孫宇杰，柳佳志，王智柔，雷琎，林連兵

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650500）

噬菌體SYJ4及其對(duì)肉雞痢疾治療效果的初步探究

孫宇杰，柳佳志，王智柔，雷琎，林連兵*

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650500）

為了分離以致病性痢疾志賀菌（Shigella dysenteriae）CMCC （B） 51105為宿主菌的烈性噬菌體，并分析其生物學(xué)特性及其對(duì)患痢疾肉雞的治療效果，采用雙層平板法從水樣中分離純化獲得烈性噬菌體SYJ4，其最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1，最適感染溫度為37 ℃，最適感染pH范圍在6-8；一步生長(zhǎng)曲線表明噬菌體SYJ4裂解量約為50，潛伏期約為20 min，裂解期約為120 min；將無(wú)菌噬菌體富集液通過(guò)灌喂方式作用于由S. dysenteriae CMCC （B）51105導(dǎo)致的出現(xiàn)明顯白痢癥狀的病雞中并與鏈霉素治療效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明噬菌體SYJ4對(duì)痢疾志賀菌（S. dysenteriae）CMCC （B） 51105引起的雞痢疾具有一定治療效果，其治療效果與鏈霉素相仿，并在控制雞腸道志賀氏菌群數(shù)量上優(yōu)于鏈霉素。研究表明對(duì)于將噬菌體應(yīng)用于肉禽細(xì)菌性腸道疾病治療研究具有一定的參考價(jià)值。

噬菌體；痢疾志賀菌；噬菌體治療；肉禽；痢疾

孫宇杰， 柳佳志， 王智柔， 雷琎， 林連兵. 噬菌體SYJ4及其對(duì)肉雞痢疾治療效果的初步探究［J］. 農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究， 2016，37（3）: 601-605.

本試驗(yàn)旨在通過(guò)分離雞致病性痢疾志賀氏菌S. dysenteriae CMCC （B） 51105 敏感的烈性噬菌體，并利用分離到的噬菌體對(duì)患痢疾肉雞進(jìn)行治療試驗(yàn)并與鏈霉素治療效果進(jìn)行比較，探究噬菌體在禽類(lèi)腸道細(xì)菌感染的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采樣樣品的富集培養(yǎng)采用GN增菌培養(yǎng)基（GN BROTH，HAJNA），宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和后續(xù)的噬菌體分離采用LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基。

痢疾志賀菌S. dysenteriae CMCC （B） 51105為昆明理工大學(xué)鄧先余博士惠贈(zèng)。以1%接種量將活化后的痢疾志賀菌接入GN增菌液中，37 ℃，150 rpm震蕩培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期（OD600≈0.2）后，4 ℃冷藏備用。

GN增菌液：胰蛋白胨20 g；葡萄糖1 g；甘露醇2 g；檸檬酸鈉5 g；去氧膽酸鈉0.5 g；磷酸氫二鉀4 g；磷酸二氫鉀1.5 g；氯化鈉5 g；蒸餾水1 000 ml；pH = 7.0±0.2；半固體培養(yǎng)基加入終濃度為0.4%瓊脂，固體培養(yǎng)基加入終濃度為2%瓊脂，經(jīng)115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min后使用。

1.2 噬菌體的富集、分離及其生物學(xué)特征

采集校園污水廠的泥水混合物50 ml，充分震蕩后，靜置沉降10 min后取上清5 ml，接入200 ml 由GN增菌液配置成的宿主細(xì)菌菌液（OD600≈0.2）中，37 ℃，160 rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，之后8 000×g離心20 min。取上清用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后，4 ℃冷藏備用。采用雙層瓊脂平板法分離噬菌體［8］，取100 μl 噬菌體富集液與100 μl 宿主菌液混合，靜置吸附15-20 min，后向其中傾入4.0 ml 于40 ℃預(yù)熱的LB半固體瓊脂培養(yǎng)基，顛倒混勻后平鋪于事先準(zhǔn)備好的下層LB固體瓊脂培養(yǎng)基，待半固體培養(yǎng)基完全凝固后，膠帶封口，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置隔夜培養(yǎng)。若出現(xiàn)透明圓圈則說(shuō)明篩選到以痢疾志賀氏菌為宿主菌的噬菌體，挑取噬菌斑進(jìn)行四次純化獲得單株噬菌體［9］。

培養(yǎng)宿主菌痢疾志賀菌至對(duì)數(shù)期前期（OD546= 0.214），菌體濃度約為1.5×107cfu/ml。按照感染復(fù)數(shù)為0.001，0.01，0.1，1，10，加入噬菌體純培養(yǎng)液和宿主菌菌液，添加LB液體培養(yǎng)基使每管液體體積相同。設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)加設(shè)不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體作為為空白對(duì)照，于37 ℃，160 rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3.5 h，用雙層平板法測(cè)定噬菌體滴度，以產(chǎn)生最高噬菌體滴度所對(duì)應(yīng)的MOI作為最佳感染復(fù)數(shù)［10］。

取宿主細(xì)菌菌液5 ml（1.6×1010），加入噬菌體液使MOI=0.1，37 ℃靜置吸附15 min后12 000×g離心30 s，棄上清，使用LB液體培養(yǎng)基洗滌2次，加入同體積37 ℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基并充分混勻，迅速置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)（37 ℃，160 rpm），每隔10 min測(cè)定培養(yǎng)液中噬菌體滴度，以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體滴度為縱坐標(biāo)，繪制一步生長(zhǎng)曲線［11］。

將一定滴度的噬菌體液分別置于0 ℃，4 ℃，20 ℃，37 ℃，50 ℃，65 ℃，80 ℃下存放1 h，后分別測(cè)定其噬菌體滴度［12］，分析溫度對(duì)噬菌體活性的影響。

配制pH值分別為3，4，5，6，7，8，9，10，11的緩沖液體系（檸檬酸緩沖液，磷酸鹽緩沖液，Tris-HCl緩沖液，Na2CO3緩沖液）各取990 μl加入1.5 ml的無(wú)菌Eppendorf管中，再向各管中加入10 μl滴度為1×108pfu/ml的噬菌體純培養(yǎng)液，37 ℃靜置1 h后進(jìn)行滴度測(cè)定［13］，分析pH對(duì)噬菌體活性的影響。

1.3 噬菌體治療試驗(yàn)

選用120日齡的健康A(chǔ)A肉雞15羽，平均體重為1.65 kg，隨機(jī)分配為3組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1羽。均飼喂基礎(chǔ)日糧，基礎(chǔ)日糧參照美國(guó)NRC（1994）肉雞營(yíng)養(yǎng)需要充分混合成顆粒狀全價(jià)飼料。飼喂水源為0.9% NaCl溶液，所有試驗(yàn)組均為自由攝食［13］。

試驗(yàn)組分為3組，命名為A，B，C。試驗(yàn)前先停止水源供給4 h，后人工灌喂痢疾志賀菌菌液（處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期）40 ml，4 h后進(jìn)行如下分組處理：

A組：人工灌喂20 ml噬菌體純培養(yǎng)液（滴度為4.00×1010pfu/ml）；

B組：人工灌喂20 ml鏈霉素溶液（濃度為0.2%）；

C組：人工灌喂20 ml經(jīng)過(guò)滅活處理（濕熱滅菌鍋中，121 ℃，30 min）的噬菌體培養(yǎng)液。

在收集糞樣時(shí)同時(shí)觀察糞樣形態(tài)及肉雞的活動(dòng)狀態(tài)，樣品收集時(shí)使用50 ml滅菌處理的離心管收集每個(gè)試驗(yàn)組的糞便，稱(chēng)量糞樣重量后，加入20 ml滅菌處理的4 ℃、0.9% NaCl溶液。充分震蕩使糞樣完全分散，靜置5-10 min后取上清供分析。

采用SS培養(yǎng)基分析以上樣品中志賀菌的含量，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，單位重量樣品細(xì)菌含量為縱坐標(biāo)繪制出志賀菌數(shù)量變化曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體分離及其生物學(xué)特征

使用雙層平板法分離獲得噬菌體的噬菌斑形態(tài)（圖1）。噬菌斑透明，邊緣清晰，直徑為2.0-3.0 mm，可見(jiàn)此噬菌體為烈性噬菌體，對(duì)宿主菌有很強(qiáng)的裂解作用，命名為SYJ4。

圖1 噬菌斑形態(tài)Fig. 1 Bacteriophage plaques on the double-layer plate

按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.001，0.01，0.1，1，10加入噬菌體純培養(yǎng)液和宿主細(xì)菌菌液，培養(yǎng)3.5 h后所測(cè)定的滴度結(jié)果見(jiàn)表1。當(dāng)MOI=0.1時(shí)，測(cè)得滴度為7.52×1010pfu/ml，為5個(gè)試驗(yàn)組中的最大值，因此最佳感染復(fù)數(shù)為0.1，說(shuō)明噬菌體SYJ4具有較強(qiáng)的侵染能力。

表1 噬菌體SYJ4最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定Table 1 The determination of bacteriophage SYJ4 on optimal multiplicity of infection （MOI）

通過(guò)噬菌體SYJ4的一步生長(zhǎng)曲線（圖2）可知，噬菌體潛伏期約為20 min，裂解期約為120 min，經(jīng)計(jì)算，噬菌體感染宿主菌的裂解量約為50。噬菌體SYJ4的潛伏期、裂解期和裂解量和大腸桿菌噬菌體類(lèi)似，裂解量高更有利于提高侵染的速率。

使用不同溫度處理噬菌體SYJ4后進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)表明（圖3），37 ℃處理后噬菌體滴度剩余最大，而低溫下噬菌體滴度減少不大，隨著溫度的升高，噬菌體的存活率開(kāi)始下降，50 ℃和60 ℃處理60 min后滴度分別降至67%和19%，80 ℃處理60 min后噬菌體失活，說(shuō)明噬菌體SYJ4熱穩(wěn)定性較差，在37 ℃有很好的穩(wěn)定性同樣有助于其在腸道中的生存。

圖2 噬菌體SYJ4的一步生長(zhǎng)曲線Fig. 2 One-step growth curve of bacteriophage SYJ4

圖3 溫度對(duì)噬菌體活性的影響Fig. 3 Effect of temperature on bacteriophage activity

噬菌體SYJ4的最適pH范圍為6-8（圖4），在7.3左右剩余滴度最高，在pH≥10和pH≤6時(shí)噬菌體滴度下降較快，當(dāng)pH=10.82時(shí)，噬菌體的滴度剩余6×108pfu/ml，僅為起始噬菌體活性的8%，pH為4-7時(shí)噬菌體的滴度下降較pH為7-10時(shí)更加快，表明SYJ4噬菌體對(duì)堿性環(huán)境的耐受性較酸性環(huán)境更強(qiáng)一些，噬菌體SYJ4的pH值適應(yīng)性有助于其在腸道pH環(huán)境中生存。

圖4 pH對(duì)噬菌體活性的影響Fig. 4 Effect of pH value on bacteriophage activity

2.2 噬菌體治療試驗(yàn)

對(duì)所有試驗(yàn)組在飼喂菌液4 h后的癥狀觀察表明（表2），它們均出現(xiàn)下痢癥狀，同時(shí)開(kāi)始減少進(jìn)食量直至停止進(jìn)食，活動(dòng)量減少至幾乎不再運(yùn)動(dòng)。飼喂菌液12 h后，A，B組均開(kāi)始逐步增加進(jìn)食量，活動(dòng)量逐步恢復(fù)至飼喂菌液前水平，糞便逐步由水樣轉(zhuǎn)變?yōu)榫G便，最終轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色大顆粒狀，而C組則恢復(fù)緩慢，糞樣均為水樣或綠便?？梢?jiàn)，噬菌體和鏈霉素均具有明顯的治療。

表2 不同試驗(yàn)組癥狀變化比較Table 2 The comparison of symptom changes in the different treatment groups

進(jìn)一步對(duì)不同試驗(yàn)組糞便樣品中志賀氏細(xì)菌數(shù)量變化研究表明，A組（噬菌體治療組）飼喂菌液約2 h后，單位重量糞樣的志賀氏活菌量開(kāi)始顯著上升，于約8 h后達(dá)到最高值，達(dá)到3×107cfu/g（鮮重），之后志賀氏活菌量開(kāi)始下降，在10-12 h時(shí)間段內(nèi)，平均下降速度約為1×105cfu/（g.min），15 h后基本穩(wěn)定至103cfu/g（圖5），為喂菌前水平。

圖5 試驗(yàn)組志賀氏細(xì)菌變化Fig. 5 The concentration change of Shigella during the treatment time

B組（鏈霉素治療組）飼喂菌液約3 h后，單位重量糞樣的志賀氏活菌量開(kāi)始顯著上升，于約8 h后達(dá)到最高值，達(dá)到4×107cfu/g（鮮重），之后志賀氏活菌量開(kāi)始下降，在8-10 h時(shí)間段內(nèi)，平均下降速度約為3×105cfu/（g.min），16 h后基本穩(wěn)定至103cfu/g，為喂菌前水平。

C組（空白對(duì)照組）飼喂菌液約2 h后，單位重量糞樣的志賀氏活菌量開(kāi)始顯著上升，于約6 h后達(dá)到最高值，達(dá)到2×108cfu/g（鮮重），之后志賀氏活菌量開(kāi)始緩慢下降，在8-20 h時(shí)間段內(nèi)，平均下降速度約為1.78×105cfu/（g.min），飼喂菌液后在16 h內(nèi)未能恢復(fù)至喂菌前水平。

對(duì)A組（噬菌體治療組）中噬菌體數(shù)量變化分析表明（圖6），噬菌體呈階梯上升，于約11 h達(dá)到峰值，最高時(shí)滴度達(dá)到6×108pfu/g（鮮重）左右，隨后開(kāi)始下降，隨著志賀氏菌量的急劇減少，噬菌體數(shù)量隨后也顯著下降，并維持在較低的水平，這有利于進(jìn)一步控制志賀氏菌的增殖。

圖6 A組噬菌體和志賀氏細(xì)菌變化Fig. 6 The concentration changes of Shigella and phages in group A

志賀氏菌是重要的食源性病原菌之一，目前臨床主要以抗生素治療痢疾，但耐藥菌株的出現(xiàn)和增加，局限了抗生素治療方式［14］。而噬菌體與傳統(tǒng)的抗生素比較，具有特異殺菌特點(diǎn)，且可隨宿主菌共同進(jìn)化，因此不易產(chǎn)生抗性菌株。Gohary等［15］將噬菌體噴灑在雞舍中來(lái)阻止肉雞的大腸桿菌病，使肉雞死亡率顯著下降（P≤0.05），Kim等［16］研究了將噬菌體作為肉雞日糧添加劑后對(duì)不同飼養(yǎng)環(huán)境中肉雞生長(zhǎng)狀況和盲腸菌群變化的影響情況，表明噬菌體可以促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)并可以降低宿主病原菌的數(shù)量，Kim等［17］評(píng)價(jià)了腸炎沙門(mén)氏菌噬菌體作為肉雞飼料來(lái)抑制腸炎沙門(mén)氏菌的效果，表明除了可以降低腸炎沙門(mén)氏菌造成的死亡率外，將噬菌體以0.2%的濃度加入飼料中對(duì)肉雞生長(zhǎng)不會(huì)造成消極影響。

本試驗(yàn)測(cè)定了SYJ4的生理特性，當(dāng)以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1時(shí)接種，滴度較高，為7.52×1010pfu/ml，在一步生長(zhǎng)曲線中可以看出，噬菌體SYJ4

3 討論

的潛伏期較短，為20 min，長(zhǎng)于張輝等［18］報(bào)道的痢疾志賀氏菌S. dysenteriae噬菌體（潛伏期為10 min），但短于Turner等［19］介紹的沙門(mén)氏噬菌體vB_ SenS-Ent1（潛伏期為20 min），與大腸桿菌噬菌體平均潛伏期（25-27 min）相似［18］。

本試驗(yàn)表明，痢疾志賀氏菌S. dysenteriae CMCC （B） 51105可導(dǎo)致肉雞出現(xiàn)明顯下痢癥狀。而鏈霉素和噬菌體SYJ4均對(duì)其有類(lèi)似的治療效果，且噬菌體SYJ4在控制雞腸道志賀氏菌群數(shù)量上有一定的優(yōu)勢(shì)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所分離到的噬菌體能為取代抗生素用于控制禽畜腸道致病菌提供可行的辦法。

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（責(zé)任編輯：童成立）

The therapeutic effect of bacteriophage SYJ4 on diarrhea in broiler chickens

SUN Yu-jie， LIU Jia-zhi， WANG Zhi-rou， LEI Jin， LIN Lian-bing
（Faculty of Life Science and Technology， Kunming University of Science and Technology，Kunming， Yunnan 650500， China）

To isolate bacteriophages with the capacity of infecting Shigella dysenteriae CMCC （B） 51105， bacteriophage named SYJ4 was separated and purifed from sewage sample using double-plate method， then its preliminary biological characteristics and therapeutic effect on diarrhea in chickens were further analyzed. Results showed that SYJ4 had an optimal MOI （multiplicity of infection） as 0.1， the optimal infection temperature was 37 ℃， and its optimal infection pH ranged from 6 to 8. One-step growth curve also showed that SYJ4 was a variety of virulent phage， its burst size was 50， and the incubation period and the burst time were about 20 min and 120 min， respectively. Compared with the therapeutic effect of streptomycin， the chickens fed phage SYJ4 by gavage suffered from diarrhea caused by S. dysenteriae CMCC （B） 51105， which indicated that to some degree， bacteriophage SYJ4 had the same therapeutic effect on diarrhea caused by S. dysenteriae， however， its function on controlling the number of S. dysenteriae in intestine of chickens was better than the streptomycin. Therefore， the study will provide a certain valuable method for treating the meat and poultry bacterial intestinal disease with the phage therapy.

bacteriophage； Shigella dysenteriae； phage therapy； meat animals； dysentery

隨著對(duì)抗生素濫用所產(chǎn)生后果的深入認(rèn)識(shí)，如何減少化學(xué)藥物和制劑的應(yīng)用已成為養(yǎng)殖業(yè)生存和發(fā)展的嚴(yán)峻問(wèn)題［1］。噬菌體的侵染具有高度的專(zhuān)一性，當(dāng)噬菌體感染細(xì)菌時(shí)，可在細(xì)菌中繁殖并殺死細(xì)菌，但其對(duì)動(dòng)植物或人體本身沒(méi)有毒性［1］。在自然界中凡是有細(xì)菌分布的地方，均可發(fā)現(xiàn)特異噬菌體的存在［2］。因此，噬菌體以其特有的自然特征有望成為理想的抗菌藥和新型生物殺菌制劑［3］。美國(guó)FDA已批準(zhǔn)噬菌體作為食品添加劑用于殺滅食品中的李斯特菌（Listeria monocytogenes）［4］，Miller等［5］證明了將噬菌體應(yīng)用于控制肉禽壞死性腸炎的有效性，Huff等［6］證明了使用噬菌體飼喂1日齡肉禽可以預(yù)防氣管內(nèi)大腸桿菌導(dǎo)致的疾病。

志賀氏菌（Shigella）是胃腸疾病感染的主要病原菌，嚴(yán)重影響禽畜及人類(lèi)衛(wèi)生健康。而痢疾志賀氏菌（S. dysenteriae）造成的細(xì)菌性痢疾已發(fā)展為世界性流行趨勢(shì)，志賀氏菌株血清型分布的多樣性表明在亞洲需要有多效或有交叉保護(hù)性的志賀氏菌疫苗［7］。禽畜養(yǎng)殖場(chǎng)為防治家禽的疾病發(fā)生一般將在飼料和水體中常規(guī)投入抗生素或消毒劑。

National Natural Science Foundation of China （31160035）； National Undergraduate Training Programs for Innovation and Entrepreneurship （201310674005）.

LIN Lian-bing， E-mail: linlb@kmust.edu.cn.

11 February， 2015； Accepted 23 September， 2015

TS201.3；Q939.48

A

1000-0275（2016）03-0601-05

10.13872/j.1000-0275.2015.0141

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160035）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（201310674005）。

孫宇杰（1992-），男，山西陽(yáng)泉人，本科在讀，E-mail: id201211805154@hotmail.com；通訊作者：林連兵（1969-），男，湖南通道人，教授，碩士生導(dǎo)師，現(xiàn)主要從事微生物在農(nóng)業(yè)和環(huán)保領(lǐng)域的應(yīng)用研究，E-mail: linlb@kmust.edu.cn。

2015-02-11，接受日期：2015-09-23