黃 漩，王俊平，2，王俊英，劉翠翠，王 碩，*（.教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津市食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津科技大學，天津00457；2.東北農業(yè)大學食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江哈爾濱5000；.中國農業(yè)科學院生物技術研究所，北京0008）

MALDI-TOF質譜法分析與鑒定駱駝乳中的磷酸肽

黃 漩1，王俊平1，2，王俊英3，劉翠翠1，王 碩1，*
（1.教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津市食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津科技大學，天津300457；2.東北農業(yè)大學食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江哈爾濱150030；3.中國農業(yè)科學院生物技術研究所，北京100081）

建立一種基于基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）為基礎的方法檢測并鑒定駱駝乳中的磷酸化肽段。通過商品化的二氧化鈦（TiO2）材料富集駝乳中低豐度的磷酸肽，并優(yōu)化出TiO2富集材料與駝乳中磷酸肽相互作用最適宜的吸附洗脫條件，孵育緩沖液：乙腈/水（50∶50，v/v）+1%三氟乙酸，洗脫液為10%氨水。再將得到的磷酸肽溶液用MALDI-TOF MS方法檢測，用Mascot數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)檢索，能夠從駝乳中鑒定出四個磷酸化肽段。本研究為不同哺乳動物乳中磷酸化肽段的檢測提供了一些新的思路且能夠應用于摻假乳的鑒別。

MALDI-TOF MS，駱駝乳，富集，磷酸化肽段

一些蛋白多肽具有特殊的生理功能，以非活性狀態(tài)潛伏在蛋白質體系中，經過適當?shù)拿附?，能夠轉變?yōu)榫哂刑厥馍砉δ艿幕钚誀顟B(tài)發(fā)揮其作用。目前，研究最多的是礦物質元素結合肽酪蛋白磷酸肽（CPPs）。CPPs能夠促進鈣吸收，避免鈣的沉淀，因此可用作食品鈣強化劑［1］。CPPs還是一種良好的金屬結合肽，可作為許多礦質元素的載體，結合游離的Fe、Cu、Zn等金屬離子形成可溶性鹽，促進它們的被動轉運過程［2］。還能夠應用于牙科疾病的治療，使牙齒琺瑯質重新鈣化抑制齲齒［3］。常用于研究磷酸肽富集的樣品為牛乳CPPs，其他哺乳動物的CPPs研究較少，Kamau研究過駱駝乳源肽段［4］，針對駱駝乳CPPs的研究還未見報道，不同哺乳動物乳中的CPPs的氨基酸序列各異，但它們都具有相似的結構特征絲氨酸-磷酸基團，這是其發(fā)揮生理功能的重要結構，磷酸基團在不同CPPs中的位置不同使其磷酸解離常數(shù)也不同，所

以具有不同的生理活性［5］。鑒定出不同乳中的CPPs并研究其主要的生理功能是未來發(fā)展研究的一個重要內容。且通過不同乳中CPPs的鑒定建立出一個全面的CPPs質譜圖庫也能夠成為鑒別乳摻假的一個重要指標。

因為磷酸肽的低含量及低離子化效率等特點對磷酸肽的檢測造成了極大的困難，所以在檢測磷酸肽前需要先進行富集再用于質譜的鑒定分析［6-7］?，F(xiàn)在應用比較廣泛的富集磷酸肽策略是固相離子親和色譜法［8-12］和金屬氧化物親和色譜法［13-17］。本文采用的是金屬氧化物親和色譜法，先用商品化的TiO2材料富集駝乳CPPs，再通過MALDI-TOF-MS進行分析，Mascot數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出駝乳中四種不同的CPPs。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈（ACN）、氨水 國藥集團化學試劑有限公司，分析純；三氟乙酸 美國Alfa Aesar公司；碳酸氫銨 天津博迪化工股份有限公司，分析純；磷酸 博歐特（天津）化工貿易有限公司，分析純；2，5-二羥基苯甲酸（DHB） 德國Bruker公司；尿素 上海生工生物有限公司；1，4-二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、胰蛋白酶 美國Sigma公司；駱駝乳 新疆旺源駝奶實業(yè)有限公司。

UltrafleXtremeTM基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）、MTP384不銹鋼靶板 德國Bruker公司；HH-S1恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠；Centrifuge 5804R臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 駱駝乳酶解液的制備 量取0.25 mL駱駝乳（蛋白質含量3.6 mg/100 mg）加入到0.25 mL尿素（8 mol/L，50 mmol/L NH4HCO3）中，渦旋混勻，室溫下變性2.5 h。在變性溶液中加入20 μL DTT（10 mmol/L，50 mmol/L NH4HCO3），37℃水浴搖床中振蕩2 h。然后加入20 μL IAA（20 mmol/L，50mmol/L NH4HCO3）進行烷基化，用錫紙包住避光，常溫振蕩30 min。將混合溶液用碳酸氫銨緩沖溶液（50 mmol/L）稀釋10倍，以防止高濃度的尿素影響胰蛋白酶的活性，然后加入230 μL胰蛋白酶溶液（1 mg/mL），在37℃水浴搖床中酶解16 h，酶解后得到的產物分裝后冷凍保藏，備用［18］。

1.2.2 磷酸化肽段的富集 稱取商品化的TiO2材料2.0 mg溶于配制好的吸附緩沖液中潤洗一遍，離心分離（5000 r/min）5 min，棄去上清溶液。將潤洗后的材料與稀釋到一定濃度的磷酸肽酶解液（用孵育緩沖溶液稀釋）混合，用移液槍反復吸打，渦旋振蕩，使材料與磷酸肽能夠充分混合，靜置30 min，離心分離（5000 r/min）5 min，保留上清液用于檢測是否清洗干凈非磷酸化肽，用孵育溶液清洗吸附磷酸肽的材料，直到上清液中檢測不到肽段為止，然后用200 μL一定濃度的氨水洗脫材料上吸附的磷酸肽，將氨水與吸附磷酸肽的材料充分混合（吸打、渦旋），靜置30 min，離心分離（5000 r/min）5 min，上清溶液用透析袋（截留分子量500～1000）在去離子水中透析1 h，得到的溶液冷藏，用于MALDI-TOF的檢測。

分別通過乙腈（30%、50%、70%）與TFA（0.1%、0.5%、1.0%）在孵育緩沖液中的添加量實驗商品化TiO2材料富集駝乳中磷酸肽的最適孵育緩沖液條件，用不同含量的氨水水溶液實驗商品化TiO2材料富集駝乳中磷酸肽的最適洗脫液條件。

1.2.3 MALDI-TOF MS分析 使用布魯克公司的UltrafleXtremeTM飛行時間質譜檢測分析磷酸化肽段，配備有延遲萃取裝置和一個波長為337 nm的脈沖氮氣激光，在正離子反射模式下進行，激光頻率2000 Hz，加速電壓25 kV，單次掃描信號累加1000次，靶板為MTP 384不銹鋼靶板，經過材料富集的酶解肽段用0.1%TFA水溶液稀釋到一定的濃度，取2 μL稀釋的酶解肽段與2 μL DHB基質（20 mg/mL，30%ACN，1%H3PO4）混和，取1 μL混合后的溶液點在靶板上用于MALDI-TOF MS分析。

MASCOT（http：//www.matrixscience.com/）用于數(shù)據(jù)庫搜索鑒定相應的肽段。數(shù)據(jù)庫：SwissProt；分類學：Mammalia（mammals）；質量容忍度：100 ppm；固定修飾：Carbamidomethyl（C）；可能修飾：氧化（M），磷酸化（ST）；反射正離子檢測模式。

2 結果與討論

2.1 孵育緩沖溶液的優(yōu)化

不同材料的最佳孵育緩沖液和洗脫條件會有一定的差異，TiO2是兩性金屬氧化物，在適當?shù)臈l件下，對非磷酸肽也會展現(xiàn)出較強的親和性，所以優(yōu)化TiO2材料富集駝乳中磷酸肽的吸附、洗脫條件是必要的。

2.1.1 乙腈含量對富集磷酸肽的影響 肽段具有疏水性的特點，而具有磷酸基團的肽段易溶于水，孵育緩沖液中的乙腈能夠消除疏水性非磷酸肽與金屬氧化物之間的非特異性吸附作用，能夠減少非磷酸肽的干擾。

未經過富集的駝乳胰蛋白消化液如圖1-A所示，沒有富集到任何磷酸肽，整個質譜圖由非磷酸肽占據(jù)主導地位；圖1-B展示出的是乙腈/水（0.5%TFA）為30/70時得到的質譜圖，雖然能檢測到四種磷酸化肽段及其中性丟失分子，但是伴隨有許多非磷酸肽的干擾，乙腈含量較低不能完全消除非磷酸肽的干擾；當乙腈與水的比例為50/50，在質譜圖中能觀察到只有磷酸肽及其中性丟失分子（圖1-C），基本沒有非磷酸肽的干擾；乙腈/水的比例為70/30時（圖1-D），雖然非磷酸肽的干擾較少，但是磷酸肽的強度也有所降低，磷酸肽因磷酸基團的存在具有較強的親水性，在適當?shù)囊译媾c水比例中才能使磷酸肽與材料充分作用。所以最后優(yōu)化出的最適宜的乙腈與水的比例為50/50。

2.1.2 三氟乙酸含量對富集磷酸肽的影響 TiO2是兩性金屬氧化物，在酸性條件下，能夠與磷酸肽結合，在堿性條件下，釋放出磷酸肽，而pH在3.5～4.5的酸性氨基酸會干擾材料對磷酸肽的富集，分別添加0.1%、0.5%和1%的TFA研究TiO2富集材料與磷酸肽結合的最適pH。當TFA的添加量為0.1%時，如圖2-A所示，有許多非磷酸肽的干擾，TFA含量較低，使pH較高，一些酸性的非磷酸肽與材料發(fā)生非特異性的吸附，沒有完全洗脫掉非磷酸肽。TFA的含量增加到0.5%時

（圖2-B），非磷酸肽的信號雖然得到抑制，還是有一些非磷酸肽的干擾，且磷酸肽的信號要弱于TFA添加量為1.0%的磷酸肽信號。從圖2-C可知，當添加量為1.0%時，基本沒有非磷酸肽的干擾。因此，把1.0% TFA添加到乙腈和水的混合液（ACN∶H2O=50∶50）中，作為最佳條件的孵育緩沖溶液用于磷酸肽的富集。

圖1 駱駝乳酶解液使用不同比例乙腈與水孵育緩沖液的MALDI-TOF MS質譜圖Fig.1 MALDI-TOF MS spectra of tryptic camel milk digest using different ratios of ACN and water in incubation

2.2 洗脫條件的優(yōu)化

MALDI-TOF MS分析前，需要通過適當?shù)南疵撘鹤畲笙薅鹊陌迅患讲牧仙系牧姿犭南疵撓聛怼Ｔ趬A性條件下，金屬氧化物顯示出路易斯堿的性質會釋放富集在材料上的磷酸肽，所以磷酸肽的洗脫需要在堿性條件下進行。在這個研究中，5%、10%和15%的氨水被用作考察最佳洗脫條件。當5%NH3·H2O作為洗脫液（圖3-A）時，只能檢測到兩種磷酸肽，且信號較弱伴隨著非磷酸肽的干擾，氨水含量較低導致pH較低，不能把吸附在材料上的磷酸肽完全洗脫下來，磷酸肽信號較弱不能抑制住非特異性吸附殘留的非磷酸肽的信號；當氨水的含量為10%（圖3-B）時，能夠檢測到全部磷酸肽及其中性丟失片段，基本沒有非磷酸肽干擾；當氨水的含量為15%（圖3-C）時，雖然能檢測到四種磷酸肽，但同時也出現(xiàn)非磷酸肽的干擾，氨水濃度過大，發(fā)生了強力洗脫，將材料上吸附的所有肽段都洗脫下來造成了大量的非磷酸肽干擾。所以10%NH3·H2O作為最佳的洗脫液，這時的pH大概在11左右，磷酸基團與金屬化合物之間的吸附強度降至最小，能洗脫下大量的磷酸肽。

圖2 駱駝乳酶解液使用不同TFA含量孵育緩沖液的MALDI-TOF MS質譜圖Fig.2 MALDI-TOF MS spectra of tryptic camel milk digest using different contents TFA in incubation

2.3 磷酸肽的鑒定

采用MALDI-TOF MS對分離富集的駝乳酪蛋白磷酸肽進行準確的鑒定分析，單峰駱駝的αS1-酪蛋白共有230個氨基酸，αS2-酪蛋白有193個氨基酸，β-酪蛋白有232個氨基酸，理論序列已經明確。駝乳

酶切后經MALDI-TOF-TOF MS檢測，掃描范圍為m/z 700～3500的一級質譜圖見圖4。選擇信號強度較高的m/z 1411.68，m/z 2229.27，m/z 2386.19，m/z 2523.11肽段用串聯(lián)質譜進行序列分析，通過Mascot數(shù)據(jù)庫檢索，在m/z 1411.68（圖5A），m/z 2229.27（圖5B），m/z 2386.19（圖5C），m/z 2523.11（圖5D）二級質譜圖

中能夠觀察到連續(xù)的b和y離子峰，鑒定出四種肽段的序列，詳細的序列信息見表1。

圖3 駱駝乳酶解液使用不同氨水含量洗脫液的MALDI-TOF MS質譜圖Fig.3 MALDI-TOF MS spectra of tryptic camel milk digest using different contents of NH3·H2O in eluent

圖4 駱駝乳酶解液MALDI-TOF MS質譜圖Fig.4 MALDI-TOF MS spectra of tryptic camel milk

圖5 駝乳酶解液MALDI-TOF-TOF MS質譜圖Fig.5 MALDI-TOF-TOF MS spectra of tryptic camel milk digest

表1 通過MALDI-TOF-TOF MS分析的駱駝酶解液中的磷酸肽Table1 The phosphopeptides from tryptic camel milk digest were identified by MALDI-TOF-TOF MS analysis

3 結論

本工作是以駱駝乳為研究對象，通過TiO2材料對其中的磷酸肽進行富集，分別從孵育緩沖液中的乙腈含量、TFA含量及洗脫液中氨水含量三個方面對材料的富集條件進行優(yōu)化，通過MALDI-TOF MS結果分析出最適合的孵育緩沖液為乙腈/水（50/50，1% TFA），洗脫液為10%NH3·H2O，在優(yōu)化條件下，對樣品進行二級質譜分析，經Mascot數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出四個磷酸化肽段。該方法簡單快速，能夠應用于不同乳制品中磷酸肽的檢測，同時對駱駝乳蛋白質組學分析具有重要的參考意義，同時也為加工駱駝乳相關的功能性食品奠定了理論基礎。

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Analysis and identification of the phosphopeptides in camel milk by MALDI-TOF MS

HUANG Xuan1，WANG Jun-ping1，2，WANG Jun-ying3，LIU Cui-cui1，WANG Shuo1，*
（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；3.Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

The MALDI-TOF MS-based method was establised for determining and identifing phosphopeptides in camel milk.The low abundance phosphopeptides of camel milk was enriched using commercial TiO2，and optimized the suitable adsorption-elution condition between the commercial TiO2and camel milk，incubation buffer：acetonitrile/water（50/50，v/v）+1% trifluoroacetic acid，eluent：aqueous ammonia（10%）.The obtained phosphopeptides solution was determined by MALDI-TOF MS method，and the data searching was carried out using Mascot database，four phosphopeptides was identified in the camel milk.This study provided a new idea for the phosphopeptides of different mammal milk determination and applied to the adulterated milk identification in the practical application.

MALDI-TOF MS；camel milk；enrichment；phosphopeptides

TS207.3

A

1002-0306（2016）08-0072-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.006

2015－09－10

黃漩（1986-），女，博士研究生，研究方向：食品安全檢測，E-mail：huangyukun609@163.com。

*通訊作者：王碩（1969-），男，教授，研究方向：食品安全，E-mail：s.wang@tust.edu.cn。

國家“863”高新技術項目（2012AA101604）；轉基因重大專項（2014ZX08012-001）。