檀茜倩,韓　燁,肖華志,周志江

(天津大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)與工程系,食品生物技術(shù)實驗室,天津 300072)

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對大腸桿菌異源表達(dá)乳酸片球菌素包涵體復(fù)性方法的研究

檀茜倩,韓燁,肖華志,周志江*

(天津大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)與工程系,食品生物技術(shù)實驗室,天津 300072)

本研究對E.coliBL21(DE3)基因工程菌高效表達(dá)的乳酸片球菌素融合蛋白包涵體進(jìn)行了提取和變性溶解,并采用稀釋復(fù)性,反稀釋復(fù)性,透析復(fù)性,CTAB輔助復(fù)性和CTAB和β-CD結(jié)合輔助復(fù)性五種方法對乳酸片球菌素融合蛋白包涵體的變性溶液進(jìn)行了復(fù)性的研究。結(jié)果表明CTAB和β-CD結(jié)合輔助復(fù)性的復(fù)性方法優(yōu)于其它的復(fù)性方法,可以實現(xiàn)以較高濃度的包涵體變性蛋白溶液,較小體積的復(fù)性液來獲得較高濃度的復(fù)性產(chǎn)物和達(dá)到相對穩(wěn)定的復(fù)性率。

包涵體,復(fù)性,片球菌素

采用基因工程方法構(gòu)建大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成為現(xiàn)代生物技術(shù)的一種常用手段。但是由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高效表達(dá),很容易使被表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成水不溶性包涵體。包涵體(Inclusion body)是指在某些生長條件下,大腸桿菌積累某種特殊的生物大分子并且致密地集聚在細(xì)胞內(nèi),或被膜包裹或形成無膜裸露的水不溶性結(jié)構(gòu),一般含有50%以上的重組蛋白,其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白OmpC、OmpF和OmpA等,環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA,以及脂體、脂多糖等[1-2]。

大腸桿菌內(nèi)積聚的包涵體一般通過菌體破碎,配合離心和一定程度的洗滌從菌體中初步分離出來[3-4]。為了獲得有活性的蛋白,通常需要對包涵體進(jìn)行復(fù)性。包涵體的復(fù)性方法很多[5],國內(nèi)外文獻(xiàn)針對包涵體的復(fù)性有諸多報道。Wang[6-7]等利用CTAB即十六烷基三甲基溴化胺和β-CD即β環(huán)糊精作為分子伴侶輔助重組溶菌酶復(fù)性獲得了比傳統(tǒng)的稀釋復(fù)性更好的效果。Lu等人[8]提出的利用PNIPAAm聚N-異丙基丙烯酰胺作為分子伴侶輔助復(fù)性,此外還有利用離子交換色譜[9]、分子排阻色譜[10-11]等對變性蛋白進(jìn)行復(fù)性。雖然如此,包涵體蛋白復(fù)性仍是對大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白純化的瓶頸因素,且對不同包涵體蛋白的復(fù)性條件也有所不同。

乳酸片球菌素是由乳酸菌產(chǎn)生的一類具有抑菌功能的細(xì)菌素,對革蘭氏陽性菌有抑制作用[12]。野生型乳酸片球菌產(chǎn)量較低[13],利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以實現(xiàn)乳酸片球菌素的異源表達(dá)并獲得乳酸片球菌素融合蛋白包涵體。為了獲得有活性的片球菌素,本實驗分別采用稀釋復(fù)性,透析復(fù)性,CTAB輔助復(fù)性,CTAB和β-CD輔助復(fù)性對乳酸片球菌素融合蛋白包涵體進(jìn)行了復(fù)性,并對這幾種復(fù)性方法的復(fù)性率進(jìn)行了比較分析,為乳酸片球菌素融合蛋白包涵體復(fù)性方法的選擇提供了依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乳酸片球菌素融合蛋白包涵體由含有pedA基因的E.coliBL21(DE3)基因工程菌產(chǎn)生,單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌CVCC1595中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。E.coliBL21(DE3)基因工程菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基(amp+),單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基?；蚬こ叹L培養(yǎng)基為MDG培養(yǎng)基(amp+),自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ZYM-5052(amp+)培養(yǎng)基,各培養(yǎng)基添加的amp+的終濃度均為50 μg/mL。

包涵體溶解液0.1 mol/LTris·HCl,8 mol/L 尿素,30 mmol/L DTT,1 mmol/L EDTA;包涵體復(fù)性液100 mmol/L Tris·HCl,100 mmol/L NaCl,0.4 mmol/L/4 mmol/L GSSG/GSH,1 mmol/L EDTA。

SDS-PAGE電泳、Tricine-SDS-PAGE電泳所用試劑Sigma;氨芐青霉素由genview分裝,尿素、氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽、咪唑北京普博欣公司;重組腸激酶(rEK-B)廣州中大南海生物技術(shù)有限公司;其他試劑天津大學(xué)科威公司均為分析純。

DYCZ-24D雙垂直電泳槽北京市六一儀器廠;GIS-2009紫外凝膠成像儀Tanon公司;JY88-IIN 超聲波細(xì)胞破碎儀寧波新芝;UV-1102 紫外可見分光光度計上海天美;D2004W電動攪拌器上海梅穎浦儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1包涵體的制備采用自動誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)片球菌素融合蛋白,參考Studier方法并做適當(dāng)改變[14]。挑取甘油凍存E.coliBL21(DE3)基因工程菌于含有amp+的LB平板上劃線,過夜培養(yǎng)。次日挑取平板上茁壯單菌落接入5 mL含amp+的MDG培養(yǎng)基中,37 ℃,170 r/min,過夜培養(yǎng)。次日將菌液按1∶500比例接入含適量amp+的ZYM-5052培養(yǎng)基中在37 ℃,將搖菌速度提升到190 r/min過夜培養(yǎng),待菌體變渾濁轉(zhuǎn)移入20 ℃搖床在同樣轉(zhuǎn)速下繼續(xù)培養(yǎng),每間隔1 h取樣測定菌液的OD600值,當(dāng)OD600值在1～2 h不發(fā)生變化時收集菌液,將菌液離心,棄去上清液,收集菌體沉淀,重懸于PBS緩沖液(pH7.4)中,采用溶菌酶處理,溶菌酶終濃度為2 mg/mL,在20、40、60、80、100、120 min分別取樣500 μL稀釋10倍后使用紫外-可見分光光度計測量其OD280、OD260和OD600值后兩者可以反映內(nèi)容物的溶出情況。將經(jīng)溶菌酶處理的菌體溶液在超聲破碎儀上,于200 W,超聲開3 s,關(guān)3 s的條件下破碎20 min。在4 ℃,8000 r/min離心20 min。棄去上清液,保留沉淀。

1.2.2包涵體的洗滌和溶解包涵體的洗滌和溶解參考Singh的方法[3]。包涵體用PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌兩次,用2 mol/L的尿素溶液洗滌一次,用0.05% Triton100溶液洗滌一次。每次洗滌后保留樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析以評價洗滌的效果。采用包涵體溶解液溶解洗滌后的包涵體蛋白,將包涵體蛋白沉淀重新懸于溶解液中,在4 ℃下,采用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌12 h后,將溶解液離心,取上清液,采用考馬斯亮藍(lán)法測定其蛋白濃度,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3包涵體的復(fù)性

1.2.3.1稀釋復(fù)性直接稀釋復(fù)性:將最終蛋白濃度分別為0.0472、0.0944、0.1415、0.1887 mg/mL的包涵體溶解后的變性溶液5 mL分別逐滴加入25 mL的復(fù)性液中,并不斷攪拌,在4 ℃的條件下復(fù)性12 h。反稀釋復(fù)性:將25 mL復(fù)性液逐漸加入到含有5 mL最終蛋白濃度分別0.0472、0.0944、0.1415、0.1887 mg/mL的包涵體溶解后的變性溶液中,并不斷攪拌,在4 ℃的條件下復(fù)性12 h。

1.2.3.2透析復(fù)性將蛋白濃度為0.2359 mg/mL的包涵體變性蛋白溶液5 mL裝于截留量為8000 ku的透析膜中,在50 mL復(fù)性液中于4 ℃下透析24 h復(fù)性,中間更換多次復(fù)性液。

1.2.3.3CTAB輔助復(fù)性參考Wang等方法[6-7]。將CTAB終濃度為10、20、30、40 mmol/L的復(fù)性液各25 mL,分別各自逐滴加入5 mL蛋白濃度為0.2539 mg/mL的包涵體變性蛋白溶液中,加入時不斷攪拌,于4 ℃復(fù)性12 h。

1.2.3.4CTAB和β-CD結(jié)合輔助復(fù)性參考Wang等方法[6-7]。將蛋白濃度為0.2359 mg/mL的包涵體變性蛋白溶液5 mL逐滴加入10 mL含有10 mmol/L CTAB的復(fù)性液中,加入時不斷攪拌,在室溫復(fù)性1 h。逐滴加入β-CD溶液使溶液中的β-CD的濃度值達(dá)到15 mmol/L,在室溫并磁力攪拌條件下復(fù)性30 min,后于4 ℃磁力攪拌的條件下復(fù)性12 h。

1.2.4復(fù)性后重組蛋白的純化復(fù)性后重組蛋白在緩沖液中做透析處理。采用Ni-IDA柱對重組蛋白進(jìn)行純化。按照產(chǎn)品使用手冊,純水洗柱,并用緩沖液平衡10個柱體積,蛋白溶液樣品經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后上樣,保持流速為1 mL/min,用緩沖液平衡10個柱體積,使用含50 mmol/L咪唑的平衡溶液進(jìn)行第一次洗脫,保持流速為1 mL/min,使用含有500 mmol/L咪唑的平衡液進(jìn)行第二次洗脫,保持流速為1 mL/min。此時收集目的蛋白。將目的蛋白透析后采用冷凍干燥法縮小樣品體積。將樣品重新溶于腸激酶緩沖液中(20 mmol/L Tris·HCl,100 mmol/L NaCl,pH=7.6),測定樣品的蛋白濃度,加入適量的腸激酶酶切。采用考馬斯亮藍(lán)方法測定蛋白濃度。產(chǎn)物采用Tricine-SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5復(fù)性后蛋白活性分析基因工程片球菌素的活性測定采用牛津杯法,指示菌為單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌。對野生型乳酸菌產(chǎn)生的片球菌素使用Yang的方法[15]進(jìn)行粗提,采用考馬斯亮藍(lán)的方法測定粗提液的濃度。將粗提液按如下比例:不稀釋,1∶2、1∶4、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11稀釋后,進(jìn)行牛津杯抑菌實驗,判斷乳酸片球菌素的濃度與抑菌圈與牛津杯直徑之差間的趨勢關(guān)系,做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)復(fù)性后的片球菌素的抑菌圈直徑與牛津杯的直徑差在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出復(fù)性后的片球菌素的蛋白濃度。

1.2.6數(shù)據(jù)處理實驗中每次實驗重復(fù)三次,采用origin軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與討論

2.1包涵體的制備和洗滌溶解

菌體細(xì)胞的破碎效果的好壞與細(xì)胞內(nèi)容物釋放的多少有直接關(guān)系。大腸桿菌在600 nm處有最大的吸光度值,而在280 nm和260 nm下,蛋白質(zhì)的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸以及核酸中的大量堿基在紫外條件下有最大量的吸收。圖1為在室溫下溶菌酶處理后菌體細(xì)胞的酶解情況。經(jīng)溶菌酶處理后的細(xì)胞胞壁逐漸溶解,細(xì)胞內(nèi)容物大量釋放。對此菌液進(jìn)行超聲破碎處理后,菌液的OD600值下降到0.0188,表明此時菌液中的菌體細(xì)胞已經(jīng)被大量降解,包涵體蛋白被很好釋放。使用溶菌酶加超聲破碎處理細(xì)胞,可以縮短細(xì)胞的破碎時間,改善細(xì)胞的破碎效果,缺點是引入了溶菌酶這種雜蛋白。對破碎后的包涵體的洗滌不僅可以除去菌體細(xì)胞中除目的包涵體蛋白以外的蛋白,同時還可以較大程度的除去溶菌酶蛋白,為后續(xù)的純化提供方便。

圖1　室溫下的酶解過程Fig.1　The process of enzymolysis in room temperature

圖2為包涵體蛋白經(jīng)多次洗滌后電泳圖譜。21 ku處為乳酸片球菌素融合蛋白包涵體蛋白條帶,14 ku處為溶菌酶條帶。泳道1,2顯示菌體中許多雜蛋白被除去,但溶菌酶蛋白仍然存在。泳道3顯示溶菌酶蛋白大部分被除去,溶液中的其他雜蛋白進(jìn)一步被除去。泳道4基本呈現(xiàn)單一包涵體條帶,說明包涵體蛋白的洗滌比較徹底,純度較高。

包涵體蛋白在本實驗所采用的溶解液中完全溶解,經(jīng)離心后只有較少的沉淀產(chǎn)生。

圖2　包涵體蛋白洗滌后電泳圖Fig.2　SDS-PAGE of inclusion body after washing注:M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量;泳道1,2為經(jīng)PBS洗滌以后的蛋白電泳;泳道3為經(jīng)2 mol/L尿素洗滌后的包涵體蛋白;泳道4為經(jīng)1% Triton洗滌后的蛋白電泳圖。

2.2包涵體的復(fù)性

包涵體的復(fù)性是指經(jīng)變性的包涵體蛋白重新折疊成為正確的形式的過程,這個過程包含有復(fù)雜的動力學(xué)反應(yīng),包涵體蛋白的復(fù)性可能需要幾秒種也可能需要幾天的時間,這取決于不同種類的蛋白的復(fù)性的難易的程度[16]。稀釋復(fù)性的方法是最簡單也是在工業(yè)中經(jīng)常所使用的方法,將包涵體的變性溶液逐漸加入復(fù)性液中,蛋白濃度的降低,可以使變性蛋白在復(fù)性液中逐漸重新折疊為有活性的結(jié)構(gòu)形式。其他方法都是針對解決稀釋復(fù)性后復(fù)性液體積過大的缺點產(chǎn)生的。包涵體復(fù)性的復(fù)性液多為氧化型谷胱甘肽/還原性谷胱甘肽體系溶液。在復(fù)性的過程中添加一些多元醇類和其他分子伴侶是為了防止蛋白聚集[17]。

對經(jīng)過不同的復(fù)性方法的復(fù)性后產(chǎn)物經(jīng)過N柱純化并腸激酶酶切后的Tricine-SDS-PAGE電泳的分析圖如圖3所示,可以看出,經(jīng)過Ni柱純化后的片球菌素基因工程菌的純度較高,且腸激酶酶切的程度也比較完全,可以清楚的看到兩條條帶,雜蛋白含量極低,在電泳圖譜上不可見。產(chǎn)生兩條條帶分別為在16 ku左右的硫氧還蛋白條帶,和在5 ku左右的乳酸片球菌素條帶,與預(yù)期的條帶相符。

圖3　經(jīng)不同復(fù)性方法并經(jīng)酶切的復(fù)性后蛋白電泳圖Fig.3　SDS-PAGE of the enzyme cleaved refolding protein under different refolding methods注:M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量,泳道1～5分別為稀釋復(fù)性,反稀釋復(fù)性,透析復(fù)性,CTAB輔助復(fù)性,CTAB和β-CD結(jié)合輔助復(fù)性。

為了進(jìn)一步評定復(fù)性效果,對不同復(fù)性方法復(fù)性后并經(jīng)腸激酶酶切后的產(chǎn)物以單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌作為指示菌進(jìn)行抑菌實驗,其抑菌效果如圖4所示。實驗表明未經(jīng)腸激酶酶切連有硫氧還蛋白的復(fù)性后基因工程產(chǎn)物卻不具備抑菌活性,其它幾種復(fù)性方法產(chǎn)生的片球菌素的抑菌圈直徑見表1所示。CTAB和β-CD結(jié)合輔助復(fù)性的效果最優(yōu),稀釋復(fù)性,反稀釋復(fù)性的復(fù)性效果次之,而透析復(fù)性的復(fù)性效果最差,基本無法觀測到明顯的抑菌圈。CTAB的濃度對復(fù)性效果影響不大,本文采用的CTAB濃度為10 mmol/L,這個濃度的CTAB對單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌沒有抑菌作用,充分避免了CTAB對抑菌實驗的干擾。

圖4　不同復(fù)性方法的酶切后復(fù)性產(chǎn)物的抑菌效果Fig.4　The inhibition effect of gene engineering product after enzyme cleavage

復(fù)性方法抑菌圈抑菌圈直徑(mm)稀釋復(fù)性+15.02±0.12反稀釋復(fù)性+14.00±0.04透析復(fù)性--CTAB輔助復(fù)性+14.36±0.09CTAB和β-CD結(jié)合輔助復(fù)性+16.42±0.11

注:+有可見抑菌圈,-無可見抑菌圈。

2.3包涵體復(fù)性率分析

根據(jù)乳酸片球菌素的濃度和抑菌圈與牛津杯的直徑差值之間存在線性的趨勢關(guān)系作出乳酸片球菌素濃度和抑菌圈與牛津杯直徑差的標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖5所示,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線并結(jié)合經(jīng)過酶切后的基因工程片球菌素對單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌產(chǎn)生的抑菌圈的大小,本研究確定了復(fù)性并酶切后片球菌素基因工程產(chǎn)物的濃度如圖6所示。

圖5　抑菌圈直徑與片球菌素蛋白濃度的關(guān)系Fig.5　The relationship between the diameter of inhibition circle and the concentration of pediocin

圖6　不同復(fù)性方法得到的片球菌素的濃度Fig.6　The concentration of pediocin under different refolding methods

本研究定義復(fù)性率的計算公式為:復(fù)性率(%)=溶液中復(fù)性后有活性的基因工程產(chǎn)物的濃度/溶液的總蛋白濃度。故采用不同復(fù)性方法復(fù)性基因工程產(chǎn)物后,各自的復(fù)性率用在圖7表示出來。因透析復(fù)性因復(fù)性率極低不在圖中表示。采用稀釋復(fù)性方法所包涵體蛋白的復(fù)性率最高,采用CTAB輔助復(fù)性的復(fù)性率最低。但是稀釋復(fù)性加入的變性蛋白濃度很低,且復(fù)性液體積較大,為復(fù)性后蛋白的純化帶來了困難。CTAB輔助復(fù)性和CTAB與β-CD結(jié)合輔助復(fù)性則允許加入初始蛋白濃度較大的變性蛋白溶液,優(yōu)于稀釋復(fù)性。CTAB與β-CD結(jié)合輔助復(fù)性的復(fù)性率為CTAB復(fù)性的2倍左右。

圖7　不同復(fù)性方法的復(fù)性率Fig.7　The refolding rate of different refolding method

3　結(jié)論

本研究對由含有pedA基因的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的片球菌素的包涵體蛋白的制備,變性溶解和不同復(fù)性方法進(jìn)行了比較研究。通過研究發(fā)現(xiàn)稀釋復(fù)性的復(fù)性率高于其他復(fù)性方法,但是產(chǎn)生的復(fù)性產(chǎn)物的濃度很低,復(fù)性液體積大不利于后續(xù)純化;CTAB與β-CD結(jié)合輔助復(fù)性可以以較高濃度的包涵體變性蛋白溶液,較小體積的復(fù)性液來獲得較高濃度的復(fù)性產(chǎn)物和達(dá)到相對穩(wěn)定的復(fù)性率,可以用于對乳酸片球菌素包涵體蛋白的大量復(fù)性,以便于后續(xù)的分離純化。

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Research of the refolding of a heterologous pediocin expressed inEscherichiacoli

TAN Xi-qian,HAN Ye,XIAO Hua-zhi,ZHOU Zhi-jiang*

(Department of Food Science and Engineering,School of Chemical Engineering and Technology,Tianjin University,Tianjin 300072,China)

The inclusion body of the recombinant pediocin fusion protein was produced by the excess expression of gene engineeringE.coliBL21(DE3). The inclusion body was separated,denatured,and then refolded using direct dilution,reversed dilution,dialysis,CTAB assisted,and CTAB andβ-CD assisted refolding. The results showed that CTAB andβ-CD assisted refolding have advantage over other refolding methods. Through this method,a higher concentration of denatured inclusion protein and a smaller volume renatured solution were used. And a higher concentration of refolding product and a relatively stable refolding rate were achieved.

inclusion body;refolding;pediocin

2015-12-14

檀茜倩(1985-)，女，博士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：xiqiantan@tju.edu.cn。

周志江(1960-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：zzj@tju.edu.cn。

天津科技支撐計劃重點項目(13ZCDNC01900)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)13-0173-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.026