王維茜，鄧潔紅，2，*，田小燕，劉永紅（.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙4028；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙4028；.湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙4027）

黃酮對(duì)刺葡萄花色苷輔色穩(wěn)定化效果的研究

王維茜1，鄧潔紅1，2，*，田小燕1，劉永紅3
（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；
2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410127）

研究了幾種黃酮類物質(zhì)對(duì)刺葡萄花色苷的輔色作用，并研究了槲皮素、黃芩素和蘆丁對(duì)刺葡萄花色苷熱穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：槲皮素對(duì)刺葡萄花色苷的輔色效果最為顯著（p＜0.05），其次是黃芩素和蘆丁，濃度為0.1 mmol·L-1時(shí)單位濃度輔色效果最佳；槲皮素和黃芩素輔色時(shí)，在pH2.0處，輔色效果最好，而蘆丁輔色時(shí)，最佳pH為3.0。加入槲皮素、黃芩素、蘆丁后，刺葡萄花色苷的降解速率常數(shù)（k）皆顯著小于對(duì)照組，半衰期（t1/2）均顯著高于對(duì)照組（p＜0.05）。經(jīng)槲皮素、黃芩素、蘆丁輔色后刺葡萄花色苷的活化能（Ea）分別為88.48、91.67、83.62 kJ/mol，顯著（p＜0.05）高于對(duì)照組的74.51 kJ/mol，說(shuō)明加入槲皮素、黃芩素、蘆丁能提高刺葡萄花色苷的熱穩(wěn)定性。

刺葡萄花色苷，黃酮，輔色，熱穩(wěn)定性

花色苷作為一種天然色素安全性較高，具有特殊的芳香氣味和一定的營(yíng)養(yǎng)和藥理功效，且資源豐富，是各國(guó)公認(rèn)的替代合成食用色素的最理想的天然食用色素［1］。但花色苷穩(wěn)定性較差，易受到親核試劑的進(jìn)攻而水解，影響花色苷穩(wěn)定性的主要因素有pH、溫度、濃度、結(jié)構(gòu)、光、氧氣、抗壞血酸、二氧化硫和輔色劑等［2-4］，使其在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中受到限制。輔色作用包括通過(guò)共價(jià)鍵方式連接形成的分子內(nèi)輔色和以范德華力、疏水及離子相互作用為主要驅(qū)動(dòng)力的分子間輔色［5-6］。輔色法是提高花色苷穩(wěn)定性的一種經(jīng)濟(jì)、有效的方法，通過(guò)在花色苷溶液中添加氨基酸、生物堿、類黃酮、有機(jī)酸等輔色劑來(lái)提高其穩(wěn)定性［7］。與未添加輔色劑的花色苷溶液相比，輔色作用后的花色苷溶液會(huì)出現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)和吸光度值增加的現(xiàn)象，即紅移現(xiàn)象和增色效應(yīng)［8］。王萌等［9］研究發(fā)現(xiàn)DL-蘋果酸、檸檬酸和酒石酸都不同程度提高了紫甘薯花色苷的熱穩(wěn)定性，而能與大多數(shù)色素有效輔色的阿魏酸和咖啡酸卻對(duì)紫甘薯花色苷熱穩(wěn)定性不利，可能與紫甘薯花色苷的結(jié)構(gòu)有關(guān)。李永強(qiáng)等［10］以浸泡型楊梅酒為模型，證明了在不同貯藏時(shí)期，黃酮含量與色調(diào)、最大吸收波長(zhǎng)和花色苷含量呈極顯著正相關(guān)。

本研究以純化的刺葡萄花色苷（SGA）為試材，研究黃酮類物質(zhì)與刺葡萄花色苷分子之間發(fā)生輔色作用的條件，比較不同黃酮類物質(zhì)對(duì)刺葡萄花色苷的輔色效果，探究黃酮對(duì)刺葡萄花色苷熱降解規(guī)律，為實(shí)現(xiàn)葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中花色苷的穩(wěn)定化提供理論和應(yīng)用借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺葡萄果皮 購(gòu)于湖南省芷江縣，洗凈，晾干，手工剝皮，-40℃條件下凍藏備用；陳皮素、苦丁、槲皮素、黃芩素、葛根素、大豆素 西安旭煌生物技術(shù)有限公司；兒茶素、異甘草素 澤朗植提CPE?；檸檬酸、檸檬酸鈉、無(wú)水乙醇、鹽酸、冰醋酸、氯化鉀 均為國(guó)藥集團(tuán)，分析純。

UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) SHIMADZU；AEY-220型電子天平 湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學(xué)儀器；PHS-3C型pH計(jì) 上海精科；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；SHB-ⅢT循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 刺葡萄花色苷的制備［11］稱取100 g刺葡萄皮于燒杯中，以1∶6的料液比加入70%酸化乙醇（含0.03%鹽酸），30℃條件下避光浸提24 h，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（溫度≤40℃）回收乙醇，3000 r/min離心20 min，加水稀釋10倍后為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用色素液，避光備用。

1.2.2 黃酮種類對(duì)刺葡萄花色苷輔色效果的影響 取5 mL色素液于具塞比色管中，分別用濃度為1.0 mmol·L-1的黃酮乙醇溶液（陳皮素、蘆丁、槲皮素、黃芩素、葛根素、大豆素、兒茶素和異甘草素）定容至20 mL，混勻，避光靜置24 h后，以5 mL色素液用乙醇定容至20 mL為對(duì)照，掃描450～600 nm范圍內(nèi)可見(jiàn)吸收光譜，記錄最大吸收波長(zhǎng)（λmax）和最大吸光度值（Amax），以每毫摩爾黃酮引起的刺葡萄色素溶液吸光度值的增加量（I）來(lái)考察黃酮輔色效果［12］。

式中：Amax為加入黃酮后色素溶液的最大吸光度值；A0為對(duì)照組色素溶液的最大吸光值；C為黃酮類物質(zhì)的終濃度（mmol·L-1）。

1.2.3 黃酮濃度對(duì)刺葡萄花色苷輔色效果的影響 取5 mL色素液于具塞比色管中，分別加入一定量槲皮素、黃芩素、蘆丁，用pH 3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液定容至20 mL，使溶液體系中槲皮素、黃芩素、蘆丁的濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1。避光靜置24 h后，以5 mL色素液用pH3.0的緩沖液定容至20 mL為對(duì)照，測(cè)定450～600 nm范圍內(nèi)最大吸收波長(zhǎng)λmax和最大吸光值A(chǔ)max，計(jì)算輔色效果（I值）。

1.2.4 pH對(duì)黃酮輔色刺葡萄花色苷效果的影響 取10 mL色素液于具塞比色管中，分別加入一定量槲皮素、黃芩素、蘆丁，用pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的緩沖溶液（pH1.0為KCl-HCl緩沖液，pH2.0為磷酸鹽緩沖液，pH3.0～6.0為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液）分別定容至50 mL，使黃酮的終濃度為0.1 mmol·L-1。避光靜置24 h后，以色素液中加入等量緩沖液為對(duì)照，測(cè)定λmax和Amax，計(jì)算其與對(duì)照的差值Δλmax和ΔAmax，并計(jì)算輔色效果（I值）。

1.2.5 黃酮輔色對(duì)刺葡萄花色苷熱穩(wěn)定性的影響 取10 mL色素液于具塞比色管中，分別加入一定量槲皮素、黃芩素、蘆丁，用pH3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液定容至100 mL，使色素液中各黃酮類物質(zhì)的濃度均為0.1 mmol·L-1。取加入槲皮素、黃芩素、蘆丁的色素液10 mL各四份，分別置于20、40、60、80℃的水浴中避光加熱，每隔2 h取樣置于冰浴中迅速冷卻，測(cè)定吸光值，并計(jì)算花色苷保存率。

花色苷保存率（%）=（Ax/A0）×100

其中，A0、Ax分別為520 nm處對(duì)照組的吸光度值與黃酮輔色后的吸光度值。

對(duì)刺葡萄花色苷的熱處理進(jìn)行熱降解動(dòng)力學(xué)研究，計(jì)算相應(yīng)的熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)（反應(yīng)速率常數(shù)k、半衰期t1/2和活化能Ea），連續(xù)測(cè)12 h［13］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮種類對(duì)刺葡萄花色苷輔色效果的影響

表1 黃酮對(duì)刺葡萄花色苷的輔色效果Table1 Copigmentation effect of flavonoids on SGA

由表1可見(jiàn)，黃酮類物質(zhì)均能在一定程度上增加刺葡萄花色苷的最大吸光度值，最大吸收波長(zhǎng)均發(fā)生了紅移（1.0～2.5 nm），但影響不大。黃酮類物質(zhì)均能顯著增加刺葡萄花色苷的最大吸光度值，但添加槲皮素、黃芩素和蘆丁后的刺葡萄花色苷溶液的吸光度值與對(duì)照組相比，差異極顯著（p＜0.01），增色效果更好，其中槲皮素對(duì)刺葡萄花色苷的輔色效果最為顯著，其次是黃芩素和蘆?。╬＜0.05）。因此選擇槲皮素、黃芩素和蘆丁作為輔色劑進(jìn)一步研究。

2.2 黃酮濃度對(duì)刺葡萄花色苷輔色效果的影響

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，添加黃酮輔色后，刺葡萄花色苷溶液的最大吸收波長(zhǎng)均發(fā)生了紅移（1.0～2.5 nm），但紅移程度并未與輔色劑濃度呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系。由圖1～圖3可知，隨槲皮素、黃芩素和蘆丁濃度的增大，刺葡萄花色苷溶液的最大吸光度值逐漸增大，具有增色效應(yīng)，當(dāng)黃酮濃度增加到0.1 mmol·L-1時(shí)I值達(dá)到最大，輔色效果最好，此時(shí)溶液吸光度值也接近最大值。黃酮濃度為0.2 mmol·L-1吸光度值達(dá)到最大值，但輔色效果急劇減弱，原因可能是黃酮與花色苷分子結(jié)合不緊密，部分輔色基團(tuán)的脫落導(dǎo)致吸光度值未持續(xù)升高，增加黃酮濃度，輔色基團(tuán)與花色苷分子繼續(xù)結(jié)合，但由于黃酮濃度為0.2 mmol·L-1時(shí)刺葡萄花色苷溶液已經(jīng)完全輔色，故繼續(xù)增加黃酮濃度對(duì)增色無(wú)顯著作用。根據(jù)不同濃度黃酮對(duì)刺葡萄花色苷的增色效果和節(jié)約試劑成本考慮，槲皮素、黃芩素和蘆丁均選擇0.1 mmol·L-1濃度做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 槲皮素對(duì)刺葡萄花色苷的輔色效果Fig.1 Copigmentation effect of quercetin on SGA

圖2 黃芩素對(duì)刺葡萄花色苷的輔色效果Fig.2 Copigmentation effect of baicalein on SGA

圖3 蘆丁對(duì)刺葡萄花色苷的輔色效果Fig.3 Copigmentation effect of rutin on SGA

2.3 pH對(duì)刺葡萄花色苷輔色效果的影響

表2 pH對(duì)槲皮素輔色效果的影響Table2 Effect of pH on the copigmentation effect of quercetin on anthocyanins

表3 pH對(duì)黃芩素輔色效果的影響Table3 Effect of pH on the copigmentation effect of baicalein on anthocyanins

表4 pH對(duì)蘆丁輔色效果的影響Table4 Effect of pH on the copigmentation effect of rutin on anthocyanins

pH是影響花色苷分子存在形式的主要因素，一般輔色劑在酸性條件下能與花色苷形成增色團(tuán)而增強(qiáng)花色苷溶液的顏色及穩(wěn)定性。由表2～表4可知，槲皮素、黃芩素和蘆丁對(duì)刺葡萄花色苷發(fā)生了輔色作用，△λmax和△Amax有不同程度的提高，輔色效果均隨pH的增加先增大后逐漸減小，pH的變化對(duì)黃酮類物質(zhì)的輔色效果影響較大。槲皮素和黃芩素輔色時(shí)，在pH2.0處，I值達(dá)到最大，輔色效果最好；而蘆丁輔色時(shí)，則在pH3.0處，I值達(dá)到最大。原因可能是pH＜1.0時(shí)，花色苷以黃鹽陽(yáng)離子的形式存在與輔色劑發(fā)生作用，而pH＞2.0時(shí)，輔色劑能同時(shí)與花色苷的黃鹽陽(yáng)離子和醌基形式同時(shí)作用，且有研究表明［14］，花色苷以醌堿形式存在時(shí)與輔色劑相互作用，輔色效果更強(qiáng)。

2.4 黃酮對(duì)刺葡萄花色苷熱穩(wěn)定性的影響

圖4 黃酮對(duì)刺葡萄花色苷熱穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of flavonoids on thermal stability of VSA

由圖4可知，20℃時(shí)，對(duì)照組刺葡萄花色苷的保存率隨時(shí)間的延長(zhǎng)有小幅度下降，而輔色后花色苷溶液由于增色效應(yīng)保存率在6 h內(nèi)小幅上升，然后基本穩(wěn)定，觀察期內(nèi)（12 h）未發(fā)現(xiàn)花色苷降解現(xiàn)象，故未計(jì)算20℃時(shí)輔色條件下的熱降解參數(shù)。在40、60、80℃加熱過(guò)程中，黃酮輔色后的刺葡萄花色苷保存率顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），這表明在加熱條件下，黃酮對(duì)花色苷的輔色效應(yīng)仍然存在，輔色作用可以提高花色苷的熱穩(wěn)定性。刺葡萄花色苷溶液本身及其輔色后的花色苷溶液保存率隨加熱溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。經(jīng)槲皮素、黃芩素、蘆丁輔色后的刺葡萄花色苷溶液80℃加熱12 h，保存率與加熱前相比，分別降低了30.87%、29.00%和35.31%，而對(duì)照組刺葡萄花色苷保存率降低了49.64%，經(jīng)3種黃酮輔色后刺葡萄花色苷的熱穩(wěn)定性顯著提高（p＜0.05）。

研究表明，加入黃酮后，刺葡萄花色苷的熱降解符合一級(jí)熱降解動(dòng)力學(xué)［15］。由表5可知，加入槲皮素、黃芩素、蘆丁后，刺葡萄花色苷的速率常數(shù)（k）皆顯著小于對(duì)照組，半衰期（t1/2）都顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），如80℃條件下，對(duì)照組的半衰期為12.12 h，槲皮素、黃芩素、蘆丁輔色后刺葡萄花色苷的半衰期分別為22.53、24.29、19.10 h，說(shuō)明加入槲皮素、黃芩素、蘆丁能提高刺葡萄花色苷的熱穩(wěn)定性。對(duì)照組刺葡萄花色苷的活化能（Ea）為74.51 kJ/mol，槲皮素、黃芩素、蘆丁輔色后刺葡萄花色苷的活化能分別為88.48、91.67、83.62 kJ/mol，其中黃芩素活化能相比對(duì)照組提高23.03%，說(shuō)明加入黃酮輔色后，刺葡萄花色苷對(duì)溫度的敏感度降低。槲皮素、黃芩素、蘆丁有可能作為輔色劑運(yùn)用于刺葡萄花色苷溶液的熱處理護(hù)色過(guò)程中。

表5 黃酮對(duì)刺葡萄花色苷熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table5 Kinetics parameters for the thermal degradation of SGA with flavonoids

3 討論與結(jié)論

8 種黃酮類物質(zhì)均能顯著增加刺葡萄花色苷的最大吸光度值，但添加槲皮素、黃芩素和蘆丁后的刺葡萄花色苷溶液的最大吸光度值與對(duì)照組相比，差異極顯著，增色效果好，其中槲皮素對(duì)刺葡萄花色苷的輔色效果最為顯著，其次是黃芩素和蘆丁。

對(duì)于槲皮素、黃芩素和蘆丁3種輔色劑，當(dāng)濃度為0.2 mmol·L-1時(shí)刺葡萄花色苷溶液已經(jīng)完全輔色，繼續(xù)增加黃酮濃度對(duì)增色無(wú)顯著作用；槲皮素和黃芩素輔色時(shí)，在pH2.0處，輔色效果最好，而蘆丁輔色時(shí)，最佳pH為3.0；3種黃酮最大單位濃度輔色效果發(fā)生在0.1 mmol·L-1時(shí)。

添加槲皮素、黃芩素和蘆丁，可以提高刺葡萄花色苷的活化能，延長(zhǎng)其半衰期，從而提高刺葡萄花色苷的熱穩(wěn)定性。與未添加黃酮相比，0.1 mmol·L-1槲皮素、黃芩素和蘆丁分別使刺葡萄花色苷的活化能（74.51 kJ/mol）提高至88.48、91.67、83.62 kJ/mol，但其輔色作用的機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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Study on copigmentation effect and stability of flavonoids on spine grape anthocyanins

WANG Wei-qian1，DENG Jie-hong1，2，*，TIAN Xiao-yan1，LIU Yong-hong3
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Key Laboratory of Food Science and Biological Technology of Hunan Province，Changsha 410128，China；3.Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic，Changsha 410127，China）

The copigmentation was studied on the spine grape anthocyanins by different flavonoids.The effects of quercetin，baicalein and rutin on the thermal stability of spine grape anthocyanins were also investigated.The results showed that the most significant copigment was quercetin（p＜0.05），followed by baicalein and rutin，and the best concentration of copigment was 0.1 mmol/L-1.Quercetin and baicalein had the best copigmentation effects at pH2.0，while rutin at pH3.0.The degradation rate（k）of spine grape anthocyanins decreased after adding quercetin，baicalein and rutin，and the half-life（t1/2）were improved（p＜0.05）.The activation energy（Ea）of quercetin，baicalein and rutin were 88.48，91.67 and 83.62 kJ/mol，respectively，all significantly（p＜0.05）higher than that of the control group which was 74.51 kJ/mol.The results indicated that quercetin，baicalein and rutin could improve the thermal stability of spine grape anthocyanins.

spine grape anthocyanins（SGA）；flavonoids；copigmentation；thermal stability

TS261.4

A

1002-0306（2016）02-0318-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.055

2015－07－07

王維茜（1990-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程，E-mail：1731686696@qq.com。

*通訊作者：鄧潔紅（1967-），女，教授，研究方向：園藝產(chǎn)品深加工理論與技術(shù)，E-mail：hongjiedeng@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31271836）；湖南省教育廳研究生科研創(chuàng)新課題（CX2015B264）。