胡　家， 李　蕾， 王勁松， 趙君朋*

(1首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京　100069； 2首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院； *通訊作者，E-mail: jp75@mail.ccmu.edu.cn)

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人乳牙牙髓干細(xì)胞全蛋白質(zhì)非膠分級(jí)分離電泳分析

胡家1， 李蕾1， 王勁松2， 趙君朋1*

(1首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京100069；2首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；*通訊作者，E-mail: jp75@mail.ccmu.edu.cn)

目的對(duì)人乳牙牙髓干細(xì)胞全蛋白質(zhì)進(jìn)行非膠分級(jí)分離電泳，并用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析所得蛋白質(zhì)組分。方法對(duì)人乳牙牙髓干細(xì)胞進(jìn)行裂解，將所得的細(xì)胞全蛋白質(zhì)均分到12孔樣品槽里進(jìn)行非膠分級(jí)分離電泳，液相回收電泳后的12個(gè)組分，對(duì)各組分進(jìn)行SDS-PAGE分離，并對(duì)各組分進(jìn)行溶液酶切后再進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析。結(jié)果SDS-PAGE圖譜顯示人乳牙牙髓干細(xì)胞全蛋白質(zhì)經(jīng)非膠分級(jí)分離電泳分成了12個(gè)不同的蛋白質(zhì)組分，液質(zhì)聯(lián)用對(duì)各組分進(jìn)行分析均成功鑒定到一定數(shù)目蛋白質(zhì)。結(jié)論非膠分級(jí)分離電泳能將復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行預(yù)分離，液相回收分離后樣品便于進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。

非膠分級(jí)分離電泳；細(xì)胞全蛋白質(zhì)；液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜；蛋白質(zhì)組

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的執(zhí)行者，因此研究蛋白質(zhì)組才能真正認(rèn)清各種生理現(xiàn)象的分子機(jī)制。質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)的常用方法之一，通過質(zhì)譜鑒定能認(rèn)識(shí)某一蛋白質(zhì)組的各個(gè)蛋白質(zhì)組成。在進(jìn)行質(zhì)譜分析之前一般會(huì)對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)分離，如十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、雙向電泳、液相分離、離子交換等，每種方法均有自身的優(yōu)勢(shì)及缺點(diǎn)，樣品分離的質(zhì)量直接關(guān)系質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。

非膠分級(jí)分離電泳(OFFGEL electrophoresis，OGE)是在安捷倫公司生產(chǎn)的Agilent 3100 OFFGEL等電聚焦分級(jí)分離儀上進(jìn)行，其原理是在固定pH梯度的干膠條上，根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽的等電點(diǎn)進(jìn)行等電聚焦分離；且分離的蛋白質(zhì)或多肽，最終以液相的形式加以回收。OGE對(duì)于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的分辨率與傳統(tǒng)的等電聚焦電泳(IEF)是一樣的，所不同的是分離所得各組分能液相回收，這樣便于后續(xù)的液質(zhì)聯(lián)用分析[1]，而不需要切膠、提取多肽等繁瑣步驟。以往研究還發(fā)現(xiàn)，采用等電聚焦電泳比用陽離子交換結(jié)合反向色譜分離蛋白質(zhì)樣品具有更高的分辨率[2]，并且按照等電點(diǎn)分離樣品之后能得出蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)信息，為后期的質(zhì)譜鑒定結(jié)果提供驗(yàn)證數(shù)據(jù)。

細(xì)胞的總蛋白質(zhì)組具有寬泛的豐度范圍，而對(duì)于低豐度蛋白質(zhì)的有效分離和鑒定一直是困擾人們的難題之一。本實(shí)驗(yàn)對(duì)人乳牙牙髓干細(xì)胞進(jìn)行裂解，將所得的細(xì)胞全蛋白質(zhì)進(jìn)行非膠分級(jí)分離電泳，由此將復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品按照等電點(diǎn)分成12份，液相回收后，對(duì)各組分進(jìn)行SDS-PAGE分離，并對(duì)各組分進(jìn)行溶液酶切后再進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。

1　材料和方法

1.1主要試劑及儀器

α-MEM、FBS、L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素均為Invitrogen公司產(chǎn)品。固相pH梯度干膠條(IPG strip pH3-10L，13 cm)、IPG緩沖液(pH 3-10的線性膠條)、覆蓋油、尿素及等電聚焦相關(guān)耗材均為Agilent公司產(chǎn)品，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、硫脲、SDS、甘氨酸、Tris、2D Quant蛋白定量試劑盒均為GE公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為Promega公司產(chǎn)品，過硫酸銨、二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺、考馬斯亮藍(lán)G250、三氟乙酸、甲酸為Sigma公司產(chǎn)品，脫鹽柱為Waters公司產(chǎn)品，乙腈為Fluka公司產(chǎn)品。等電聚焦儀OFFGEL(美國Agilent公司)；超速離心機(jī)(德國Heraeus公司)；Speed Vac真空干燥機(jī)(美國Thermo公司)；Easy-Nano LC液相色譜儀和Q-Exactive plus質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；DU800分光光度計(jì)(德國Beckman公司)。

1.2人乳牙牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[3，4]的方法，乳牙牙髓取自7-8歲兒童的滯留乳中切牙(n=3)，均為男性，經(jīng)臨床工作人員和患兒及其家長(zhǎng)同意。將中段牙髓組織反復(fù)清洗，剪碎，置于含Ⅰ型膠原酶(3 g/L)和分散酶(4 g/L)的消化液中，37 ℃消化15 min，室溫1 000 r/min離心5 min，去上清，加入細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(α-MEM加10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2-3 d更換一次培養(yǎng)基。取3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3人乳牙牙髓干細(xì)胞全蛋白質(zhì)制備

[5]方法對(duì)人乳牙牙髓干細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)裂解，裂解液含20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、8 mol/L尿素、20 mmol/L DTT及蛋白酶抑制劑(Roche，1片/10 ml)。向細(xì)胞沉淀中加入5倍體積的裂解液，渦旋均勻，置于冰上裂解細(xì)胞2 h。裂解過程中將樣品置于冰浴中超聲破碎細(xì)胞，控制超聲功率2 W，超聲時(shí)間2 s，間歇2 s，超聲至樣品溶液澄清。將樣品溶液進(jìn)行高速離心，4 ℃，40 000×g離心1 h。離心結(jié)束后取上清，分裝，保存于-80 ℃，同時(shí)取5 μl×3樣品做蛋白定量用，采用GE公司2D Quant蛋白定量試劑盒對(duì)細(xì)胞全蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。

1.4細(xì)胞全蛋白質(zhì)非膠分級(jí)分離電泳

細(xì)胞全蛋白質(zhì)制備好后，即可進(jìn)行非膠分級(jí)分離電泳。溶液配制：按照試劑盒(Agilent 3100 OFFGEL Fractionator Kit)說明配制1.25×儲(chǔ)液。使用時(shí)用水稀釋成1×工作液，再取200 μg細(xì)胞全蛋白質(zhì)用1.25×儲(chǔ)液稀釋至2 ml。將聚焦槽放于非膠分級(jí)分離儀上，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程保持水平。撕開IPG膠條的保護(hù)膜，將有凝膠一面朝上放入聚焦槽，“+”極端頂住放置固定電極一端。在膠條上放入12孔樣品槽，壓平卡住。每個(gè)樣品孔加入40 μl 1×工作液，讓膠條水化15 min。取4塊電極墊片放入1×工作液充分浸濕，緊貼樣品槽的外側(cè)兩端各放上兩片，保證墊片與凝膠之間無縫隙。上樣：每個(gè)樣品孔加入150 μl稀釋過的蛋白質(zhì)樣品，蓋上密封蓋，壓平蓋緊。再取10 μl去離子水加在電極片上。最后加覆蓋油：先取200 μl加在“+”極端，1 ml加在“-”極端，過1 min后，在兩端各加入200 μl。聚焦完成后，分別取出12個(gè)樣品孔里的樣品，再每個(gè)組分取出10 μl，以及未分離細(xì)胞全蛋白質(zhì)取5 μl進(jìn)行SDS-PAGE分離，其余樣品用于液質(zhì)聯(lián)用分析。

1.5蛋白質(zhì)沉淀及酶切

將已分離的12個(gè)組分的蛋白質(zhì)樣品用10% TCA/丙酮進(jìn)行沉淀[7]，凍干，參照文獻(xiàn)[8，9]方法進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)過夜(16 h以上)進(jìn)行，于次日用終濃度為0.1% TFA終止反應(yīng)，然后用脫鹽柱去除雜質(zhì)，最后凍干所得多肽樣品。

1.6液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析

將凍干的12個(gè)組分多肽樣品重溶于0.1 %甲酸溶液，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Easy-Nano LC，Q-Exactive plus，Thermo)分析。液相條件：反相色譜柱采用C18柱(10 cm×75 μm，3 μm)。流動(dòng)相A液為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B液為含0.1%甲酸的乙腈溶液，流速為300 nl/min。質(zhì)譜條件：納升級(jí)電噴霧電離方式(Nano-ESI)，正離子模式掃描，碰撞能量為27%HCD，分辨率設(shè)置為一級(jí)70 000 m/z 200，二級(jí)17 500 m/z 200，母離子掃描范圍為m/z 300-1 800，子離子掃描范圍起始位m/z 100，數(shù)據(jù)依賴模式MS/MS，隔離窗口為1.6 D，動(dòng)態(tài)排除為60 s；噴霧電壓為2.0 kV，毛細(xì)管溫度為275 ℃，S-lens：55%。質(zhì)量數(shù)據(jù)由XCalibur軟件采集處理。

1.7質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫搜索

采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer1.4數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行序列分析。酶解位點(diǎn)為精氨酸(R)，賴氨酸(K)，允許有兩個(gè)漏切位點(diǎn)，允許一側(cè)非特異性酶解。固定修飾：半胱氨酸的carbamidomethylation。可變修飾：Oxidation/+15.995 D(M)，Deamidated/+0.984 D(N，Q)。按肽段匹配假陽性率為1%輸出搜庫結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞全蛋白質(zhì)非膠分級(jí)分離電泳后進(jìn)行SDS-PAGE分離

將人乳牙牙髓干細(xì)胞全蛋白質(zhì)經(jīng)非膠分級(jí)分離電泳后，從“+”極到“-”極各組分樣品依次標(biāo)注為S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9，S10，S11，S12。12組分的泳道中均有蛋白質(zhì)條帶(見圖1)，且各泳道蛋白質(zhì)條帶有差異，相比較未進(jìn)行OGE的細(xì)胞全蛋白質(zhì)泳道(lysate)分離效果更好。

M.蛋白分子量標(biāo)記；lysate為細(xì)胞全蛋白質(zhì)；S1-S12分別表示經(jīng)非膠分級(jí)分離電泳后所得的12個(gè)組分圖1　細(xì)胞全蛋白質(zhì)非膠分級(jí)分離電泳后SDS-PAGE圖Figure 1　The map of SDS-PAGE of the total proteins isolated by OGE

2.2細(xì)胞全蛋白質(zhì)非膠分級(jí)分離電泳所得12組分的質(zhì)譜分析結(jié)果

將人乳牙牙髓干細(xì)胞全蛋白質(zhì)非膠分級(jí)分離電泳所得的12個(gè)組分分別進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀、重溶后酶切、脫鹽后，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。圖2所示為其中一個(gè)組分液相基峰離子流圖(BPC)(A)、液相洗脫28.88 min時(shí)的一級(jí)質(zhì)譜圖(B)及m/z709.39的二級(jí)質(zhì)譜圖(C)。12個(gè)組分分別鑒定到的蛋白數(shù)見表1，從OGE時(shí)的“+”極到“-”極各組分樣品依次標(biāo)注為S1-P，S2-P，S3-P，S4-P，S5-P，S6-P，S7-P，S8-P，S9-P，S10-P，S11-P，S12-P。經(jīng)質(zhì)譜分析各組分，發(fā)現(xiàn)每一組分均鑒定到一定數(shù)目的蛋白質(zhì)。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)人乳牙牙髓干細(xì)胞全蛋白質(zhì)進(jìn)行OGE分離，收集分離出的12個(gè)組分，進(jìn)行SDS-PAGE分離，結(jié)果顯示分離效果良好，又將這12個(gè)分離所得組分酶切成多肽樣品，去雜質(zhì)后，再進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，共鑒定到1 798個(gè)非冗余蛋白質(zhì)。非膠分級(jí)分離電泳技術(shù)對(duì)于復(fù)雜樣品進(jìn)行預(yù)分離，并且能液相回收各組分，再進(jìn)行質(zhì)譜分析。相比采用雙向凝膠電泳技術(shù)對(duì)人乳牙牙髓干細(xì)胞全蛋白質(zhì)進(jìn)行分離[4]，省去了樣品等電聚焦電泳之后向二相凝膠電泳轉(zhuǎn)移的步驟，不僅操作流程更簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，而且杜絕了轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)丟失的可能。另外在質(zhì)譜鑒定之前無需從凝膠中提取多肽，采用溶液酶切的方法能使更多多肽被質(zhì)譜檢測(cè)到。

本實(shí)驗(yàn)中，各組分質(zhì)譜鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)目可能受到去雜質(zhì)及脫鹽步驟的影響，而使得部分蛋白未被鑒定到。如圖1、表1所示，其中S1，S2泳道的蛋白質(zhì)條帶相對(duì)較少，在質(zhì)譜鑒定相應(yīng)組分的結(jié)果中S1-P，S2-P的蛋白質(zhì)數(shù)目相對(duì)其他各組分也少一些，而S2泳道比S1泳道的蛋白質(zhì)條帶明顯，但其質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目并不相符。因此還需對(duì)去雜質(zhì)脫鹽步驟進(jìn)行優(yōu)化。

OGE適用于多種來源的復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品，如組織、細(xì)菌、亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組[1,10,11]，分泌蛋白[12,13]，血清[14]等等。該技術(shù)既可用于分離蛋白質(zhì)樣品也可分離多肽樣品，Uzozie等[15]對(duì)大腸腺瘤組織和正常腸黏膜組織及相關(guān)細(xì)胞系的總蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，之后采用穩(wěn)定同位素8標(biāo)試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，再用OGE分離多肽樣品，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用測(cè)試分析后，最終在組織里鑒定到4 325種非冗余蛋白質(zhì)，在細(xì)胞中鑒定到2 017種非冗余蛋白質(zhì)。在國內(nèi)開展此項(xiàng)分離技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室還不多，李賢煜等[9]以肝癌細(xì)胞系MHCC97L的無血清培養(yǎng)分泌蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，將分泌蛋白質(zhì)酶切所得肽段進(jìn)行OGE分離，再經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用鑒定了2 995個(gè)蛋白質(zhì)。

圖2　液質(zhì)聯(lián)用分析其中一個(gè)組分所得液相BPC圖(A)、液相洗脫28.88 min時(shí)的一級(jí)質(zhì)譜圖(B)及m/z 709.39的二級(jí)質(zhì)譜圖(C)Figure 2　BPC diagram of one of the separated proteins from OGE(A), MS diagram at elution time of 28.88 min(B), and MS/MS diagram at m/z of 709.39(C) in LC-MS/MS

表1OGE各組分鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目

Table 1Numbers of unique proteins in 12 fractions identified by OGE

樣品編號(hào)鑒定蛋白個(gè)數(shù)樣品編號(hào)鑒定蛋白個(gè)數(shù)樣品編號(hào)鑒定蛋白個(gè)數(shù)S1-P148S5-P521S9-P235S2-P73S6-P652S10-P433S3-P266S7-P406S11-P348S4-P276S8-P420S12-P345

OGE與各種標(biāo)記方法、液質(zhì)聯(lián)用、親和富集和凝膠分析等上下游處理方法兼容，體現(xiàn)了該分離方法具有極強(qiáng)的靈活性。并且分離重復(fù)性好，可重復(fù)實(shí)驗(yàn)收集某一個(gè)組分的樣品，從而富集該pH范圍的低豐度蛋白質(zhì)(或多肽)尤其便于對(duì)低豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，如各種細(xì)胞因子，血清去高豐度蛋白之后樣品，細(xì)胞或組織分泌蛋白質(zhì)組等等，用常規(guī)分離技術(shù)很難研究的樣品，采用該技術(shù)進(jìn)行分離、富集，從而為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

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Analysis of the total cell proteins of stem cells from human exfoliated deciduous teeth by OFFGEL electrophoresis

HU Jia1, LI Lei1, WANG Jinsong2, ZHAO Junpeng1*

(1MedicalExperimentandTestCenter,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2CapitalMedicalUniversitySchoolofBasicMedicalSciences;*Correspondingauthor,E-mail:jp75@mail.ccmu.edu.cn)Abstract：ObjectiveTo isolate and identify the total cell proteins of stem cells from human exfoliated deciduous teeth by OFFGEL electrophoresis and liquid chromatography with mass spectrometry(MS).MethodsThe total cell proteins were extracted from stem cells from human exfoliated deciduous teeth, and assigned into 12 sample wells for OFFGEL electrophoresis(OGE). The 12 protein fractions were obtained by liquid recovery, then isolated by SDS-PAGE and digested to the peptides, and finally identified by nano liquid chromatography-electrospray ionization-MS/MS(LC-ESI-MS/MS).ResultsThe map of SDS-PAGE revealed that the total cell proteins of stem cells from human exfoliated deciduous teeth were composed of 12 different fractions after OGE. A number of proteins from the 12 fractions were successfully identified by nano LC-ESI-MS/MS.ConclusionThe complex protein samples can be isolated, and the separated proteins are easy to be identified by LC-MS/MS.Key words:OFFGEL electrophoresis;total cell proteins;LC-MS/MS;proteome

首都醫(yī)科大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(校技術(shù)類2014JS04)

胡家,女,1981-06生,碩士,主管技師,E-mail:hujia413@163.com

2015-12-22

Q503

A

1007-6611(2016)03-0250-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.013