李 松，楊 倩，范李龍，崔鳳杰，趙鵬翔（.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖4000；.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江0；.國網(wǎng)節(jié)能服務(wù)有限公司北京生物質(zhì)能源技術(shù)中心，北京0005）

堿性β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌株的篩選、鑒定及部分酶學(xué)性質(zhì)研究

李 松1，楊 倩1，范李龍1，崔鳳杰2，趙鵬翔3
（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；3.國網(wǎng)節(jié)能服務(wù)有限公司北京生物質(zhì)能源技術(shù)中心，北京100053）

為開發(fā)新型堿性微生物來源的β-葡萄糖苷酶資源，本文采用七葉苷平板顯色篩選法在堿性條件下從多個(gè)土壤樣本和印染洗滌廢水中篩選得到一株β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定、發(fā)酵特性及部分酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果表明：篩選菌株為Bacillus sp.，其最適生長和產(chǎn)酶溫度為35～37℃，最適生長和產(chǎn)酶pH分別為9.5和9.0；該菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最適作用溫度和pH分別為50℃和9.5；在50℃以下和pH9.0～10.0內(nèi)比較穩(wěn)定；Cu2+、Fe2+、Ca2+和Mn2+對(duì)該酶表現(xiàn)出一定抑制作用，而Mg2+、Zn2+和Co2+對(duì)該酶催化活性沒有明顯影響。研究結(jié)果對(duì)產(chǎn)堿性β-葡萄糖苷酶的微生物資源獲取和信息整理具有一定的借鑒意義。

堿性β-葡萄糖苷酶，篩選，酶學(xué)性質(zhì)

β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21，BG），又稱β-D-1，4-葡萄糖苷水解酶，常與內(nèi)切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4，EG）和纖維二糖水解酶（EC 3.2.191，CBHs）共同構(gòu)成一組可對(duì)纖維素進(jìn)行高效協(xié)同作用的纖維素酶系［1-3］。β-葡萄糖苷酶可將纖維二糖徹底水解并釋放葡萄糖，同時(shí)該酶常因微生物自然分泌量的不足而成為整個(gè)纖維素酶系水解過程中的主要限速酶［4］。β-葡萄糖苷酶對(duì)纖維二糖的水解活性最強(qiáng)，但由于β-葡萄糖苷酶對(duì)底物（糖基）部分結(jié)構(gòu)的專一性較差，使得β-葡萄糖苷酶不僅能夠使C-O、C-S、C-N和C-F等鍵斷裂，還可以水解β-半乳糖苷鍵，甚至由于對(duì)糖分子結(jié)構(gòu)中C6位的專一性不高而能夠水解木糖［5］，這使得β-葡萄糖苷酶除了可以與其他纖維素酶組分協(xié)同水解纖維素外，還可以在糖苷轉(zhuǎn)移或水解［6-7］、制茶［8］以及食品增香［9-10］等多個(gè)領(lǐng)域使用。

堿性酶制劑在洗滌用酶中占有非常重要的地位，如堿性脂肪酶、堿性淀粉酶、堿性蛋白酶和堿性纖維素酶等［11］。其中，堿性酶制劑的研究及其品種的更新和應(yīng)用拓展，在很大程度上得益于對(duì)嗜堿菌資源的深度開發(fā)和利用。目前使用的堿性纖維素酶主要是由一類耐堿或嗜堿芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬微生物產(chǎn)生，因?yàn)樵擃悏A性芽孢桿菌往往僅具有纖維素酶單一組分（內(nèi)切葡聚糖酶）的生成能力，因此堿性纖維素酶又可專指堿性內(nèi)切葡聚糖酶［12-13］。關(guān)于堿性β-葡萄糖苷酶的研究報(bào)道非常少，使得對(duì)該酶資源的獲取和利用進(jìn)展緩慢，同時(shí)也限制了該酶的工業(yè)應(yīng)用。因此，研究和開發(fā)堿性β-葡萄糖苷酶對(duì)該酶應(yīng)用領(lǐng)域的拓展和實(shí)際使用均具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。本文以獲取堿性β-葡萄糖苷酶資源并研究其催化性質(zhì)多樣性為目的，從土壤以及印染廠洗滌廢水中篩選得到一株堿性β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)生菌株，通過16S rDNA序列比對(duì)和生理生化特性研究對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，同時(shí)對(duì)堿性β-葡萄糖苷酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

分離樣本 采集于蕪湖市神山公園、蕪湖市周邊農(nóng)田等地表下5～10 cm土壤以及印染廠洗滌廢水（各處理工段總廢水）；初篩培養(yǎng)基（酵母膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，KH2PO40.1%，瓊脂2.0%）、復(fù)篩培養(yǎng)基（七葉苷1.0%，（NH4）2SO40.3%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，檸檬酸高鐵銨0.025%，瓊脂2.0%）、種子培養(yǎng)基（葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5%，酵母粉0.3%，NaCl 0.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%）和發(fā)酵培養(yǎng)基（乳糖2%，NaCl 0.1%，NaNO30.3%，蛋白胨0.5%，酵母粉0.3%，MgSO40.05%） 均使用Na2CO3調(diào)節(jié)pH 至9.5；PCR產(chǎn)物回收、純化和質(zhì)粒提取試劑盒 購自大連生物工程（大連）有限公司；七葉苷（CAS#66778-17-4） 購自上海綠葉生物科技有限公司；其他分析純或化學(xué)純生化試劑 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′）和1429R（5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′） 購自蘇州金唯智生物科技有限公司。

滅菌鍋LDZX-50KBS 上海申安醫(yī)療器械廠；高速冷凍離心機(jī)Allg642 美國貝克曼公司；振蕩培養(yǎng)箱GHZ-123B 太倉市華美生化儀器廠；超凈工作臺(tái)SW-CJ-2FD 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PCR儀TC312 美國伯樂公司；紫外可見光分光光度計(jì)L5 上海精科儀器有限公司；生物顯微鏡XSP-2C 上海光學(xué)儀器廠；掃描電子顯微鏡S4800日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選 將采集的34個(gè)土壤樣本和1個(gè)印染廢水樣本在無菌環(huán)境中使用無菌水進(jìn)行溶解或稀釋并梯度稀釋至10-1、10-2和10-3。分別取200 μL各樣本梯度稀釋液涂布于初篩培養(yǎng)基，在37℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h至出現(xiàn)易挑取的單菌落。分別用滅菌處理的牙簽從每個(gè)樣本的分離平板中優(yōu)先挑取2～3個(gè)菌落形態(tài)或顏色有差異的單菌落，點(diǎn)種復(fù)篩培養(yǎng)基并于37℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h。挑取在復(fù)篩培養(yǎng)基中出現(xiàn)深褐色顯色圈的菌落，使用復(fù)篩培養(yǎng)基做進(jìn)一步劃線分離，并對(duì)該分離菌進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 菌株形態(tài)學(xué)觀察 將分離菌株劃線初篩培養(yǎng)基并在37℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，同時(shí)挑取單菌落于0.2 mL無菌水中并振蕩混勻，吸取10 μL菌懸液制片并進(jìn)行革蘭氏染色或掃描電鏡觀察。

1.2.3 菌株生理生化實(shí)驗(yàn) 篩選菌株的革蘭氏染色及其對(duì)大分子物質(zhì)的水解及產(chǎn)酸等實(shí)驗(yàn)參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》［14］所述方法和步驟進(jìn)行。

1.2.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定 分離菌株染色體DNA的提取、質(zhì)粒DNA的小量制備及DNA的酶切、連接、轉(zhuǎn)化等操作參見文獻(xiàn)［15］進(jìn)行。其中，以該菌株染色體DNA為模板，使用細(xì)菌16S rDNA通用引物在54℃退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接入T-載體并使用擴(kuò)增引物進(jìn)行序列測(cè)定，序列測(cè)定委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。通過在線數(shù)據(jù)庫Blast/blastp（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）對(duì)測(cè)定序列進(jìn)行比對(duì)，選擇同源性較高的序列利用BioEdit軟件進(jìn)行ClustalW多重比對(duì)（重復(fù)計(jì)算1000次），并進(jìn)一步使用MEGA 5.0軟件對(duì)其結(jié)果通過Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵 挑取單菌落接入種子培養(yǎng)基30 mL/ 250 mL，在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)16 h后按10%比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL/250 mL并在37℃、200 r/min條件下進(jìn)行發(fā)酵。微生物生長前期為菌種快速增殖期，然后進(jìn)入平穩(wěn)期，因此在0～24 h期間內(nèi)每隔2 h取樣，在24～54 h期間內(nèi)每隔6 h取樣，進(jìn)行菌體密度和酶活力測(cè)定。

在上述培養(yǎng)過程中，分別將溫度設(shè)定在25、30、35、40、45℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，以研究溫度對(duì)菌株生長和產(chǎn)酶的影響；分別將發(fā)酵液初始pH調(diào)整為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0條件下進(jìn)行發(fā)酵，以研究發(fā)酵液初始pH對(duì)菌株生長和產(chǎn)酶的影響。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)研究 分別在40、45、50、55、60、65、70℃等溫度下測(cè)定酶活力，以測(cè)定的最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，以研究酶的最適作用溫度；將酶液分別在40、50、60、70℃溫度條件下保溫1 h后測(cè)定殘余酶活力，以未經(jīng)保溫處理的酶液活力為對(duì)照（計(jì)為100%）計(jì)算相對(duì)酶活力，以研究酶液在不同溫度下的穩(wěn)定性；分別在pH8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0條件下測(cè)定酶活力，以測(cè)定的最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，以研究酶的最適作用pH；將酶液分別使用pH為8.0、9.0、10.0和11.0的緩沖液稀釋2倍后于30℃下保溫1 h后測(cè)定殘余酶活力，以經(jīng)保溫處理但未加緩沖液的酶液活力為對(duì)照（計(jì)為100%）計(jì)算相對(duì)酶活力，以研究酶液在不同pH條件下的穩(wěn)定性。其中，pH8.0～8.5使用Tris-鹽酸緩沖液（0.05 mol/L），pH9.0～10.5使用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.05 mol/L），pH11.0使用磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液（0.05 mol/L）。在反應(yīng)體系中分別加入金屬離子Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Mn2、Ca2+和Co2+至終濃度分別為1 mmol/L和5 mmol/L，以未加入金屬離子的酶液活力為對(duì)照（計(jì)為100%）計(jì)算相對(duì)酶活力，以研究金屬離子對(duì)酶催化性質(zhì)的影響。

1.2.7 菌體密度測(cè)定 發(fā)酵液樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后于600 nm處測(cè)定吸光值（OD600）并按公式（1）計(jì)算菌體密度，同時(shí)對(duì)β-葡萄糖苷酶活力進(jìn)行測(cè)定。

式（1）中，ODM為發(fā)酵液中菌體密度；A1為發(fā)酵液稀釋樣品在600 nm處的吸光值；A0為未接種培養(yǎng)基在600 nm處的吸光值；N為稀釋倍數(shù)；測(cè)定中均采用1 cm玻璃比色杯。

1.2.8 β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定 取1 mL發(fā)酵液于10，000 r/min離心5 min，取上清并使用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH9.5）適當(dāng)稀釋。取0.5 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液加入1 mL 1%水楊苷（溶于0.05 mol/L，pH9.5甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液）及0.5 mL 0.05 mol/L，pH9.5甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，50℃保溫30 min，加入3 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑［16］沸水浴10 min，冷卻后加水稀釋至25 mL，使用分光光度計(jì)測(cè)定在540 nm處測(cè)定吸光值（OD520）。

酶活力單位定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘水解七葉苷生成1 μmol還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量定義為1個(gè)β-葡萄糖苷酶活力單位（U）。其中，以煮沸滅活的酶液作為對(duì)照。測(cè)定結(jié)束后樣品中β-葡萄糖苷酶活力按式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式（2）中，UBG為單位體積樣品中β-葡萄糖苷酶活力（U/mL）；WG為從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）；NE為酶液稀釋倍數(shù)；TR為反應(yīng)時(shí)間（min）；VR為反應(yīng)體系中加入的酶液的體積（mL）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)項(xiàng)均做3個(gè)平行，3個(gè)平行數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算以及數(shù)據(jù)作圖均采用OriginLab Origin V7.5（Northampton，MA，USA）軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在所選擇的34個(gè)土壤樣本中，平均每克樣本中含有可在pH9.5條件下生長的耐堿細(xì)菌數(shù)量約30 cfu，最多約120 cfu，最少3～4 cfu；在所選擇的一個(gè)印染洗滌廢水樣品中含耐堿細(xì)菌數(shù)量約1200～1500 cfu/mL，平均含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常土壤中耐堿細(xì)菌的數(shù)量，可能是洗滌廢水的堿性環(huán)境（pH11.0～11.5）對(duì)堿性微生物存在的富集作用所致。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異，共計(jì)挑選97個(gè)單菌落點(diǎn)種復(fù)篩平板，同時(shí)進(jìn)行大分子水解實(shí)驗(yàn)，如表1所示。結(jié)果顯示，在堿性條件下具有木聚糖酶產(chǎn)生能力的菌株最多，約占所分離菌株總數(shù)的37%，其中有部分菌株（約5%）同時(shí)具有3種以上大分子物質(zhì)水解能力，但是僅有一株分離自印染廢水樣本的細(xì)菌（編號(hào)為AB46）具有β-葡萄糖苷酶活力，使篩選平板在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)深棕色，如圖1（a）所示。挑取菌株AB46劃線初篩培養(yǎng)基，培養(yǎng)16 h后顯示AB46菌落呈乳白色，表面圓潤、整齊、有光澤，不產(chǎn)粘性物質(zhì)，如圖1 （b）所示。革蘭氏染色及顯微形態(tài)觀察結(jié)果顯示AB46為革蘭氏陽性細(xì)菌，細(xì)胞為長桿狀，長約3～5 μm，直徑約0.3～0.6 μm，如圖1（c）和圖1（d）所示。

表1 耐堿細(xì)菌大分子水解平板檢測(cè)Table1 Macromolecule hydrolysis assay of alkaline bacteria

圖1 菌株AB46菌落及顯微形態(tài)觀察Fig.1 The colony and microscope morphology of strain AB46

2.2 菌株鑒定

生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明菌株AB46不能在45℃及以上溫度生長，表明該菌為中溫菌；該菌除了具有β-葡萄糖苷酶分泌能力外，還可以分泌淀粉和纖維素水解酶系；該菌可以利用常見的六碳糖進(jìn)行成長（如葡萄糖），但不能利用五碳糖（如木糖）。

表2 菌株AB46生理生化特性Table2 The physiological and biochemical characteristics of strain AB46

菌株AB46 16S rDNA序列經(jīng)測(cè)序后提交GenBank并獲得登陸號(hào)為：KP115895.1，選擇與較為相似的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。結(jié)果顯示，雖然在已鑒定到種的芽孢桿菌屬中，AB46與Bacillus cohnii（科氏芽孢桿菌）同源性最高，但AB46在同源進(jìn)化分類上卻與Bacillus sp.（GenBank：EF672045.1）聚為一類。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察（圖1）和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）將菌株AB46鑒定為Bacillus sp.，并命名為Bacillus sp.AB46。

圖2 菌株AB46 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain AB46 based on the 16S rDNA sequence alignment

2.3 菌株生長與產(chǎn)酶過程

將菌株AB46在37℃、pH9.5條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔一定取樣并進(jìn)行菌體密度和β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定，結(jié)果如圖3所示，菌株AB46經(jīng)歷一個(gè)典型的對(duì)數(shù)生長期后在16 h左右開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期的拐點(diǎn)（生長速率開始下降），并在24 h左右達(dá)到最大菌體密度，發(fā)酵至30 h左右菌體密度開始明顯下降，菌體細(xì)胞進(jìn)入衰亡期。發(fā)酵至42 h時(shí)β-葡萄糖苷酶活力達(dá)到最大值，約0.9 U/mL，隨后開始下降。

圖3 菌株AB46搖瓶發(fā)酵過程中生長及產(chǎn)酶變化趨勢(shì)Fig.3 Growth and enzyme production curves of strain AB46 in shaking flask fermentation

2.4 發(fā)酵條件對(duì)細(xì)胞生長和產(chǎn)酶的影響

2.4.1 初始pH對(duì)生長和產(chǎn)酶的影響 在不同pH條件下發(fā)酵獲得的最大菌體密度和酶活力結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明AB46最適生長pH為9.5，在pH9.0～10.0范圍內(nèi)生長良好，當(dāng)pH低于7.5時(shí)該菌株幾乎停止生長，顯示該菌株是一種專性嗜堿菌；β-葡萄糖苷酶活力變化趨勢(shì)表明AB46最適產(chǎn)酶pH為9.0，當(dāng)pH高于9.5或低于8.5時(shí)產(chǎn)酶量明顯下降，最適產(chǎn)酶pH范圍較窄。在整體變化趨勢(shì)上，除了最適產(chǎn)酶pH比最適生長pH低0.5之外，兩者隨pH變化的趨勢(shì)均較為接近。

圖4 初始pH對(duì)菌株AB46發(fā)酵生長及產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of initial pH value on growth and enzyme production of strain AB46 in shaking flask fermentation

2.4.2 溫度對(duì)生長和產(chǎn)酶的影響 在不同溫度條件下發(fā)酵獲得的最大菌體密度和酶活力結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明AB46最適生長溫度范圍為35～37℃，同時(shí)在25～40℃范圍內(nèi)亦可快速生長，當(dāng)溫度上升至45℃時(shí)菌體細(xì)胞幾乎停止生長，表明該菌株并不是耐熱細(xì)菌；在不同溫度條件下，該菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶趨勢(shì)與菌體生長趨勢(shì)較為接近，即菌株的最適生長溫度與最適產(chǎn)酶溫度相同。

圖5 溫度對(duì)菌株AB46發(fā)酵生長及產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of temperature on growth and enzyme production of strain AB46 in shaking flask fermentation

2.5 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 溫度和pH對(duì)酶催化活力的影響 在不同溫度和pH下分別測(cè)定β-葡萄糖苷酶的催化活力，結(jié)果表明：該酶最適作用溫度為50℃，在45～50℃范圍內(nèi)催化活力較高，如圖6（a）所示；該酶最適作用pH為9.5，在pH8.0～11.0之間均具有最高催化活力的60%以上，如圖6（b）所示。

2.5.2 溫度和pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響 熱穩(wěn)定性研究顯示該酶40℃下保溫1 h后殘余酶活力81%，在60℃下保溫1 h后酶活力全部喪失，如圖7（a）所示，表明該酶的耐熱性一般，即使在60℃能夠發(fā)揮最大催化效率的70%左右，但在高溫（大于50℃）條件下的長時(shí)間處理過程中，該酶的應(yīng)用性能可能會(huì)受到一定的限制。pH穩(wěn)定性研究顯示該酶在pH8.0～9.0之間非常穩(wěn)定，當(dāng)pH上升至10.0時(shí)，酶的穩(wěn)定性隨著pH的升高而出現(xiàn)大幅下降，如圖7（b）所示。綜合其最適反應(yīng)pH條件可以判斷該酶屬于堿性β-葡萄糖苷酶，在弱堿性環(huán)境中（pH9.0～10.0）具有較好的穩(wěn)定性和催化效率。

圖6 溫度（a）和pH（b）對(duì)酶催化活力的影響Fig.6 Effect of temperature（a）and pH（b）on catalytic activity of the enzyme

圖7 溫度（a）和pH（b）對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature（a）and pH（b）on stability of the enzyme

2.5.3 金屬離子對(duì)酶催化活力的影響 研究結(jié)果如圖8所示，表明高濃度（5 mmol/L）的Cu2+、Fe2+、Ca2+和Mn2+對(duì)該酶表現(xiàn)出一定抑制作用，而Mg2+、Zn2+和Co2+對(duì)該酶催化活性沒有明顯影響。

圖8 金屬離子對(duì)酶催化活力的影響Fig.8 Effect of mental ions on catalytic activity of the enzyme

3 結(jié)論與討論

目前關(guān)于堿性β-葡萄糖苷酶的研究報(bào)道非常少，僅有的少量報(bào)道顯示不同來源的堿性β-葡萄糖苷酶堿性作用條件較為相似，如馬振剛等［17］通過基因槍方法從兔盲腸細(xì)菌宏基因組中克隆到一種堿性β-葡萄糖苷酶編碼基因，在大腸桿菌中異源表達(dá)量后其堿性β-葡萄糖苷酶最適作用pH為10.0，在pH4.0～11.0范圍內(nèi)保持較高酶活力；蘇迪等［18］報(bào)道一種克雷伯氏桿菌所產(chǎn)堿性β-葡萄糖苷酶最適作用pH為10.0，在pH7.0～11.0范圍內(nèi)具有較高催化活力。本文采用七葉苷篩選平板顯色法快速從多個(gè)樣本中篩選出產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株并鑒定為Bacillus sp.，研究結(jié)果顯示該菌株在pH9.0～10.0范圍內(nèi)生長良好，是一種專性嗜堿菌。該菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最適作用溫度為50℃，最適作用pH為9.5并在pH8.0～11.0范圍內(nèi)可發(fā)揮較高催化活力；該酶在弱堿環(huán)境中（pH9.0～10.0）非常穩(wěn)定，但在高溫（大于60℃）條件下容易失活。綜上，研究中使用七葉苷平板顯色法快速篩選得到β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌株，雖然所獲得的菌株產(chǎn)酶水平比較低，但所獲菌株的生長和產(chǎn)酶特性及酶作用條件等研究結(jié)果可為產(chǎn)堿性β-葡萄糖苷酶的微生物資源研究及后期堿性β-葡萄糖苷酶基因的克隆和異源表達(dá)等工作奠定一定基礎(chǔ)。

［1］Juturu V，Wu J C.Microbial cellulases：Engineering，production and applications［J］.Renewable and Sustainable Energy Reviews，2014，33：188-203.

［2］Karmakar M，Ray R R.Current trends in research and application of microbial cellulases［J］.Research Journal of Microbiology，2011（6）：41-53.

［3］Bhatia L，Johri S，Ahmad R.An economic and ecological perspective of ethanol production from renewable agro waste：a review［J］.AMB Express，2012，2（1）：65.

［4］Lee W H，Nan H，Kim H J，et al.Simultaneous saccharification and fermentation by engineered Saccharomyces cerevisiae without supplementing extracellular β-glucosidase［J］.Journal of Biotechnology，2013，167（3）：316-322.

［5］邵金輝，韓金祥，朱有名，等.葡萄糖苷酶在工農(nóng)醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.生命的化學(xué)，2005，25（1）：22-24.

［6］Shin K C，Lee H J，Oh D K.Substrate specificity of βglucosidase from Gordonia terrae for ginsenosides and its application in the production of ginsenosides Rg3，Rg2，and Rh1from ginseng root extract［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2015，119（5）：497-504.

［7］張丹，劉耀平，魚紅閃，等.人參皂苷β-葡萄糖苷酶的分離純化及其酶學(xué)特性［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2003，9（3）：259-262.

［8］王斌，江和源，張建勇，等.酶工程技術(shù)在茶葉深加工中的應(yīng)用及展望［J］.茶葉科學(xué)，2010，30（1）：521-526.

［9］Chandra M，Kalra A，Sangwan N S，et al.Biochemical and proteomic characterization of a novel extracellular β-glucosidase from Trichoderma citrinoviride［J］.Molecular Biotechnology，2013，53：289-299.

［10］Guo Y，Yan Q，Yang Y，et al.Expression and characterization of a novel β-glucosidase，with transglycosylation and exo-β-1，3-glucanase activities，from Rhizomucor miehei［J］.Food Chemistry，2015，175：431-438.

［11］Sarethy I P，Saxena Y，Kapoor A，et al.Alkaliphilic bacteria： applications in industrial biotechnology［J］.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology，2011，38（7）：769-790.

［12］Annamalai N，Rajeswari M V，Elayaraja S，et al.Thermostable，haloalkaline cellulase from Bacillus halodurans CAS 1 by conversion of lignocellulosic wastes［J］.Carbohydrate Polymers，2013，94（1）：409-415.

［13］劉剛，余少文，孔舒，等.堿性纖維素酶及其應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.生物加工過程，2005，3（2）：9-14.

［14］沈萍，陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.第4版.北京：高等教育出版社，2007.

［15］薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.第三版.北京：科學(xué)出版社，2002.

［16］MillerG L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reduce sugar［J］.Analytical Chemistry，1959，31 （3）：426-428.

［17］馬振剛，唐婧，馬淑華，等.新型堿性低分子量β-葡萄糖苷酶基因的分離與酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，4：108-113.

［18］蘇迪，徐小蓉，唐婧.高產(chǎn)堿性β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：87-89.

Screening and identification of alkaline β-glucosidase producing-strain and partial enzyme characterization

LI Song1，YANG Qian1，F(xiàn)AN Li-long1，CUI Feng-jie2，ZHAO Peng-xiang3
（1.School of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；3.Beijing Biomass Energy Technology Center，State Grid Energy Conservation Service Ltd.，Beijing 100053，China）

One β-glucosidase producing strain was selected from various soil samples and dyeing wastewater by using esculin agar plate screening method with the aim to study and develop alkaline microbial origin βglucosidase resources，and the microbiology identification，fermentation properties and enzyme characterization of the isolated strain were further studied.The isolated strain was identified as Bacillus sp.，and the optimum growth and enzyme production temperatures was between 35～37℃，and the optimum growth and enzyme production pH were at 9.5 and 9.0，respectively.The optimum temperature and pH of the produced enzyme was 50℃and 9.5，respectively，and the enzyme was stable at temperatures below 50℃and in a pH range of 9.0～10.0.Mental ions，such as Cu2+，F(xiàn)e2+，Ca2+and Mn2+showed some inhibition to the enzyme，Mg2+，Zn2+and Co2+have no significantly effect on the catalytic activity of the enzyme.The results obtained in the study were meaningful for microbial resources and information consolidation of alkaline β-glucosidase producing strain.

alkaline β-glucosidase；screening；enzyme characterization

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0180-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.028

2015－05－11

李松（1980-），男，博士，研究方向：發(fā)酵工程、工業(yè)微生物遺傳育種，E-mail：lisong821123@126.com。

安徽省自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（1408085QC61）；安徽工程大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金（2013YQQ003）；國家電網(wǎng)公司科技項(xiàng)目資助（合同號(hào)：SGECS56-2014）。