趙小莉,付　洋,趙　強(qiáng),寧方建,熊　華

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

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硫酸銨沉淀分離富硒大豆蛋白的初步研究

趙小莉,付洋,趙強(qiáng)*,寧方建,熊華

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

本文采用堿提酸沉法從天然富硒大豆中提取分離蛋白(SPI),再分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%、60%、80%的硫酸銨溶液對(duì)其進(jìn)行分級(jí)沉淀,比較研究分離得到的不同富硒SPI組分間的差異,以探討硫酸銨分離富硒SPI的方法。結(jié)果表明:濃度為60%硫酸銨溶液分離得到的富硒SPI組分中總硒含量和可溶性蛋白含量最高;圓二色光譜和SDS-PAGE結(jié)果表明不同濃度硫酸銨溶液分離的富硒SPI組分的二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞基組成有明顯不同;通過X-射線衍射分析和原子力顯微觀察,發(fā)現(xiàn)三種富硒蛋白組分的晶型和表面形態(tài)也區(qū)別較大。因此,硫酸銨法對(duì)于沉淀分離富硒SPI的差異組分,是一種有效的初篩方法,且以60%的硫酸銨濃度為較佳。

大豆富硒蛋白,硫酸銨沉淀,二級(jí)結(jié)構(gòu),SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,表面形態(tài)

硒是人體必需的微量元素,作為谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶、脫碘酶、硒蛋白W和硒蛋白P等酶或蛋白的活性中心或必要組分,發(fā)揮抗氧化作用[1-2]。缺硒是導(dǎo)致人體克山病、大骨病的主要原因。由于硒的地理分布不均勻,全世界70%的地區(qū)缺硒,我國就有72%的地區(qū)缺硒[3]。因此,研究開發(fā)富硒食品或富硒蛋白食品添加劑具有重要的意義。況沖等人[4]利用黃豆的發(fā)芽過程,采用噴淋和浸泡硒酸鹽溶液的人工富硒方式實(shí)現(xiàn)了黃豆對(duì)硒元素的生物富集,制備出的富硒黃豆芽粉富硒量為42.46 μg/g,且分離得到含硒量為21.24 μg/g的富硒大豆蛋白。然而,人工富硒的方式一般不易控制,易使硒元素在植物體內(nèi)蓄積過量,且主要為無機(jī)硒[5]。江西豐城被譽(yù)為“中國生態(tài)硒谷”,富硒土壤中硒元素平均含量為0.28 μg/g,天然富硒大豆總硒含量可達(dá)到0.13 μg/g,為天然富硒蛋白的研究提供了基礎(chǔ)條件。

分離純化植物蛋白的方法有超速離心、EDTA加MgCl2分級(jí)沉淀、離子交換、利用HPLC分離制備等,但是這些方法操作復(fù)雜,費(fèi)時(shí),且費(fèi)用昂貴。硫酸銨鹽析沉淀分離蛋白法因其操作簡便,價(jià)格低廉,可用于大規(guī)模生產(chǎn),且對(duì)蛋白有保護(hù)作用而被廣泛應(yīng)用。因此,采用硫酸銨沉淀法分離富硒大豆蛋白具有一定的適用性。然而,分離純化蛋白的硫酸銨溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)怎樣確定及相應(yīng)的富硒大豆蛋白分離組分的含硒量、結(jié)構(gòu)特性如何,目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硫酸銨溶液對(duì)富硒大豆分離蛋白進(jìn)行分級(jí)沉淀,分析其各分離組分的可溶性蛋白含量、硒含量、亞基組成,二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及蛋白晶型和表面形態(tài)的差異,以獲得純化富硒大豆蛋白較佳的硫酸銨沉淀方法,為富硒蛋白的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

富硒大豆江西豐城富硒基地提供;預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量Mark(10～170 ku)美國Promega公司;丙烯酰胺(Acr)、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)(R-250)等美國Sigma公司;β-巰基乙醇、硫酸銨、硝酸、硫酸等國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,化學(xué)試劑均為分析純。

DELTA 320 pH計(jì)梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PerkinElmer Lambda 25紫外可見分光光度計(jì)美國珀金埃爾默公司;Mini PROTEAN? 電泳儀美國Bio-Rad 公司;TGL-16C高速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器有限公司;D8-Focus X-衍射儀德國布魯克公司;230E-原子熒光光度計(jì)北京海光儀器有限公司;Agilent 5500原子力顯微鏡美國安捷倫公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1富硒大豆分離蛋白的制備及硫酸銨沉淀分離硫酸銨分級(jí)沉降富硒大豆分離蛋白的操作參照吳永堯等人[6]的方法并做適當(dāng)修改。脫脂大豆粉按1∶15(m/v)加入去離子水并攪拌,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至8.0,室溫下低速攪拌2 h,4800 r/min離心20 min,殘?jiān)貜?fù)提取,合并上清液用1 mol/L HCl調(diào)pH至4.5,靜置30 min后再次離心分離,棄上清液,收集沉淀水洗兩次,并將沉淀加水完全溶解,1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0,邊攪拌邊加入40%(m/v)硫酸銨粉末,完全溶解后放置4 ℃冰箱4 h,然后離心,沉淀即為40%-SPI;上清液加硫酸銨到60%,待溶解后置于4 ℃冰箱中2 h,離心,沉淀即為60%-SPI;上清液加硫酸銨至80%,操作同上,沉淀即為80%-SPI。分離得到的三種蛋白組分加原溶解液10%體積蒸餾水溶解并透析24 h,期間更換透析液多次直至滴入BaCl2溶液無白色沉淀析出為止,冷凍干燥,待用。

1.2.2分離蛋白中硒含量及可溶性蛋白含量的測定蛋白組分中硒含量的測定參考GB 5009.93-2010[7]中的原子熒光法進(jìn)行。分別稱取凍干樣各0.1000 g,置于消化瓶中,加10.0 mL混合酸(V硝酸-V高氯酸=9-1),蓋上表面皿,次日于電熱板上加熱,并及時(shí)補(bǔ)加硝酸。當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙時(shí),再繼續(xù)加熱至剩余體積為2 mL左右,不可蒸干。冷卻,定容至25 mL,混勻待測,同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)?？扇苄缘鞍缀坑肍olin-酚法測定[8]。

1.2.3SDS-PAGE分析SDS-PAGE分析參考Laemmli報(bào)道的方法[9],濃縮膠和分離膠的質(zhì)量濃度分別為5%和12.5%。蛋白質(zhì)樣品溶于0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的SDS,1%的β-巰基乙醇,50%的甘油和0.02%的溴酚藍(lán))中配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的溶液,樣品上樣前煮沸5 min,離心(10000 r/min,10 min)。取上清液10 μL進(jìn)樣,電泳在室溫下進(jìn)行,濃縮膠中的電流恒定為25 mA,當(dāng)樣品前沿到達(dá)分離膠時(shí)電流改為30 mA。電泳結(jié)束后,凝膠染色采用0.25%考馬斯亮藍(lán)(R-250),脫色采用含甲醇和醋酸的去離子水溶液。

1.2.4圓二色光譜分析(CD)稱取一定量的樣品,用pH7.4磷酸鹽緩沖液配制濃度為1 mg/mL的蛋白溶液。掃描遠(yuǎn)紫外區(qū)域(190～250 nm),速度為50 nm/min,光譜間隔0.1 nm,測得圓二色光譜。數(shù)據(jù)經(jīng)origin 8.5進(jìn)行擬合,并用分析網(wǎng)站(http://dichroweb.cryst. bbk.ac.uk/html/process.shtml)對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析。

1.2.5X-射線衍射(XRD)XRD的測定參照Naidja[10]和Guerrero[11]等人報(bào)道的方法。蛋白樣品的XRD模式,運(yùn)用D8-Focus X-衍射儀進(jìn)行測定。儀器參數(shù):Cu Kα石墨單色器。電壓40 kV,在2～50度范圍內(nèi)掃描速度為0.1°/s。

1.2.6原子力顯微鏡分析(AFM)參考耿勝榮等人[12]的方法并稍作修改。將凍干的蛋白粉用蒸餾水分別配成30 μg/mL和50 μg/mL的溶液,攪拌過夜。靜置待不溶顆粒沉淀,分別吸取20 μL上清液,滴在各自新剝離的云母片(面積1.0 cm×1. 0 cm)上,自然晾干待用。樣品準(zhǔn)備應(yīng)無任何污染,保證掃描的準(zhǔn)確和探針的潔凈。

1.2.7數(shù)據(jù)分析采用origin 9.2軟件One-Way ANOVA對(duì)測試數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,p<0.05,Tukey test檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1硒含量及可溶性蛋白含量的分析

目前,常用的蛋白質(zhì)含量測定方法有凱氏定氮法,Folin-酚試劑法(Lowry法),雙縮脲法和紫外分光光度法[13]。Folin-酚試劑法蛋白質(zhì)測定范圍是25～250 μg,有操作簡便,靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),故而本實(shí)驗(yàn)采用Folin-酚法及原子熒光法分別測定了富硒蛋白的可溶性蛋白含量和總硒含量(如圖1)。從圖中可以看出,隨著硫酸銨溶液鹽析蛋白濃度的增大,可溶性蛋白含量逐漸下降,尤其是質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí),可溶性蛋白含量顯著下降(p<0.05),其蛋白含量依次為0.749、0.714、0.704、0.596 g/g;同時(shí),其硒含量依次為0.281、0.270、0.318、0.228 mg/kg,當(dāng)硫酸銨溶液分離濃度為60%時(shí),硒含量相對(duì)最高。因此,采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的硫酸銨溶液分離富硒大豆蛋白,可溶性蛋白含量高,且硒含量較高(實(shí)際上,60%-SPI的產(chǎn)率還遠(yuǎn)大于其它組分)。

圖1　SPI及其分離組分的蛋白含量及硒含量分布Fig.1　Selenium contents and protein content of SPIs

2.2SDS-PAGE分析

SPI經(jīng)不同質(zhì)量濃度硫酸銨溶液分離得到組分的亞基組成,通過SDS-PAGE鑒定如圖2所示。從圖中可以看到,在還原條件下富硒大豆蛋白結(jié)構(gòu)中的二硫鍵斷裂,主要形成8條蛋白亞基條帶,40%-SPI和粗分離SPI的亞基組成沒有明顯變化,60%-SPI在35～40 ku以下的亞基條帶顏色加深,說明這些亞基含量相對(duì)較多;80%-SPI中40～100 ku的條帶灰度加深即蛋白亞基含量增加,40 ku以下則蛋白亞基含量減少。胡居吾等[14]研究發(fā)現(xiàn)富硒大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在15～25 ku的蛋白亞基硒含量最高,質(zhì)量分?jǐn)?shù)在70～100 ku的亞基硒含量最低,而60%-SPI分子量主要在15～40 ku,80%-SPI分子量主要在40～80 ku,這與前面60%-SPI硒含量最高相一致,表明當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%時(shí)分離得到的蛋白中硒含量最高。此外,60%-SPI和80%-SPI與negano法[15]得到的7S和11S的蛋白亞基條帶相似,即60%-SPI與11S球蛋白(17505～40459 u),80%-SPI與7S球蛋白(56242～77740 u)分別有相似的電泳條帶。60%和80%質(zhì)量分?jǐn)?shù)硫酸銨分離得到的蛋白是否是11S和7S還有待進(jìn)一步研究,但是此方法也可以用于7S和11S的純化。

圖2　大豆蛋白及其分離組分的SDS-PAGE電泳圖Fig.2　SDS-PAGE profiles of SPIs 注:M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1、2、3、4分別為SPI、40%-SPI、60%-SPI、80%-SPI。

2.3圓二色光譜(CD)分析

CD圖譜在190～240 nm紫外波段可反映蛋白質(zhì)等生物大分子的主鏈構(gòu)象,能表現(xiàn)出各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的光譜之和即α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的線性疊加。參考SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的相關(guān)文獻(xiàn)可知,具有α-螺旋構(gòu)象的分子在190 nm附近有正峰,在208 nm和220 nm附近呈負(fù)峰;β-折疊存在于216 nm附近的負(fù)峰和185～200 nm的正譜帶;β-轉(zhuǎn)角在206 nm附近有一正峰;無規(guī)則卷曲構(gòu)象在198 nm附近有負(fù)峰,在220 nm附近有小而寬的正峰[16]。SPI及其分離組分的CD擬合圖見圖3,且通過軟件計(jì)算得到的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息見表1。

圖3　SPI及其分離組分的CD擬合圖Fig.3　CD fit figure of SPIs

樣品名α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角無規(guī)則卷曲SPI2.0850.3123.5425.5240%-SPI4.0343.0421.4731.4560%-SPI5.8044.0921.0529.2680%-SPI7.1645.2020.5927.04

α-螺旋和β-折疊代表蛋白質(zhì)分子的有序性[17],β-折疊結(jié)構(gòu)組成變化是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的一個(gè)主要特征[18],β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)均反映蛋白質(zhì)分子松散程度[19]。研究表明,硒和硫有相同的代謝途徑,故在蛋白質(zhì)的合成過程中硒代替了甲硫氨酸或半胱氨酸中的硫或取代了二硫鍵中的硫以GSHSeGSH,SeMet,MeSeCys,或γGluMeSeCys,CysSeSeCys的形式存在。如果硒取代了C-S-S-C中的硫以C-Se-Se-C的形式存在必將影響蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)硫酸銨分離得到的富硒大豆蛋白組分相對(duì)于粗提富硒SPI,均出現(xiàn)α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量增加,β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量減小。且隨著硫酸銨溶液濃度的增加,α-螺旋和β-折疊含量均逐漸增加,β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)均逐漸較少,說明隨著硫酸銨含量的增加,分離得到的富硒大豆蛋白的有序性得到提高,可能的原因,主要是由于鹽析的蛋白組份的不同造成蛋白結(jié)構(gòu)的變化,而二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化是否由硒的取代所引起還需要做進(jìn)一步的研究。

表2　SPIs的XRD圖上的峰值參數(shù)

2.4X-射線衍射(XRD)

X射線衍射已經(jīng)成為研究晶體物質(zhì)和某些無定形態(tài)物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的有效方法。在本實(shí)驗(yàn)中采用了X射線衍射技術(shù),研究富硒SPI及其硫酸銨分離蛋白組分衍射的差異,結(jié)果見圖4及表2。從圖4中可以看出,無論是SPI或其分離組分晶面主衍射峰為2θ≈18.5°附近的位置。這表明不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)硫酸銨處理對(duì)大豆富硒蛋白的晶型沒有形成明顯影響,即沒有改變晶層的距離。此外,相對(duì)于SPI,40%-SPI、80%-SPI在2θ≈26.3°和2θ≈40°處的衍射峰增強(qiáng)且峰變窄,說明在此衍射角處的晶體較多;且60%、80%濃度硫酸銨處理對(duì)大豆富硒蛋白的衍射角在2θ≈40°處均有右移的跡象,40%濃度硫酸銨處理蛋白組份衍射峰整體向左移動(dòng),這些現(xiàn)象說明不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)硫酸銨分離得到的富硒大豆蛋白組分的晶型有所差異,即蛋白之間存在差別,這與電泳得到的結(jié)果相一致。

圖4　SPI及其分離組分的XRD圖Fig.4　XRD analysis of SPIs

2.5原子力顯微鏡分析(AFM)

圖5A是富硒SPI及其硫酸銨處理組分配制成50 μg/mL蛋白溶解液的原子力顯微鏡三維圖,圖5B是其二維圖。從圖中可以直觀的看到樣品表面的高低起伏,可以看出不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)硫酸銨分離得到的富硒大豆蛋白組分的表面形態(tài)有較大的差異,且蛋白組分之間隨著硫酸銨含量的增加,富硒大豆蛋白顆粒逐漸變小;圖中還可以看出40%-SPI的顆粒最大,聚集度高,表面凸起較高(40 nm),60%-SPI有尖銳凸起且密度很高,從80%-SPI的三維圖中可以看到凸起的蛋白顆粒很少,且高度只有4.4 nm相對(duì)40%-SPI的40 nm其顆粒很小。結(jié)果表明隨著硫酸銨含量的增加,分離得到的大豆蛋白的顆粒越來越小,這與上文CD結(jié)果“隨著硫酸銨含量的增加得到的分離蛋白組分的結(jié)構(gòu)有序性增加”存在一致性。

圖5　SPI及其分離組分的AFMFig.5　AFM analysis of SPIs 注:a～d:SPI,40%-SPI,60%-SPI,80%-SPI。

3　結(jié)論

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)硫酸銨溶液分級(jí)沉淀得到的大豆富硒蛋白組分存在著較大差異,60%-SPI的可溶性蛋白含量,硒含量都較高。硫酸銨處理后的SPI組分α-螺旋含量增加,β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量均減小,說明硫酸銨分離得到的蛋白的結(jié)構(gòu)有序性得到提高。X-射線衍射和原子力顯微鏡結(jié)果表明大豆富硒蛋白組分的晶型和表面形態(tài)也存在較大差異。綜合來看,分離純化大豆富硒蛋白,較佳的硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%。

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Preliminary study on ammonium sulfate precipitation of selenium-enriched soybean protein isolate

ZHAO Xiao-li,FU Yang,ZHAO Qiang*,NING Fang-jian,XIONG Hua

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

In this study,soybean protein isolate(SPI)was extracted by alkali extraction and acid precipitation from natural selenium-enriched soybean,and SPI was sequentially precipitated by 40%,60%,and 80% of ammonium sulfate to obtain three protein fractions,which were 40%-SPI,60%-SPI,and 80%-SPI. In order to explore ways of selenium-enriched SPI fractionation by ammonium sulfate,the differences among the protein fractions were compared. The results showed that 60%-SPI had highest protein purity and selenium content. CD spectroscopy and SDS-PAGE results showed that the secondary structure and subunit composition were significantly different among the fractions. Through X-ray diffraction and atomic force microscopy,it found that crystal morphology and surface protein composition of the three fractions also varied widely. Therefore,ammonium sulfate salting precipitation was an effective primary screening method for separating selenium-enriched SPI with difference components,and 60% ammonium sulfate concentration was preferred.

Selenium-enriched soybean protein;ammonium sulfate precipitation;secondary structure;SDS-PAGE;Surface morphology

2016-01-14

趙小莉(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：大豆含硒蛋白化學(xué)與功能，E-mail:1303781824@qq.com。

趙強(qiáng)(1981-)，男，博士，副研究員，研究方向：植物蛋白質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)、食品資源開發(fā)與綜合利用、乳液及微膠囊等，E-mail:qiangzhao@ncu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301436)。

TS202.3

A

1002-0306(2016)13-0092-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.010