崔田田,張寶善,馮亞運(yùn),王金丹,林　敏

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119)

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霉菌利用纖維質(zhì)原料產(chǎn)乙醇的研究進(jìn)展

崔田田,張寶善*,馮亞運(yùn),王金丹,林敏

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119)

利用霉菌發(fā)酵纖維質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇技術(shù)越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注。本文列出了具有潛在產(chǎn)乙醇能力的霉菌種類,介紹了有關(guān)霉菌代謝糖類物質(zhì)的機(jī)理及霉菌產(chǎn)乙醇的特點(diǎn),同時(shí)指出不同因素對(duì)霉菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響,這對(duì)探索霉菌利用纖維質(zhì)原料制備乙醇新方法具有一定的指導(dǎo)意義。

纖維質(zhì)原料,霉菌,乙醇

當(dāng)前,能源危機(jī)已成為世界問(wèn)題,利用微生物生產(chǎn)燃料酒精等生物能源被認(rèn)為是解決能源問(wèn)題的最有效、最能實(shí)現(xiàn)的方法之一?，F(xiàn)在燃料酒精生產(chǎn)大多以糖類或淀粉質(zhì)原料為原料,但產(chǎn)量受到糧食資源的限制,難以長(zhǎng)期滿足能源需求。人們?cè)趯ふ倚滦驮蠒r(shí)發(fā)現(xiàn)纖維質(zhì)是一種良好的可再生替代源[1],部分微生物可利用纖維質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)酒精和其他清潔燃料,如金花等人對(duì)Mucor indicus利用麥稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇進(jìn)行了研究,結(jié)果表明M.indicus較釀酒酵母的顯著優(yōu)勢(shì)在于不僅能利用秸稈水解液中的葡萄糖,而且也能利用其中的木糖產(chǎn)生乙醇[2]。纖維質(zhì)原料主要包括農(nóng)作物秸稈、林業(yè)加工廢料、甘蔗渣及城市垃圾中所含的廢棄生物質(zhì)等[3]。一直以來(lái),酵母被認(rèn)為是生產(chǎn)乙醇的常用菌種,但酵母菌不能將纖維質(zhì)原料水解成木糖,并將其轉(zhuǎn)化為酒精,限制了其在纖維素乙醇領(lǐng)域的利用。細(xì)菌也能進(jìn)行酒精發(fā)酵,但它們?cè)诋a(chǎn)乙醇的同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物,致使乙醇的轉(zhuǎn)化率較低,經(jīng)濟(jì)成本很高[4]。霉菌屬微生物利用纖維質(zhì)原料也能產(chǎn)酒精,但很少受到關(guān)注,這是因?yàn)槊咕趥鹘y(tǒng)上被認(rèn)為是好氧菌屬,需在有氧條件下生長(zhǎng),而酒精發(fā)酵是厭氧過(guò)程[5]。其中選用合適的菌種發(fā)酵纖維素生產(chǎn)酒精對(duì)工業(yè)化應(yīng)用極為重要[6]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)部分霉菌具有直接把纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的能力,這就為我們?cè)谕粋€(gè)生物反應(yīng)器中,利用同一種微生物完成酶水解纖維質(zhì)原料成多糖并發(fā)酵成酒精的全過(guò)程,從而為簡(jiǎn)化工藝、降低成本提供了可能[7]。

本文綜述了霉菌利用纖維素原料轉(zhuǎn)化為酒精的研究進(jìn)展,列舉了幾種具潛在發(fā)酵酒精能力的霉菌種類,介紹了霉菌發(fā)酵糖類物質(zhì)的機(jī)理、霉菌產(chǎn)酒精的特點(diǎn)以及影響其酒精發(fā)酵的因素,同時(shí)提出了目前霉菌產(chǎn)酒精存在的問(wèn)題,并對(duì)其未來(lái)的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1　產(chǎn)酒精的霉菌種類

霉菌一般可在較高溫度下生存,且其產(chǎn)酒精經(jīng)常伴隨著有氧菌絲生長(zhǎng)及無(wú)氧發(fā)酵兩個(gè)階段,且霉菌可利用多種糖類物質(zhì)尤其是酵母所不能利用的戊糖類,部分霉菌可將纖維素類物質(zhì)直接轉(zhuǎn)化為酒精。有報(bào)道能產(chǎn)乙醇的霉菌包括尖鐮孢菌(Fusarium)、根霉屬(Rhizopus)、毛霉屬(Mucor)、粗糙脈孢菌(Neurospora)、念珠菌屬(Monilia)、擬青霉屬(Paecilomyces)、和曲霉屬(Aspergillus)等。

表1　產(chǎn)乙醇霉菌種類及其特點(diǎn)

Lubbehusen等人研究了Mucorcircinelloides采用液態(tài)深層分批發(fā)酵方式,利用多種碳源產(chǎn)酒精的情況,結(jié)果表明M.circinelloides在不限氧條件下可利用葡萄糖產(chǎn)生酒精,而其轉(zhuǎn)化半乳糖及木糖產(chǎn)酒精能力相對(duì)較弱[8]。Goshadrou等人采用Mucorhiemalis作為發(fā)酵菌種對(duì)不同預(yù)處理的甘蔗渣進(jìn)行發(fā)酵,其中利用堿液輔助超聲破碎法處理后的甘蔗渣水解物M.hiemalis具有較高的酒精轉(zhuǎn)化率,發(fā)酵24h酒精產(chǎn)率達(dá)到0.70g/L(h[9]。美國(guó)人Stevenson在農(nóng)場(chǎng)的奶牛尿中分離出一株菌,在厭氧的條件培養(yǎng),能直接將纖維素發(fā)酵成酒精,產(chǎn)量為0.4g/L,經(jīng)鑒定此菌株為木霉[17]。張志華對(duì)N.crassa AS3.1602好氧產(chǎn)酶和厭氧直接發(fā)酵產(chǎn)生酒精的過(guò)程進(jìn)行了代謝分析,以20g/L的微晶纖維素為碳源進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng),好氧發(fā)酵3d時(shí)菌體處于穩(wěn)定期,所產(chǎn)生的酶活性都處于較高水平。厭氧條件下直接轉(zhuǎn)化20g/L的微晶纖維素,發(fā)酵96h時(shí)酒精濃度可達(dá)到6.3g/L[18]。Gong等人發(fā)現(xiàn)Monilia sp.能夠?qū)⒏哂?0%的濾渣和60%的微晶纖維素轉(zhuǎn)化為酒精,并且乙醇產(chǎn)量分別達(dá)到16、12g/L[21]。研究表明Monilia sp.還可以利用半纖維素及果膠,由于農(nóng)業(yè)殘?jiān)闹饕煞质前肜w維素因而提高了該菌種工業(yè)化應(yīng)用的潛在能力。表1列出了可以產(chǎn)乙醇的霉菌種類及其特點(diǎn)。

2　霉菌轉(zhuǎn)化纖維質(zhì)產(chǎn)乙醇的機(jī)理

霉菌可利用纖維質(zhì)降解的糖類物質(zhì)如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等生產(chǎn)乙醇。到目前為止,關(guān)于霉菌直接將纖維素轉(zhuǎn)化為酒精的報(bào)道很少,而F.oxysporum[10]和N.crassa[18]被發(fā)現(xiàn)具有將水解和酒精轉(zhuǎn)化過(guò)程同時(shí)進(jìn)行的能力。

利用微生物轉(zhuǎn)化纖維質(zhì)原料產(chǎn)乙醇的步驟有兩步[6]:纖維素水解成可發(fā)酵性糖,微生物將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為酒精。有關(guān)微生物代謝葡萄糖產(chǎn)生酒精的機(jī)制已經(jīng)很清楚,霉菌和酵母菌是通過(guò)EMP途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精。EMP途徑大致可分為兩個(gè)階段:第一階段只是生成兩分子的主要中間代謝產(chǎn)物3-磷酸-甘油醛;第二階段發(fā)生氧化還原反應(yīng),釋放能量合成ATP,同時(shí)形成兩分子的丙酮酸。理論上1g葡萄糖可產(chǎn)生0.51g乙醇和0.49g CO2,乙醇及CO2產(chǎn)生實(shí)際值分別為0.46、0.44g,因?yàn)橛?.1g的葡萄糖轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)。盡管微生物自身代謝機(jī)制可以促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞,但糖代謝過(guò)程影響因素很復(fù)雜,目前還沒完全被大家所熟知。在酵母屬中發(fā)現(xiàn)兩條主要的抑制葡萄糖代謝因素包括巴斯德效應(yīng)及葡萄糖效應(yīng)。

對(duì)于利用木糖代謝,第一步要將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖,細(xì)菌可直接利用木糖異構(gòu)酶將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖,而對(duì)于擬青霉屬,在戊糖代謝初始階段中會(huì)檢測(cè)到一系列的酶,這些酶常見于酵母屬和霉菌屬。在該氧化還原途徑中,木糖首先在NAD(P)作為輔酶的木糖還原酶作用下變?yōu)槟咎谴?接著在木糖醇脫氫酶作用下重新氧化成木酮糖[22]。該氧化還原途徑已被證明存在于大多數(shù)常見的霉菌中,本過(guò)程中涉及到的木糖還原酶及木糖醇脫氫酶具有可誘導(dǎo)性,并且專一作用于D-木糖及木糖醇,但細(xì)菌中的木糖異構(gòu)酶不具有可誘導(dǎo)性。在木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖后,由D-木酮糖磷酸化生成D-木酮糖-5-磷酸,之后進(jìn)入磷酸戊糖途徑,以中間產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸進(jìn)入EMP途徑,最終在厭氧條件下生成乙醇,如圖1。戊糖代謝途徑遠(yuǎn)比己糖代謝復(fù)雜,這也是霉菌利用戊糖產(chǎn)酒精較己糖低的原因。

圖1　霉菌利用單糖代謝途徑Fig.1　Pathway for monosaccharide catabolismin filamentous fungi

3　霉菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的特點(diǎn)

3.1同步糖化和生物轉(zhuǎn)化

纖維質(zhì)經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為乙醇的傳統(tǒng)工藝主要包括兩步:首先在酶解糖化作用下將多糖降解為單糖;其次將單糖轉(zhuǎn)化為乙醇。為了提高工業(yè)效率,有研究者采用不同的纖維素酶產(chǎn)生菌與酒精發(fā)酵菌種共同培養(yǎng),使酶解與產(chǎn)酒精過(guò)程在同一反應(yīng)器中進(jìn)行。采用同步糖化發(fā)酵法可以緩解終產(chǎn)物抑制作用,因?yàn)樗夂螽a(chǎn)生的葡萄糖在該系統(tǒng)中可以很快轉(zhuǎn)化為乙醇。

F.oxysporum因其具有產(chǎn)多糖酶及發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)酒精能力而使它成為同步糖化與生物轉(zhuǎn)化的理想菌種。Panagiotou等人將F.oxysporumF3置于30℃,pH6的培養(yǎng)液中孵育72h,該階段為菌種的生長(zhǎng)產(chǎn)酶期,通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速率將氧濃度控制在30%;之后將菌種接入濃度為20g/L的纖維素漿液中進(jìn)行厭氧發(fā)酵。結(jié)果表明F.oxysporumF3在纖維素基質(zhì)中最大比生長(zhǎng)速率達(dá)到0.023h-1,且產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶及纖維二糖酶活性分別為55、1.25、0.43U/mL,其發(fā)酵纖維素生成乙醇得率為0.35g/g[23]。近年來(lái),Zerva等人實(shí)驗(yàn)證明Paecilomycesvariotii可將葡萄糖、木糖轉(zhuǎn)化為乙醇,即使在有葡萄糖存在時(shí)仍優(yōu)先利用木糖,該菌種不僅能產(chǎn)生可降解纖維素的酶,并能將水解底物轉(zhuǎn)化為乙醇,且最大乙醇產(chǎn)量接近理論值[24]。

表2　不同種類真菌產(chǎn)纖維素酶及木聚糖酶活性的比較[18]

3.2直接生物轉(zhuǎn)化纖維素原料

霉菌直接將纖維素原料生物轉(zhuǎn)化是一項(xiàng)極具潛力的產(chǎn)乙醇方法,原因在于僅利用單一菌種即可將基質(zhì)的有氧水解和半?yún)捬鯒l件下的乙醇發(fā)酵過(guò)程同時(shí)進(jìn)行,既可產(chǎn)生水解酶又能進(jìn)行酒精發(fā)酵。

3.2.1多糖酶的產(chǎn)生纖維素酶是一種多組分的復(fù)合酶,現(xiàn)已確定纖維素酶含有3種主要組分,即內(nèi)切葡萄糖苷酶(EC3.2.1.4)、外切葡萄糖苷酶(EC3.2.1.91)和纖維二糖酶(EC3.2.1.21)。在纖維素水解過(guò)程中首先由內(nèi)切葡萄糖苷酶在纖維素鏈內(nèi)部水解,降低其聚合度,然后由外切葡萄糖苷酶作用于非還原性末端釋放出纖維二糖;最后由纖維二糖酶將纖維二糖水解為葡萄糖。有多種微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶,例如細(xì)菌、放線菌、絲狀真菌、粘細(xì)菌、擔(dān)子菌和其他高等形式軟體動(dòng)物等。研究發(fā)現(xiàn),某些微生物可以合成纖維素酶,但無(wú)法將水解得到的糖轉(zhuǎn)化為酒精。而某些微生物可將蔗糖轉(zhuǎn)化為酒精,但卻不能合成能夠水解纖維素的多糖酶。只有極少一部分絲狀真菌既能水解多糖又可以將水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為酒精,如表2所示。

Gong等人從甘蔗渣中分離的Moniliasp.可以利用多糖包括纖維素產(chǎn)生酒精,并產(chǎn)生纖維素酶及木聚糖酶。在菌種培育48h后可以檢測(cè)到纖維素酶的活性,當(dāng)纖維素作為發(fā)酵基質(zhì)時(shí),可以檢測(cè)到纖維素酶和木聚糖酶的活性[21]。有研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬(Streptomyces)在木聚糖作為碳源時(shí)也可以產(chǎn)生木聚糖酶,但木聚糖不是它們產(chǎn)生木聚糖酶所必需的,因?yàn)樵诩兝w維素或葡萄糖作為碳源時(shí)檢測(cè)到高活性的木聚糖酶[25]。在同步發(fā)酵中,酒精對(duì)纖維素酶產(chǎn)生非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,而產(chǎn)酒精霉菌所產(chǎn)生的纖維素酶在整個(gè)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中都保持其穩(wěn)定性。

3.2.2乙醇的轉(zhuǎn)化由于纖維素直接發(fā)酵法生產(chǎn)乙醇具有工藝簡(jiǎn)單,歷時(shí)短,有望大幅度降低產(chǎn)酶成本以及纖維素乙醇生產(chǎn)總成本,近二十年來(lái)該項(xiàng)技術(shù)研究受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視,有研究者報(bào)道了以嗜溫細(xì)菌(Clostridiumthermocellum)和C.thermohydrosulfuricum以及絲狀真菌N.crassa,Moniliasp.和F.oxysporum進(jìn)行纖維素直接發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[26]。

4　影響霉菌產(chǎn)乙醇的因素

4.1通氣量

研究發(fā)現(xiàn)大部分霉菌在有氧情況下生長(zhǎng),在半?yún)捬鯛顟B(tài)下產(chǎn)乙醇。通氣量對(duì)霉菌利用基質(zhì)中的碳源及最終乙醇的轉(zhuǎn)化量具有重要影響,乙醇積累只發(fā)生在低氧條件下。在缺氧情況下,霉菌生長(zhǎng)受到限制,隨著氧氣的限制量增加,乙醇的積累量表明氧氣利用率是決定乙醇產(chǎn)量的一個(gè)重要因素。隨著氧氣限制的增加,菌體生長(zhǎng)能力減弱,而乙醇產(chǎn)量逐漸增加。

Dogaris等人研究發(fā)現(xiàn)N.crassa產(chǎn)乙醇的兩個(gè)階段為:有氧生長(zhǎng)階段,粗糙脈孢菌在有氧條件下生長(zhǎng),逐漸產(chǎn)生纖維素酶及半纖維素酶;厭氧發(fā)酵階段,將菌種由生長(zhǎng)瓶轉(zhuǎn)移至特制錐形瓶中,該瓶頂部裝有針孔橡膠塞以降低氧氣的滲入同時(shí)排出CO2,該裝置同樣適用于F.oxysporum[27]。Lubbehusen等人研究發(fā)現(xiàn)卷枝毛霉不僅可以在完全厭氧條件下生長(zhǎng),并且能夠在葡萄糖過(guò)量時(shí)有氧條件下產(chǎn)生乙醇[28];Kurakov等人從不同地區(qū)篩選出多株霉菌在厭氧條件下利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)酒精,其最大生產(chǎn)量達(dá)到2.5%～4.7%,幾乎接近于酵母屬發(fā)酵生產(chǎn)酒精量[29]。Karimi等人發(fā)現(xiàn)在基質(zhì)葡萄糖濃度高于30g/L無(wú)氧條件下培養(yǎng)有助于提高M(jìn).indicus產(chǎn)生酒精量[30],另外由于M.indicus具有形態(tài)二相性,孢子濃度的大小以及所處環(huán)境中氧氣的含量都會(huì)對(duì)該菌形態(tài)產(chǎn)生一定的影響[31]。

Rasika等人研究白腐菌Trametes versicolor在完全缺氧及低氧含量?jī)煞N條件下利用木糖與己糖混合物發(fā)酵產(chǎn)乙醇,結(jié)果表明T.versicolor低氧條件下發(fā)酵354h后酒精轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大20g/L,而完全厭氧條件下未檢測(cè)到乙醇的產(chǎn)生[32]。Xiros和Christakopoulos以樹膠醛糖∶木糖∶葡萄糖(1∶2∶1)混合糖作為發(fā)酵基質(zhì),在通氣率分別為0、0.1、0.2及0.4vvm時(shí)觀察F. oxysporum利用混合糖產(chǎn)乙醇的情況。結(jié)果顯示在所有通氣條件下,乙醇產(chǎn)量72h時(shí)達(dá)到最大,而在完全厭氧條件下乙醇轉(zhuǎn)化較慢,120h后乙醇量才達(dá)到最大值;當(dāng)通氣率為0.1、0.2 vvm,發(fā)酵72h后基質(zhì)中檢測(cè)不到木糖,而在完全缺氧條件下F. oxysporum對(duì)木糖的吸收較慢,這說(shuō)明少量通氣對(duì)F. oxysporum利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇是極為必要的[33]。由此可見通氣量是影響霉菌生物轉(zhuǎn)化乙醇的一個(gè)重要因素,通過(guò)調(diào)節(jié)氣體比例可獲得較高產(chǎn)量的乙醇。

4.2碳源

到目前為止,生產(chǎn)乙醇主要采用傳統(tǒng)的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),然而Saccharomycescerevisiae并不能很好的適用于木質(zhì)纖維原料的發(fā)酵,它只能發(fā)酵葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖,不能轉(zhuǎn)化半纖維素中的戊糖。由于在木質(zhì)纖維素原料中存在大量的半纖維素,所以這一點(diǎn)限制了酵母菌的應(yīng)用[1]。

研究發(fā)現(xiàn)部分霉菌可產(chǎn)生降解纖維素酶,并將水解產(chǎn)物中的所有糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇。N.crassa是一種能夠利用多種碳源包括纖維素、木糖、樹膠醛糖、甘露糖、半乳糖以及葡萄糖生產(chǎn)酒精的霉菌,該菌種現(xiàn)以被廣泛應(yīng)用于基因?qū)W、生物化學(xué)以及分子生物學(xué)[34]。Dogaris等人采用經(jīng)稀酸前處理的甘蔗渣,分別以N.crassa、S.cerevisiae以及二者混合菌種作為發(fā)酵菌,結(jié)果表明N.crassa乙醇轉(zhuǎn)化能力高于S.cerevisiae,混合菌種發(fā)酵反而降低了乙醇產(chǎn)量[27]。另外,Paecilomycessp.NF1也可以利用多種糖作為碳源產(chǎn)生乙醇,Zhang等人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)P.chrysosporium是目前利用木糖產(chǎn)生乙醇量最大的菌種,產(chǎn)酒精量可高達(dá)73g·L-1/200g·L-1木糖,且只產(chǎn)生痕量的其他副產(chǎn)物[35]。

Sharifia采用M.indicus作為發(fā)酵菌種,分別利用不同的糖類物質(zhì)作為碳源,結(jié)果表明M.indicus可以利用糖漿中的葡萄糖、果糖產(chǎn)生乙醇,而不能直接利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精[14]。Millati 等人對(duì)Rhizopus,Rhizomucor,及Mucor分別利用葡萄糖、木糖和稀酸水解物作為碳源進(jìn)行乙醇發(fā)酵,結(jié)果表明其中兩株毛霉M.hiemalis和M.indicus產(chǎn)酒精量較高,其他菌種代謝除產(chǎn)生乙醇外,還會(huì)產(chǎn)生乳酸、丙三醇等副產(chǎn)物[36]。Colabardini 等人將A.nidulans的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)虢湍笇龠M(jìn)行表達(dá),提高了酵母屬對(duì)戊糖的利用率[37]。Rasika等人用Trametesversicolor發(fā)酵木質(zhì)素降解的己糖和木糖,結(jié)果表明在以己糖和木糖單獨(dú)作為碳源時(shí)產(chǎn)酒精量分別為20.0、9.02g/L,當(dāng)葡萄糖與木糖等比例時(shí),總糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇可達(dá)到80%[32]。

4.3氮源

有關(guān)氮元素對(duì)霉菌的生長(zhǎng)及代謝的影響已經(jīng)為大家熟知,銨離子可以通過(guò)ATP抵消對(duì)磷酸果糖激酶的抑制作用,進(jìn)而促進(jìn)糖酵解,其還可以刺激微生物生長(zhǎng),降低細(xì)胞內(nèi)的NADH水平,阻遏6-磷酸葡萄糖脫氫酶,從而促進(jìn)了磷酸戊糖途徑的進(jìn)行。很多學(xué)者對(duì)一系列的有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮進(jìn)行了研究,如表3所示,Asachi等人利用M.indicus的菌體自溶物代替酵母膏,結(jié)果顯示當(dāng)添加菌體自溶物10g/L時(shí),乙醇得率為0.47g/g,產(chǎn)率達(dá)到0.71g/L·h,相比于添加酵母膏的乙醇得率及產(chǎn)率分別為0.45、0.67g/L·h,乙醇產(chǎn)量明顯提高[33]。

表3　霉菌生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中利用的含氮化合物[39]

Zerva和Savvides采用尿素、NaNO3、NH4NO3、(NH4)2HPO4、(NH4)2SO4、蛋白胨及酵母膏作為氮源,以Paecilomyces variotii為發(fā)酵菌種利用等濃度葡萄糖、木糖作為發(fā)酵基質(zhì),結(jié)果表明以硝態(tài)氮作為氮源產(chǎn)乙醇量明顯較高[16]。

4.4礦物質(zhì)及維生素

有關(guān)礦物質(zhì)及微量元素對(duì)微生物代謝物的生物合成影響早有報(bào)道,但對(duì)霉菌產(chǎn)酒精的影響鮮有研究。有研究發(fā)現(xiàn)微量元素如Fe、Zn、Cu和Mn可以促進(jìn)Polyporusanceps的生長(zhǎng),而鈷在濃度為1～100mg/L時(shí)產(chǎn)生毒性,鉬對(duì)霉菌生長(zhǎng)基本無(wú)影響。另外發(fā)現(xiàn),硫胺素對(duì)P.anceps的生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用,隨著基質(zhì)中硫胺素濃度的增加,菌絲的重量增加,同時(shí)葡萄糖消耗量及乙醇產(chǎn)生量也隨之增加[40]。Marzieh等人研究了磷酸鹽對(duì)M.indicus產(chǎn)酒精量的影響,在基質(zhì)中添加0.5g/L的KH2PO4,不僅提高了葡萄糖胺的產(chǎn)量,同時(shí)也增加了乙醇產(chǎn)量[41]。

4.5接種期

接種期是影響纖維質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇的一個(gè)重要因素,研究發(fā)現(xiàn)將菌種在營(yíng)養(yǎng)液中搖床培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得菌體懸浮液接種至發(fā)酵基質(zhì),相比于直接從瓊脂斜面中獲得的菌體,前者所產(chǎn)生的乙醇量明顯較高。Goshadrou等人在研究M.hiemalis利用甘蔗渣發(fā)酵產(chǎn)乙醇情況時(shí),前期要進(jìn)行接種準(zhǔn)備,主要包括在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的活化以及在合適條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)以獲得孢子懸浮液,之后接種至發(fā)酵基質(zhì)中進(jìn)行發(fā)酵[9]。另外,接種量會(huì)通過(guò)改變生物過(guò)程的延遲期,進(jìn)而影響發(fā)酵過(guò)程中的乙醇產(chǎn)量。Molaverdi等人研究了不同接種量對(duì)M.indicus固態(tài)發(fā)酵高粱秸稈產(chǎn)酒精的影響,當(dāng)初始菌種濃度為0.001、1及5g/L對(duì)乙醇發(fā)酵的影響表現(xiàn)為隨著濃度的增加,乙醇產(chǎn)量也隨之增加[42]。Dogaris等人在利用N.crassa將高粱渣轉(zhuǎn)化乙醇實(shí)驗(yàn)中,將菌種在有氧條件下培養(yǎng)48h后獲得高濃度孢子懸浮液,取一定量的孢子液接入高粱渣水解液中,結(jié)果表明隨接種量的增加,酒精產(chǎn)生量也增加[27]。

4.6pH

最初學(xué)者們選取霉菌發(fā)酵產(chǎn)酒精的pH一般為5.0～6.0,Xiros和Christakopoulos利用F.oxysporum產(chǎn)乙醇最適pH為5.5,而當(dāng)pH為6.0時(shí),會(huì)產(chǎn)生較多的乳酸[33];N.crassa產(chǎn)乙醇最適pH范圍在5～6之間,這也是纖維素酶作用的最適pH[28];Paecilomycessp. NF1發(fā)酵最適pH范圍較廣,當(dāng)pH在2.2～7.0時(shí),可產(chǎn)生相同量的乙醇[16];而對(duì)于F.oxysporumF3,pH對(duì)其酒精產(chǎn)量的影響,在有氧和無(wú)氧情況下,最適pH分別為5.5和6.0。有氧條件下,低pH會(huì)導(dǎo)致酒精產(chǎn)量下降,因而調(diào)整最初pH在最適條件下既有利于β-葡萄糖苷酶的活性又有利于乙醇的產(chǎn)生[23]。

4.7溫度

乙醇發(fā)酵溫度一般在25～37℃,如表4所示,研究發(fā)現(xiàn)不同菌種的最佳發(fā)酵溫度不一致。N.crassa利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時(shí)的最適溫度為28～37℃,而其利用纖維質(zhì)原料發(fā)酵產(chǎn)乙醇時(shí)的最佳溫度為37℃,該溫度下90%的纖維素在4天后轉(zhuǎn)化為乙醇[28]。同樣,Paecilomycesp.發(fā)酵最適溫度范圍是30～37℃[16],而M.indicus發(fā)酵高粱秸桿產(chǎn)乙醇最適溫度為32℃[42]。

表4　霉菌產(chǎn)乙醇的最適溫度及pH

5　霉菌產(chǎn)乙醇存在問(wèn)題及展望

利用霉菌以纖維質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇是緩解化工原料消耗的一種有效手段,具有成本低、生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單以及可再生性等優(yōu)點(diǎn),對(duì)未來(lái)燃料酒精的生產(chǎn)發(fā)展具有無(wú)限潛力。但目前利用霉菌生產(chǎn)酒精仍未投入工業(yè)化生產(chǎn),原因在于該方法生產(chǎn)酒精仍存在一些問(wèn)題:第一,纖維素生物質(zhì)中除了含有大量的纖維素外,還有大約20%～30%的半纖維素,而半纖維素水解成分組成中含有五碳糖(主要為木糖),霉菌利用木糖發(fā)酵酒精的效率仍相對(duì)較低。第二,半纖維素經(jīng)預(yù)處理和水解過(guò)程后還產(chǎn)生了小分子酸、醛類、酚類等發(fā)酵抑制劑,更加大了發(fā)酵難度。第三,所采用的同步糖化發(fā)酵法還存在一定的缺點(diǎn),例如最佳的水解和最佳的發(fā)酵需要不同的溫度,最佳水解溫度為45～50℃,而最佳的發(fā)酵溫度為28～35℃。SSF常在35～38℃下操作,這一折中處理使酶的活性和發(fā)酵的效率都不能達(dá)到最大[44]。

到目前為止,盡管還沒找到完全令人滿意的將纖維質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇的菌種,但利用一些霉菌將纖維素、淀粉以及戊糖轉(zhuǎn)化為酒精仍給生產(chǎn)化工原料帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)效益。此外,通過(guò)對(duì)比不同因素對(duì)霉菌發(fā)酵乙醇的影響可知,嚴(yán)格控制通氣量相較于其他因素對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響顯著,因而需在進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)乙醇產(chǎn)業(yè)中通過(guò)調(diào)節(jié)氣體比例以提高酒精產(chǎn)量。目前生產(chǎn)燃料酒精是以玉米為原料,但原料成本占總成本的70%～80%。纖維素是地球上最豐富、最廉價(jià)可再生資源,因此研究開發(fā)纖維素轉(zhuǎn)化技術(shù),將秸稈、蔗渣、廢紙、垃圾纖維等纖維素類物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化為糖,進(jìn)一步發(fā)酵成乙醇,對(duì)開發(fā)新能源,保護(hù)環(huán)境,具有非常重要現(xiàn)實(shí)意義。

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Advances in bioconversion of cellulosic materials to ethanol by moulds

CUI Tian-tian,ZHANG Bao-shan*,FENG Ya-yun,WANG Jin-dan,LIN Min

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China)

Ethanol production,using cellulosic materials by moulds,has been paid more and more attention. The recent development of the ethanol production from cellulosic materials has been reviewed,including the potential fungal strains,the carbohydrate metabolism in moulds,the characteristics of ethanol producing moulds and the factors affecting ethanol production,in this paper,which has a certain guiding significance for exploring a new method to produce ethanol from cellulosic materials by moulds.

cellulosic materials;moulds;ethanol

2014-10-27

崔田田(1990-)，女，在讀碩士，主要從事食品發(fā)酵與質(zhì)量控制研究。

張寶善(1968-)，男，教授，副院長(zhǎng)，主要從事于食品微生物學(xué)、食品發(fā)酵學(xué)、果蔬加工學(xué)的教學(xué)、科研與生產(chǎn)服務(wù)工作。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000