曲面圖Fig.3　The response surfaces of derivatization of nonylpbenol with the three factors

通過對回歸方程進行求導，可得極值點的坐標A=71.71，B=215.49，C=26.79，此時模型取得最優(yōu)解39484.7。因實驗操作過程中，對實驗條件精準性的控制，將優(yōu)化得到的反應條件修正為：反應溫度為72℃，衍生試劑量為215 μL，反應時間為27 min。為了驗證模型預測的準確性，按修正后的實驗條件進行了6次驗證實驗，所得的平均響應值為38856（RSD= 4.1%），與預測值非常接近，表明此優(yōu)化方法可行。

2.3色譜行為考察和評價

2.3.1線性范圍和檢出限按上述優(yōu)化的衍生條件衍生后，進行GC-MS測定。壬基酚衍生化結構失去-C8H17，主要離子為179（m/z）和292（m/z）［12］，因此，選取179、193、221、292為特征離子，進行選擇離子掃描，得到衍生后壬基酚的選擇離子流圖如圖4所示，總共分離出12種同分異構體，其中主要同分異構體有9種，本文中把所有同分異構體作為總體進行定量分析。

圖4　壬基酚的選擇離子流圖Fig.4　Selective ion chromatograms of nonylpbenol

分別移取50、100、200、800、1600、3200、6400 μL壬基酚標準溶液（0.214 μg/mL），于10 mL比色管，氮氣吹干，按優(yōu)化后的衍生條件衍生后，按照儀器工作條件對每個樣品平行測定三次，取平均值，與對應的濃度進行線性擬合，得到壬基酚標準工作曲線。結果表明壬基酚在10.70～1369 ng/mL濃度范圍內呈良好的線性關系，其線性方程為：y=19.8x+221.9，線性相關系數(shù)為0.9995。通過加標實驗確定壬基酚的儀器檢出限為24.0 ng/mL（S/N=3）。當樣品取樣量為2.0 g，定容體積為0.5 mL，稀釋倍數(shù)為4，則壬基酚的檢出限為24.0 μg/kg。

2.3.2方法準確度和精密度取3份相同樣品作空白，另取同一樣品做三水平加標回收實驗。分別加入0.5、1.0和2.0 mL壬基酚標準溶液（0.214 μg/mL），按“1.2.4”方法提取、凈化、衍生和測定，每一水平每個樣品平行測定6次，計算加標回收率。奶粉中壬基酚的回收率為90.6%～105.2%，其標準相對偏差（RSD）為2.7%，滿足分析測定的要求。

圖5　空白、標樣和樣品色譜圖Fig.5　The chromatogram of blank，nonylpbenol，and sample under the same conditions

2.3.3樣品分析分別取市售的6份奶粉按上述方法進行壬基酚含量的測定，色譜圖見圖5。從圖5可知，按“1.2.4”方法處理后，樣品的基質效應較小，無明顯干擾，其中3份樣品未檢出，另3份樣品中均檢出壬基酚，其含量分別為328、201和178 μg/kg。

3　結論

建立了氣相色譜-質譜法檢測奶粉中壬基酚的分析方法。實驗結果表明該方法的回收率和重現(xiàn)性均滿足痕量分析的要求，對壬基酚的檢出限為24.0 μg/kg。該方法操作簡單，且能有效去除奶粉中復雜基質的干擾，應用于奶粉中壬基酚的檢測，可以得到滿意的結果。

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Determination of the nonylpbenol in milk powder by gas chromatography-mass spectrometry with the aid of central composite design

ZHANG Fang-yuan，LIN Chen，WU Ling-tao，WANG Li-ping*，CAI Da-chuan，ZHANG Zhi-jun，F(xiàn)ANG Li
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals，China National Analytical Center，Guangzhou 510070，China）

Objective：An analytical method based on the gas chromatography-mass spectrometric had been developed for the determination of nonylpbenol in milk powder.Method：Firstly，selecting the appropriate extraction and purification cartridge by the contrast experiment，then，by using the chromatographic peak area as response values，the temperature，time and the dosage of silylation reagent involved in the derivatization procedure were optimized by central composite design.Results：Acetonitrile was used as extractant and protein precipitator，the solid-phase extraction was conducted on a florisil extraction cartridge，and the silylation reagent was trimethyl chlorosilance with 1%trimethyl chlorosilane.Under the temperature of 72℃，with the dosage of silylation reagent of 215 μL，after a reaction time of 27 min，the derivatization of nonylpbenol reach the best result. Conclusions：Under the optimal conditions，the limit detection of nonylpbenol was 24.0 μg/kg，linearity range was 10.70～1369 ng/mL，and the recoveries ranged from 90.6%to 105.2%with a relative standard deviations of 2.7%.This method is accurate，sensitive，with small sample matrix interference，and applicable to the determination of nonylpbenol in milk powder.

gas chromatography-mass spectrometry；central composite design；nonylpbenol；milk powder

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0102-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.011

2015-05-25

張方圓（1989-），女，碩士，主要從事食品安全與質量控制方面的研究，E-mail：zhangfyde@163.com。

王李平（1985-），男，碩士，主要從事食品及藥品的安全質量方面的研究，E-mail：wangjiang0916@126.com。

廣東省專業(yè)鎮(zhèn)中小微企業(yè)服務平臺建設項目（2013B091604003）；廣東省主體科研機構創(chuàng)新能力建設專項（粵科規(guī)財字【2014】208號）。