楊毅，陸姍姍，劉萍，田蕾

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

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苦豆子賴氨酸脫羧酶基因克隆與表達(dá)分析

楊毅，陸姍姍，劉萍*，田蕾

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

賴氨酸脫羧酶(lysine decarboxylase，LDC)基因是苦豆子中氧化苦參堿(oxymatrine,OMA)生物合成的第一個關(guān)鍵酶基因。根據(jù)近緣物種苦參的賴氨酸脫羧酶基因設(shè)計特異引物，同源克隆法克隆了苦豆子賴氨酸脫羧酶基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列，全長1368 bp，命名為Sa-LDC，GenBank登錄號為KM249871。生物信息學(xué)分析表明Sa-LDC編碼區(qū)序列無內(nèi)含子，與苦參和狗苦參的LDC序列一致性均達(dá)到97%；屬于Ⅲ型5-磷酸吡哆醛依賴酶[type Ⅲ pyridoxal 5-phosphate (PLP)-dependent enzymes，PLPDE-Ⅲ]超基因家族，功能活躍。Sa-LDC編碼455個氨基酸殘基，其編碼的肽鏈相對分子質(zhì)量49.14 kD，理論等電點(diǎn)5.63，無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)；在其氨基酸序列中具有產(chǎn)喹諾里西啶生物堿的特征性保守位點(diǎn)Phe340；系統(tǒng)進(jìn)化樹將苦豆子與其他產(chǎn)喹諾里西啶類生物堿的植物聚為一類。qPCR和HPLC檢測顯示，苦豆子賴氨酸脫羧酶基因的表達(dá)和氧化苦參堿的積累均受干旱脅迫的影響，且基因的表達(dá)量與氧化苦參堿的積累呈正相關(guān)關(guān)系。

苦豆子；賴氨酸脫羧酶基因；基因克?。换虮磉_(dá)；氧化苦參堿

苦豆子(Sophoraalopecuriodes)是豆科槐屬多年生草本植物[1]，廣泛分布于寧夏、新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、西藏等的荒漠和半荒漠地區(qū)，由于其根莖繁殖力極強(qiáng)，根系發(fā)達(dá)，枝葉繁茂，在地表干沙層能抗風(fēng)蝕，是西北地區(qū)生態(tài)環(huán)境保護(hù)中優(yōu)良的固沙植物[2]。氧化苦參堿(oxymatrine，OMA)又稱苦參素，是苦豆子中重要的生物堿之一，不僅在抗肝損傷、抗腫瘤、抗心血管疾病等方面有良好的療效，還具有鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)和治療慢性乙型肝炎等多種功效[3]。

OMA屬于喹諾里西啶類生物堿(quinolizidine alkaloids，QAs)，賴氨酸脫羧酶(lysine decarboxylase，LDC)是QAs生物合成第一酶，它可催化賴氨酸脫羧生成戊二胺(尸胺)，3個戊二胺分子和4個丙酮酸鹽在17-氧基-鷹爪豆堿合酶(17-oxosparteine synthase)的作用下生成17-氧基-鷹爪豆堿(也稱金雀花堿，17-oxosparteine)和4個丙氨酸，17-氧基-鷹爪豆堿經(jīng)脫氫金雀花堿生成鷹爪豆堿，再經(jīng)一系列生化代謝最終轉(zhuǎn)化為OMA[4-7]。LDC作為喹諾里西啶生物合成途徑的第一個酶基因，在OMA生物合成過程中有著至關(guān)重要的作用。2011年Bunsupa等[8]對產(chǎn)QAs與不產(chǎn)QAs的兩種羽扇豆通過差異基因表達(dá)譜(differential gene expression profile)分析證明LDC的表達(dá)與植物合成QAs直接相關(guān)；2012年Bunsupa等[7]分別從苦參(Sophoraflavescens)、狗苦參(Echinosophorakoreensis)、羽扇豆(Lupinusangustifolius)、藍(lán)花贗靛(Baptisiaaustralis)及小葉野決明(Thermopsischinensis)中分離出LDC序列，并將其轉(zhuǎn)入煙草懸浮細(xì)胞和毛狀根中進(jìn)行功能驗證，同時明確產(chǎn)QAs的植物其LDC中均具有Phe340。杜次等[9]在蛇足石杉(Huperziaserrata)中克隆到2個序列一致性高達(dá)95.3%的LDC序列，通過原核表達(dá)均得到可催化賴氨酸脫羧形成尸胺的產(chǎn)物。由于苦豆子重要的生態(tài)和藥用價值，和其他產(chǎn)QAs的植物相比，對苦豆子LDC的研究目前還很少，而關(guān)于OMA生物合成與代謝途徑中關(guān)鍵基因及其調(diào)控機(jī)理更是知之甚少。鑒于此，本研究采用同源克隆法克隆苦豆子活性成分OMA生物合成關(guān)鍵酶基因LDC，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討PEG脅迫下苦豆子LDC表達(dá)與OMA含量變化的相互關(guān)系，為今后詳細(xì)研究苦豆子LDC的生物學(xué)功能和作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也為研究氧化苦參堿生物合成和代謝調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

苦豆子植株由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院李曉偉博士鑒定為Sophoraalopecuroides，莢果于2013年采于寧夏永寧縣楊和鄉(xiāng)(106.14° E，38.14° N)，標(biāo)本號為103，于室溫自然風(fēng)干后脫粒并精選，-20 ℃低溫保存。

1.2苦豆子LDC基因gDNA和cDNA全長序列克隆

采用改良的SDS(十二烷基磺酸鈉)法[10]提取gDNA。總RNA提取及cDNA第一鏈合成參照試劑盒說明書進(jìn)行。

參照NCBI已公布的苦豆子近緣物種苦參LDCcDNA序列設(shè)計特異性引物Sa-LDC-Pri(表1),分別以苦豆子gDNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物連接至PMD18-T載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌菌株TOP10,氨芐青霉素抗性平板篩選陽性克隆,陽性單克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1　用于基因克隆及熒光定量PCR的引物序列

1.3苦豆子LDC生物信息學(xué)分析

將測序獲得的賴氨酸脫羧酶基因序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST比對。采用MEGA 5.0 Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[11]， ExPASy-ProtParam tool進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析[12]，TMHMM分析跨膜結(jié)構(gòu)[13]，SOPMA在線軟件預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)[14]，PSORT在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測[15]，www.predictprotein.org在線網(wǎng)站預(yù)測蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)[16]，SignalP 4.1預(yù)測信號肽[17]，Swiss model構(gòu)建蛋白質(zhì)三維模型[18]。

1.4苦豆子植株的PEG脅迫、qPCR和OMA含量測定

選取大小均勻、飽滿、無蟲蛀的苦豆子種子，濃硫酸處理20 min，清水沖洗干凈后，置25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中萌動種子，待露白后播種于直徑40 cm的花盆中，自然條件下生長至幼苗約15 cm高，連根挖出徹底洗凈根部泥土，用吸水紙吸干表面水分后，將根系全部浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，20%和30%的PEG 6000溶液中以脅迫苦豆子植株，以去離子水為對照，每一處理3組重復(fù)。分別于0，1，4，8和24 h時采集葉片，一部分液氮速凍后-80 ℃保存用于qPCR，另一部分120 ℃殺青后烘干，用于測定OMA含量。

qPCR反應(yīng)在Stepone plus型熒光定量PCR儀(ABI)上進(jìn)行，以苦豆子Lectin序列為模板設(shè)計內(nèi)參引物L(fēng)ectin-pri，以測序獲得LDC序列設(shè)計熒光定量引物QLDC-pri(表1)，采用20 μL體系：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，40個循環(huán)。按照2-ΔΔCT法計算出基因的相對表達(dá)量，即ΔCt 目標(biāo)基因=Ct(LDC)-Ct(Lectin)；ΔΔCt(LDC)=處理組(ΔCtLDC)-對照組(ΔCtLDC)，相對表達(dá)量=2-ΔΔCT(LDC)[19]。

OMA提取和測定參照楊毅等[20]的方法。

1.5統(tǒng)計分析

利用DPS 6.0進(jìn)行方差分析，Excel作圖。

2　結(jié)果與分析

圖1　Sa-LDC基因gDNA和cDNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　The electrophoresis results of Sa-LDC genes　　　1，2分別為以苦豆子cDNA和gDNA為模板擴(kuò)增的賴氨酸脫羧酶基因； Marker：從上到下依次為2000，1000，750，500，250，100 bp。1: LDC fragment obtained from the template of cDNA; 2: LDC fragment obtained from the template of gDNA; M: 2000，1000，750，500，250，100 bp from top to bottom.

2.1苦豆子LDCgDNA和cDNA的克隆與生物信息學(xué)分析

2.1.1苦豆子LDC基因克隆及序列分析分別以苦豆子gDNA和cDNA為模板，利用特異性引物SaLDC-Pri進(jìn)行PCR擴(kuò)增，都獲得約1400 bp大小的條帶(圖1)。經(jīng)測序比對后發(fā)現(xiàn)，該基因gDNA和cDNA序列完全一致，編碼區(qū)全長1368 bp(圖2)，說明該基因無內(nèi)含子。將該編碼區(qū)序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST比對后發(fā)現(xiàn)，序列與狗苦參和苦參LDC序列一致性均達(dá)到97%，與小葉野決明和藍(lán)花贗靛LDC序列一致性達(dá)到86%，與羽扇豆LDC序列一致性達(dá)到82%，表明擴(kuò)增所得序列確實為苦豆子LDC編碼區(qū)序列。將序列提交至GenBank，命名為Sa-LDC，登錄號KM249871。

2.1.2Sa-LDC蛋白結(jié)構(gòu)分析通過對Sa-LDC開放閱讀框分析發(fā)現(xiàn)，該基因共編碼455個氨基酸殘基，Sa-LDC蛋白含PLPDE_Ⅲ_ODC、Orn_Arg_deC_N、LysA、PRK08961和PLN02537五個結(jié)構(gòu)功能域，屬于Ⅲ型5-磷酸吡哆醛依賴酶[type Ⅲ pyridoxal 5-phosphate (PLP)-dependent enzymes，PLPDE-Ⅲ]超基因家族；在該蛋白第75～405個氨基酸范圍內(nèi)，存在多個活性位點(diǎn)，推測該氨基酸序列范圍可能是Sa-LDC的功能區(qū)域。理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示Sa-LDC屬于水溶性蛋白，分子式為C2192H3416N574O658S25，分子量為49.14 kD，無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，理論等電點(diǎn)5.63，帶負(fù)電殘基(Asp+Glu)數(shù)49，帶正電殘基(Arg+Lys)數(shù)42，氨基酸整體帶負(fù)電,為酸性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)為41.92，是一個不穩(wěn)定蛋白。疏水系數(shù)-0.02，脂肪系數(shù)為81.08。其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(38.2%)和無規(guī)則卷曲(37.8%)構(gòu)成(圖3)。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示Sa-LDC蛋白最可能位于葉綠體中。由于該蛋白N端無信號肽剪切位點(diǎn)，推測其不屬于分泌蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中合成后不能進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，在Sa-LDC蛋白序列中找到產(chǎn)QAs植物的特征性保守位點(diǎn)Phe340。

圖2　Sa-LDC基因序列Fig.2　The sequence of Sa-LDC genes

圖3　賴氨酸脫羧酶蛋白結(jié)構(gòu)三維模型Fig.3　Three-dimensional model of Sa-LDC protein structure

2.1.3Sa-LDC氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將推導(dǎo)的氨基酸序列與NCBI上已公布的L/ODC蛋白進(jìn)行BLASTp同源性比對發(fā)現(xiàn)，Sa-LDC氨基酸序列與狗苦參和苦參的LDC氨基酸序列一致性高達(dá)97%；但與大豆(Glycinemax)LDC氨基酸序列一致性僅為77%。不同植物L(fēng)/ODC氨基酸序列在功能區(qū)域相對保守，差異主要存在于N-端和C-端。應(yīng)用Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，所有豆科植物被聚為一個大類，苦豆子與苦參遺傳距離最近，與百脈根(Lotusjaponicus)遺傳距離最遠(yuǎn)；所有產(chǎn)喹諾里西啶生物堿的植物聚為一類，其氨基酸序列中均有特征性保守位點(diǎn)Phe340；大豆和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)聚在一起，百脈根則與它們的遺傳距離較遠(yuǎn)，單獨(dú)分為一類(圖4)?？傮w上，系統(tǒng)進(jìn)化樹與傳統(tǒng)分類結(jié)果一致。

2.1.4Sa-LDC蛋白修飾位點(diǎn)分析蛋白質(zhì)翻譯后修飾會直接影響其多種屬性[21]。對Sa-LDC蛋白修飾位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白共含8種類型修飾位點(diǎn)，分別是N-糖基化位點(diǎn)、cAMP和cGMP依賴型蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白II磷酸化位點(diǎn)、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、N-豆蔻?；稽c(diǎn)、酰胺化位點(diǎn)以及磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)。

圖4　苦豆子Sa-LDC和L/ODC同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4　Phylogenetic tree estimated by the amino acid sequences of S. alopecuroides and other plant L/ODCs　粗線所示為產(chǎn)QAs植物；黑框所示為產(chǎn)QAs植物氨基酸序列特征性保守位點(diǎn)Phe340。Bold line indicates the QAs-producing plants； Black box indicates the conserved amino acid residue Phe340.

2.2PEG脅迫下苦豆子葉片中LDC表達(dá)量和OMA含量的動態(tài)變化

用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG溶液脅迫苦豆子植株根系，qPCR結(jié)果表明苦豆子葉片中LDC表達(dá)量在脅迫前處于較低的水平，對照組葉片LDC表達(dá)量在去離子水中隨時間延長呈上升趨勢；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的PEG脅迫下，葉片中LDC表達(dá)量在8 h時驟然升高，與0～4 h時的表達(dá)量差異顯著，是同時期對照組的1.6倍，脅迫前的110倍，隨后表達(dá)量開始下降，在脅迫結(jié)束時其基因表達(dá)量與脅迫前相當(dāng)；在20%的PEG脅迫下，苦豆子葉片LDC表達(dá)量在1 h時達(dá)到最高，是同時期對照組的27.5倍，脅迫前的343倍。隨脅迫時間延長，表達(dá)量下降，但在脅迫結(jié)束時其表達(dá)量仍然是脅迫前的21倍；在30%的PEG脅迫下，基因表達(dá)量一直處于較低水平(圖5A)。PEG脅迫也影響了苦豆子葉片中OMA的積累，使其含量發(fā)生變化。對照組中苦豆子葉片OMA含量在1 h時最低，隨后逐漸升高，8 h后與0 h葉片中OMA含量無顯著差異；在10%的PEG脅迫下，苦豆子葉片OMA含量在脅迫8 h時驟然上升，與1～4 h時的OMA含量差異顯著且高于同時期對照組的OMA含量；苦豆子葉片OMA積累對20%的PEG脅迫響應(yīng)迅速，脅迫1 h時OMA含量升至最高，隨后開始下降，在脅迫24 h時其含量與脅迫前無差異；30%的PEG脅迫顯著抑制葉片中OMA積累，從脅迫開始直到結(jié)束，葉片中OMA含量均顯著低于脅迫前(圖5B)。

圖5　PEG脅迫下苦豆子葉片中LDC表達(dá)量(A)和OMA含量(B)變化Fig.5　The LDC expression level (A) and OMA content (B) under PEG stress in S. alopecuroides leaves　不同小寫字母表示差異顯著；圖5A中縱坐標(biāo)為基因表達(dá)量的對數(shù)值。Different small letters indicate significant differences at 0.05 level； The y-coordinate is logarithm of gene expression level in Fig.5A.

3　討論

LDC作為QAs生物合成的第一個關(guān)鍵酶基因，在苦豆子OMA生物合成和代謝過程中有至關(guān)重要的作用。本研究首次獲得了苦豆子LDC編碼區(qū)序列，命名為Sa-LDC，GenBank登錄號KM249871。對推測的Sa-LDC蛋白序列分析表明該蛋白屬于Ⅲ型5-磷酸吡哆醛依賴酶超基因家族。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示該蛋白存在于葉綠體中，與Wink等[22]通過同位素示蹤法研究的結(jié)果一致。除L/ODC外，同屬該超基因家族的還有二氨基庚二酸脫羧酶(diaminopimelate decarboxylase，DapDC)、精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase，ADC)以及羧基降亞精胺脫羧酶(carboxynorspermidine decarboxylase，CANSDC)。該家族的酶主要在輔酶5-磷酸吡哆醛的參與下，催化聚胺或賴氨酸脫羧的生化反應(yīng)[23]。在Sa-LDC蛋白修飾位點(diǎn)中存在多個磷酸化位點(diǎn)和酰胺化位點(diǎn)，說明此蛋白主要由蛋白激酶和蛋白因子所激活以行使生化功能，極易被外界因素所調(diào)控。

BLASTp同源性比對表明Sa-LDC氨基酸序列與同是豆科槐屬的苦參和狗苦參親緣關(guān)系最近，說明在親緣關(guān)系相近的植物中LDC的保守性強(qiáng)，這與陳春艷等[24]在對甘肅紅豆草(Onobrychisviciaefoliacv. “Gansu”)無色花青素還原酶 LAR基因的同源性分析結(jié)論相一致。LDC的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明苦豆子與苦參、狗苦參、藍(lán)花贗靛、小葉野決明和羽扇豆這幾種產(chǎn)QAs的植物聚為一類，且其氨基酸序列中都具有共同的特征性保守位點(diǎn)Phe340，說明苦豆子的賴氨酸脫羧酶與這些植物的賴氨酸脫羧酶具有共同的起源。與Bunsupa等[25]研究結(jié)果所不同的是，本研究找到的Phe在氨基酸序列的第340位，而Bunsupa等[25]認(rèn)為在氨基酸序列的第344位。

生物堿在保護(hù)植物中有著特殊的作用，有研究表明在遇到重度脅迫和生物侵?jǐn)_時植物會瞬間大量合成生物堿[26-27]。Christiansen等[28]對3種窄葉羽扇豆3個不同生長階段的干旱脅迫研究認(rèn)為，干旱造成窄葉羽扇豆種子中生物總堿含量發(fā)生變化，其中營養(yǎng)生長階段的干旱脅迫促使其生物總堿含量上升；楊毅等[20]用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG脅迫剛萌動的苦豆子種子，發(fā)現(xiàn)輕度脅迫下子葉中OMA含量降低，但在重度脅迫下OMA含量又有所回升，且輕度和重度脅迫下OMA含量與LDC表達(dá)量的變化基本一致。本研究中苦豆子植株在10% PEG中脅迫8 h，葉片中LDC表達(dá)量突然升高，與之對應(yīng)的OMA含量也同時明顯上升；同樣，20%的PEG脅迫1 h時葉片中LDC表達(dá)量的升高也促使OMA含量增加，說明苦豆子LDC的表達(dá)受干旱脅迫的調(diào)控，輕度的干旱(PEG≤10%)脅迫需要較長時間才能誘導(dǎo)LDC表達(dá)，并促使OMA合成；但在中度干旱(10%

4　結(jié)論

本研究首次從苦豆子中克隆獲得LDC編碼區(qū)全長序列，共1368 bp，編碼區(qū)無內(nèi)含子，共編碼455個氨基酸殘基，生物信息學(xué)分析表明賴氨酸脫羧酶功能較為活躍，其氨基酸序列中具有產(chǎn)QAs的特征性保守位點(diǎn)Phe340，LDC的表達(dá)受干旱脅迫的影響，在一定程度上也影響OMA的積累。

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Cloning and expression analysis of a lysine decarboxylase gene inSophoraalopecuroides

YANG Yi, LU Shan-Shan, LIU Ping*, TIAN Lei

CollegeofAgronomy,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China

In the biochemical metabolic processes ofSophoraalopecuroides, a lysine decarboxylase (LDC) gene is one of the key enzyme genes involved in the process of Oxymatrine biosynthesis. In the present study, the full length of the LDC coding sequence inS.alopecuroideswas cloned using a pair of specific primers designed based on theLDCsequence ofSophoraflavescensand was named Sa-LDC(gene bank accession number: KM249871). Sa-LDCbelongs to the Type Ⅲ Pyridoxal 5-phosphate (PLP)-Dependent enzyme supergene family, is comprised of a 1368 bps open reading frame (ORF) without intron, and has 97% identity with theLDCofEchinosophorakoreensisandS.flavescensin GeneBank. Its nucleotide sequence encodes 455 amino acid residues whose putative protein had a relative molecular mass of 49.14 kD and the theoretical isoelectric point of 5.63 without signal peptide and transmembrane structure. Interestingly, the deduced amino acid sequence of Sa-LDChad the conserved amino acid residue (Phe340) in quinolizidine alkaloid producing plants. Therefore, theS.alopecuroidesand other quinolizidine alkaloid producing plants were placed into a single group in the phylogenetic tree. In addition, the real time fluorescence quantitative PCR (qPCR) and high performance liquid chromatography (HPLC) results showed that both theLDCexpression level and oxymatrine content were influenced by polyethylene glycol (PEG) stress, and thatLDCexpression and oxymatrine accumulation inS.alopecuroideswere correlated.

Sophoraalopecuroides; lysine decarboxylase gene; gene clone; gene expression; oxymatrine

10.11686/cyxb2015477http://cyxb.lzu.edu.cn

楊毅, 陸姍姍, 劉萍, 田蕾. 苦豆子賴氨酸脫羧酶基因克隆與表達(dá)分析. 草業(yè)學(xué)報, 2016, 25(8): 128-135.

YANG Yi, LU Shan-Shan, LIU Ping, TIAN Lei. Cloning and expression analysis of a lysine decarboxylase gene inSophoraalopecuroides. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(8): 128-135.

2015-10-12；改回日期：2016-01-04

寧夏回族自治區(qū)自然科學(xué)基金(NZ14033)資助。

楊毅(1989-)，男，四川內(nèi)江人，碩士。E-mail：kismet.young@163.com

Corresponding author. E-mail: liupnxdx@126.com