葉芝紅，趙 艷，朱艷萍，鄭國(guó)棟（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取平臥菊三七三萜的工藝研究

葉芝紅，趙 艷，朱艷萍，鄭國(guó)棟*
（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

本文研究了用微波輔助提取平臥菊三七三萜的工藝?？疾煲掖紳舛?、微波時(shí)間、微波功率、提取溫度和料液比等因素對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法和響應(yīng)面分析法，確定其最佳提取工藝條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度90%和微波功率600 W時(shí)，微波輔助提取平臥菊三七三萜的最佳提取條件為：微波時(shí)間8.6 min、提取溫度57.7℃、料液比1∶33 g/mL。在此條件下平臥菊三七三萜的提取率為2.13%，與模型預(yù)測(cè)值2.14%之間具有良好的擬合性。

平臥菊三七，三萜，微波輔助提取，響應(yīng)面優(yōu)化

平臥菊三七（Gynura procumbens）是一種多年生菊科三七屬植物，又名續(xù)命草、神仙草，生于林間溪旁坡地砂質(zhì)土上，攀援于灌木或喬木上，主要分布于東南亞及我國(guó)南部和西南部地區(qū)［1］。2012年5月平臥菊三七被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源普通食品，近年來在江西省靖安、豐城和都昌等地通過無性繁殖等技術(shù)進(jìn)行了大面積人工栽培，是一種比較容易開發(fā)和應(yīng)用潛力很大的食物。三萜化合物多數(shù)是一類基本母核由30個(gè)碳原子組成的萜類化合物，其結(jié)構(gòu)是由六個(gè)異戊二烯單體聚合而成。三萜化合物在自然界種類繁多，分布廣泛，大多為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜，少數(shù)有鏈狀、單環(huán)和三環(huán)等結(jié)構(gòu)［2］。三萜化合物具有抗癌、抑菌、抗腫瘤、降糖、降脂等廣泛的生理活性［3-7］。

研究表明平臥菊三七含有豐富的黃酮類、多糖類、綠原酸、多不飽和脂肪酸等多種生物功能活性因子［8-10］，國(guó)內(nèi)外藥理研究表明其及其粗提物具有降壓、降糖、降脂、抗菌等功效［11-14］。然而平臥菊三七提取三萜還未見報(bào)道，本研究以平臥菊三七為原料，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析法對(duì)微波輔助提取三萜化合物工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得較高的提取得率，為后續(xù)平臥菊三七活性物質(zhì)的研究和利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平臥菊三七 采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥園，清洗曬干粉碎過60目篩；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品 成都曼思特生物科技有限公司；無水乙醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸等試劑 均為分析純級(jí)。

XH-100B電腦微波催化合成萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；V5600型可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；TDL-5-A低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-60數(shù)顯恒溫磁力攪拌循環(huán)水箱 常州市國(guó)華電力儀表設(shè)備有限公司；JSP-200粉碎機(jī) 浙江省永康市金穗機(jī)制造廠；QT-2漩渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照孟憲軍［15］的方法。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過程如下：稱取一定量的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解后配成0.15 mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確吸取溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL，分別加入試管中，首先將所有試管置于水浴鍋中加熱揮盡乙醇溶劑，然后分別加入新制的5%香草醛-冰乙酸0.40 mL和高氯酸1.0 mL，利用渦流混合器迅速混勻后將試管置于60℃水浴中加熱15 min，取出流水冷卻至室溫，加5.0 mL冰醋酸，迅速混勻溶液，靜置15 min，在547 nm處測(cè)定吸光值，以吸光度為縱坐標(biāo)，齊墩果酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 平臥菊三七三萜類化合物提取 稱取平臥菊三七粉末1 g，加入一定濃度的乙醇溶液提取劑，在一定的溫度、一定提取時(shí)間和一定的微波功率條件下進(jìn)行微波輔助提取，將不同條件下處理得到的提取液進(jìn)行離心（3500 r/min，15min），得到平臥菊三七三萜的待測(cè)液，每份樣液分別取上清液0.20 mL置于試管中，在恒溫水浴鍋中沸水浴揮干溶劑，然后分別加入新制的5%香草醛-冰乙酸0.40 mL和高氯酸1.0 mL，利用渦流混合器迅速混勻后將試管置于60℃水浴中加熱15 min，取出流水冷卻至室溫，加5.0 mL冰醋酸，迅速混勻溶液，靜置15 min，在547 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算平臥菊三七三萜的提取得率，計(jì)算公式如下：

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以平臥菊三七三萜提取得率為指標(biāo)，在固定其他實(shí)驗(yàn)條件的情況下，分別考察乙醇濃度、微波時(shí)間、微波功率、提取溫度和料液比對(duì)三萜提取得率的影響。

1.2.3.1 乙醇濃度對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響 按1.2.2的操作方法，在微波時(shí)間8 min，微波功率600 W，提取溫度60℃，料液比1∶30 g/mL的條件下，分別考察乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%、95%對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響。

1.2.3.2 微波時(shí)間對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響 按1.2.2的操作方法，在乙醇濃度90%，微波功率600 W，提取溫度60℃，料液比1∶30 g/mL的條件下，分別考察微波時(shí)間為2、4、6、8、10、12 min對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響。

1.2.3.3 微波功率對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響 按1.2.2的操作方法，在乙醇濃度90%，微波時(shí)間8 min，提取溫度60℃，料液比1∶30 g/mL的條件下，分別考察微波功率為300、400、500、600、700、800 W對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響。

1.2.3.4 提取溫度對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響 按1.2.2的操作方法，在乙醇濃度90%，微波時(shí)間8 min，微波功率600 W，料液比1∶30 g/mL的條件下，分別考察提取溫度為30、40、50、60、70、80℃對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響。

1.2.3.5 料液比對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響

按1.2.2的操作方法，在乙醇濃度90%，微波時(shí)間8 min，微波功率600 W，提取溫度60℃的條件下，分別考察料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化平臥菊三七三萜提取實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，選擇微波時(shí)間、提取溫度和料液比為自變量，運(yùn)用Design Expert 6.0.1軟件按照Box-Behnken設(shè)計(jì)方法進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)曲面法分析，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，建立二次響應(yīng)回歸模型，擬合二次回歸方程，得到微波輔助提取三萜的最佳工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1。

表1 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table1 Factors and levels of the response surface methodology

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素中均取3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值進(jìn)行分析作圖，采用OriginPro 8.5軟件作圖；響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)用Design-expert 6.0.1軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中齊墩果酸的質(zhì)量與吸光度擬合的回歸方程：A=0.0083m+0.0057，R2=0.9993。結(jié)果表明，齊墩果酸在質(zhì)量為0.015～0.105 mg時(shí)與其吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 乙醇濃度對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響

由圖1可知，隨著乙醇濃度的升高，三萜的提取得率逐漸增加后降低，當(dāng)90%時(shí)，三萜得率最高，根據(jù)極性的相似相容原理，表明在90%的乙醇溶液極性是最適合提取，且提取效果最好。

2.2.2 微波時(shí)間對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響

由圖2可知，在微波時(shí)間2～8 min間，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)三萜的提取得率增大；在8 min后，提取得率迅速下降。原因可能是當(dāng)微波時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，會(huì)造成三萜結(jié)構(gòu)的破壞或者是其活性成分的損失因而造成三萜得率的下降［16］，因此選取的最佳微波時(shí)間8 min。

圖1 乙醇濃度對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

圖2 微波時(shí)間對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響Fig.2 Effect of microwave time on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

2.2.3 微波功率對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響由圖3可知，隨著微波功率的升高，三萜的提取得率逐漸提高，當(dāng)微波功率大于600 W后其上升的幅度較小，從提取效果和后續(xù)處理能耗等方面考慮，選取微波功率600 W為宜。

圖3 微波功率對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

2.2.4 提取溫度對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響

由圖4可知，不同的提取溫度對(duì)三萜提取得率的影響不同，三萜的提取得率隨著溫度的升高先增大后減小，當(dāng)溫度為60℃時(shí)提取得率最大。所以提取溫度為60℃提取效果最好。

圖4 提取溫度對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

2.2.5 料液比對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響

由圖5可知，三萜的提取得率隨著料液比的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在1∶30 g/mL時(shí)達(dá)到最大值，這主要是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)當(dāng)溶液體積增大時(shí)，三萜溶解的更多。但是當(dāng)溶劑含量過大時(shí)，溶劑對(duì)微波的能量吸收增加，導(dǎo)致細(xì)胞液對(duì)微波能量的吸收減少，造成細(xì)胞破壁不完全，細(xì)胞內(nèi)容物質(zhì)不能充分溶出，從而使其含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖5 料液比對(duì)平臥菊三七三萜提取得率的影響Fig.5 Effect of different soild-liquid ratio on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 建立模型 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken組合設(shè)計(jì)原理，以三萜提取得率為響應(yīng)值（Y），利用Design Expert 6.0.1軟件設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，對(duì)三萜的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，共進(jìn)行17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中包含12個(gè)析因點(diǎn)和5個(gè)零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，12個(gè)析因點(diǎn)實(shí)驗(yàn)用以考察微波時(shí)間、提取溫度、料液比3個(gè)因素對(duì)微波提取三萜含量的影響是否顯著，5次零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)用作誤差估計(jì)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

2.3.2 方差分析與顯著性檢驗(yàn) 利用軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后得到模型的二次多項(xiàng)式回歸方程如下：

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table2 Test design and results of RSM

表3 方差分析與顯著性檢驗(yàn)Table3 The variance analysis and significance test

從表3回歸方差分析結(jié)果表明，響應(yīng)面的回歸模型極顯著（p＜0.0001）；模型的失擬項(xiàng)不顯著（p= 0.4351＞0.05），說明該模型對(duì)本實(shí)驗(yàn)擬合較好。從表3還可以看出因素一次項(xiàng)X1、X2、X3和二次項(xiàng)X、X、X即微波時(shí)間、提取溫度和料液比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響極顯著（p＜0.05），而各因素交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著（p＞0.05），即微波時(shí)間、提取溫度和料液比之間交互作用不顯著。

2.3.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖，分析微波時(shí)間、提取溫度和料液比等因素及其交互作用對(duì)微波輔助提取三萜得率的影響。結(jié)果見圖6～圖8。

圖6 三萜提取得率=f（X1，X2）響應(yīng)曲面圖（X3=1∶30 g/mL）Fig.6 The yield of triterpenoids in Gynura procumbens=f（X1，X2）response surface plot（X3=1∶30 g/mL）

圖7 三萜提取得率=f（X1，X3）響應(yīng)曲面圖（X2=60℃）Fig.7 The yield of triterpenoids in Gynura procumbens=f（X1，X3）tesponse surface plot（X2=60℃）

圖8 三萜提取得率=f（X2，X3）響應(yīng)曲面圖及等高線圖（X1=8 min）Fig.8 The yield of triterpenoids in Gynura procumbens=f（X2，X3）response surface plot（X1=8 min）

通過響應(yīng)面的坡度陡峭程度和等高線圖橢圓形狀可以直觀反映出兩個(gè)因素交互作用的強(qiáng)弱程度，如果響應(yīng)面坡度相對(duì)平緩說明因素間的交互效應(yīng)弱，即當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件改變時(shí)其對(duì)響應(yīng)值影響不大；反之，如果響應(yīng)面坡度非常陡峭說明因素間的交互作用強(qiáng)，即當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件有變異時(shí)響應(yīng)值會(huì)差異較大。等高線呈橢圓形表示兩個(gè)因素交互作用顯著，而等高線接近圓形表示交互作用不顯著。故由圖6～圖8可知，微波時(shí)間和提取溫度、微波時(shí)間和料液比以及提取溫度和料液比的交互作用都不顯著，與上述方差分析和顯著性檢驗(yàn)相符。

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過Design Expert 6.0.1軟件對(duì)優(yōu)化后的回歸方程分析，在各個(gè)實(shí)驗(yàn)因素水平范圍內(nèi)微波輔助提取三萜的最佳參數(shù)為：微波時(shí)間8.59 min、提取溫度57.64℃、料液比1∶32.78 g/mL，在此最佳工藝條件下平臥菊三七三萜的最大提取得率為2.14%。

為了驗(yàn)證回歸模型的有效性，結(jié)合實(shí)驗(yàn)所得的最佳工藝條件和實(shí)際操作的可行性，選擇在微波時(shí)間8.6 min，提取溫度57.7℃，料液比1∶33 g/mL的條件下，進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，分別是2.13%、2.12%、2.14%，實(shí)際平均得率為2.13%，與預(yù)測(cè)值2.14%較接近。結(jié)果表明該模型是合理有效的，微波輔助提取有效的對(duì)三萜提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

3 結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上以三萜的提取得率為衡量指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法研究微波輔助提取三萜的工藝參數(shù)，得到最佳工藝條件為微波時(shí)間8.6 min，提取溫度57.7℃，料液比1∶33 g/mL，在此條件下平臥菊三七三萜的平均提取率為2.13%。

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Optimization of microwave-assisted extraction of triterpenoids from Gynura procumbens by response surface methodology

YE Zhi-hong，ZHAO Yan，ZHU Yan-ping，ZHENG Guo-dong*
（Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food，College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

To optimize technological parameters for mircrowave-assisted extraction yield of total triterpenoids from Gynura procumbens.The experiments investigated the effects of extraction，such as ethanol concentration，extraction time，microwave power，temperature，and ratio of solid to liquid.Further，the experiments were optimized using a Box-Behnken method of test design and response surface methodology on the basis of the single factor experiment.When the ethanol concentration was 90%and microwave power was 600 W，the optimal extraction conditions were as follows:extraction time was 8.6 min，temperature was 57.7℃and ratio of solid to liquid was 1∶33 g/mL.Under these conditions，the extraction yield of total triterpenoids from Gynura procumbens was up to 2.13%，which was well matched with predicted yield 2.14%.

Gynura procumbens；triterpenoids；mircrowave-assisted extraction；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2016）02-0291-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.050

2015－05－29

葉芝紅（1990-），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的分離提取，E-mail：18770051363@163.com。

*通訊作者：鄭國(guó)棟（1969-），男，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物的分離提取和功能食品，E-mail：zrs150716@aliyun.com。

江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目（YC2015-S198）。