張業(yè)婷，鐘 峰，姚 瑤，趙 俊，俞海洋，張文昌，陳敬賢，王明麗

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RTCA實時定量動態(tài)監(jiān)測HCMV在MRC-5細胞上的增殖的研究

張業(yè)婷，鐘 峰，姚 瑤，趙 俊，俞海洋，張文昌，陳敬賢，王明麗

目的 采用實時細胞分析（RTCA）系統(tǒng)監(jiān)測人巨細胞病毒（HCMV）在MRC-5細胞株上的復制增殖過程，評價此方法在動態(tài)監(jiān)測病毒增殖中的應用價值。方法 應用RTCA動態(tài)觀察MRC-5細胞在不同階段的生長指數(shù)（CI），選擇合適的細胞濃度進行HCMV增殖的研究，同時采用傳統(tǒng)的空斑形成試驗和間接免疫熒光實驗作為該方法學的比較和結(jié)果驗證。結(jié)果 選擇MRC-5最適細胞濃度為0.5× 105個/孔；與空斑試驗及免疫熒光結(jié)果比較，半數(shù)細胞指數(shù)CI值對應時間（CIT50）與病毒初始滴度有良好的線性關系；同時CI值與病毒滴度隨著時間的持續(xù)，顯示出明顯的負相關性（r=-0.977，P＜0.05）。結(jié)論 RTCA技術可實時監(jiān)測記錄細胞生長狀態(tài)，反應細胞貼壁、伸展，同時能實時定量監(jiān)測HCMV增殖復制狀況，數(shù)據(jù)客觀可靠，為今后基礎實驗研究提供了新的實驗技術和方法。

實時細胞檢測技術；人巨細胞病毒；增殖

網(wǎng)絡出版時間：2016-6-6 13：52：31 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.008.html

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬于皰疹病毒β亞科，是皰疹病毒科中最大的一種病毒，結(jié)構(gòu)復雜，基因組全長超過240 000 bp，病毒顆粒的直徑約為200 nm。據(jù)報道，發(fā)達國家HCMV的成人平均感染率為40%～60%，而發(fā)展中國家高達到90%以上［1］。目前該病毒還被認為與惡性腫瘤、糖尿病、心血管疾?。▌用}粥樣硬化）有關［2］。HCMV通常呈潛伏感染，對免疫功能低下的個體，如艾滋病、器官移植、腫瘤及使用免疫抑制劑的患者體內(nèi)HCMV病毒會被再激活，造成巨細胞病毒性視網(wǎng)膜炎、食管炎、胃炎、結(jié)腸炎、肝炎等終末器官綜合征。HCMV又是先天性感染最常見的病原體之一，對孕婦和胎兒危害極大，可引起死胎、流產(chǎn)、胎兒畸形和發(fā)育遲緩等病理性損害。HCMV活動性感染的孕婦可通過產(chǎn)道感染新生兒，導致新生兒小頭畸形、智力低下、黃疸、肝脾腫大、聽力或視力喪失等多臟器、多系統(tǒng)不可逆性損害［3］。美國國家科學研究院醫(yī)學研究所曾于1999年把研制預防先天性HCMV感染疫苗列為優(yōu)先級研究對象，但至今仍無疫苗獲準上市［4］。HCMV在細胞上的增殖復制的研究，能夠為抗HCMV病毒藥物的作用機制研究等方面提供一定的指導作用，目前仍缺少監(jiān)測 HCMV增殖復制的可靠、新型、客觀、準確和穩(wěn)定的方法。該研究運用RTCA技術建立了實時動態(tài)監(jiān)測HCMV病毒滴度的方法，建立了運用該儀器動態(tài)測算病毒滴度的方法，并與空斑形成實驗和間接免疫熒光實驗對比得出了一致的實驗結(jié)果。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞、病毒株 細胞株為人胚肺成纖維細胞（MRC-5），購自ATCC。HCMV AD169株為實驗室標準毒株，由復旦大學上海醫(yī)學院微生物學教研室提供，安徽醫(yī)科大學微生物教研室保存，實驗用毒株的滴度為1.0×105PFU/ml。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基、小牛血清（美國Gibco公司）；HCMV pp65抗體（英國Abcam公司）；FITC標記羊抗鼠二抗（上海碧云天生物技術有限公司）；瓊脂糖（美國Promega公司）。

1.1.3儀器 RTCA iCelligence實時細胞功能分析儀（IXL8，美國ACEA公司）；CO2培養(yǎng)箱（HF90，上海力申科學儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（IX53，日本Olypus公司）；Countess自動細胞計數(shù)儀（C10281，美國Invitrogen公司）。

1.2方法

1.2.1RTCA監(jiān)測細胞生長周期 使用RTCA實時無標記細胞功能分析儀監(jiān)測MRC-5細胞生長周期。首先加入100 μl/孔含有10%小牛血清的營養(yǎng)液于8孔電子板內(nèi)獲得背景讀數(shù)。隨后按照300 μl/孔加入MRC-5細胞懸液，細胞終濃度分別為1.0 ×105、0.5×105、0.25×105個/孔。每個稀釋度細胞平行設置復孔。室溫放置 30 min后放入RTCA分析儀內(nèi)實時動態(tài)檢測細胞的黏附伸展及繁殖狀態(tài)，將儀器設置30 min/次，監(jiān)測并記錄細胞指數(shù)值（cell index，CI），于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，連續(xù)觀察200 h。

1.2.2RTCA監(jiān)測HCMV感染MRC-5細胞的致細胞病變效應（cytopathic effect，CPE） MRC-5細胞以5.0×104個/孔的濃度接種于8孔電子板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后棄去營養(yǎng)液，再加入300 μl/孔10倍系列稀釋的HCMV AD169株病毒懸液以1.0×105、1.0 ×104、1.0×103、1.0×102PFU/孔到8孔電子板，感染MRC-5細胞，對照組加入300 μl維持液。37℃，5%CO2條件下孵育1.5 h后棄去病毒懸液，加入300 μl/孔含2%小牛血清的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每個病毒稀釋度做復孔，加入病毒后將8孔電子板放回實時細胞分析儀內(nèi)，設置每隔30 min監(jiān)測并記錄CI值，共200 h。

1.2.3空斑形成實驗檢測病毒懸液滴度 將MRC-5細胞以5.0×104個/孔的量加入24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞生長成單層時，病毒以感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=0.1接種到MRC-5細胞上，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后棄去病毒液，PBS洗3遍，加入含有2%FBS的培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于孵育后0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204 h收集培養(yǎng)液，用維持液將病毒懸液10倍系列稀釋后，再以0.2 ml/孔的量加入到細胞培養(yǎng)板中，同時設立細胞對照組，37℃孵育1.5 h，加入含有1%瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)液0.5 ml，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。其間逐日鏡下觀察細胞生長狀況及其CPE，終止觀察后加入含10%甲醛的結(jié)晶紫染色液，染色5 min后流水沖去瓊脂凝塊。在倒置顯微鏡下觀察空斑并計數(shù)。病毒空斑形成單位（PFU/ml）=蝕斑均數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/病毒接種量。

1.2.4免疫熒光檢測HCMV在MRC-5細胞中復制

將MRC-5細胞以5.0×104個/孔的量加入24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞生長成單層時，病毒以MOI= 0.1接種到MRC-5細胞上，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后棄去病毒液，PBS洗3遍，加入含有2% NBS的培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于孵育后 0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204 h收集培養(yǎng)液，用間接免疫熒光實驗分別檢測不同時間段病毒的滴度，具體操作步驟如下：①將細胞爬片取出后PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定30 min；②加1%Trixon至玻片上，蓋滿玻片為準，37℃、5 min；③PBS洗滌3次，每次3 min，加入 5%小牛血清封閉液，37℃、1 h；④PBS洗滌3次，每次3 min，加入HCMV pp65單抗于玻片上，以蓋滿玻片為準，37℃、2 h；⑤PBS洗滌3次，每次3 min，加入FITC標記羊抗鼠IgG，蓋滿玻片，37℃、1 h；⑥PBS洗滌3次，每次3 min，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察記錄結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，使用了重復測量資料方差分析、線性相關分析等方法處理，數(shù)值變量采用χ2進行統(tǒng)計描述。

2　結(jié)果

2.1MRC-5細胞最適濃度的確定 本實驗使用RTCA技術實時監(jiān)測細胞增殖CI值，并由此確定接種病毒的最佳時間點。統(tǒng)計結(jié)果顯示，當MRC-5細胞以0.5×105個/孔加入孔板內(nèi)時，細胞在生長24 h后形成單層細胞層，無細胞聚集疊加現(xiàn)象，并且細胞平臺期時間滿足觀察HCMV感染細胞CPE時間，與倒置顯微鏡下觀察結(jié)果一致（圖1）。

圖1　RTCA監(jiān)測MRC-5細胞增殖曲線

2.2RTCA監(jiān)測HCMV致MRC-5細胞CPE效應 在MRC-5細胞中，當 MOI=2（即 HCMV滴度為2.0×105PFU/ml），半數(shù)細胞指數(shù)值（half cell index time，CIT50）為77 h，而當MOI=0.2（即 HCMV滴度為2.0×104PFU/ml），細胞CIT50為104 h，水平線與細胞指數(shù)曲線相應交點所對應的時間即為CIT50。當病毒以MOI=0.1接種于MRC-5細胞24 h后，顯微鏡下觀察少數(shù)細胞出現(xiàn)變圓、腫脹現(xiàn)象，折光性增強，在接種達到96 h時，部分細胞出現(xiàn)脫落、凋亡現(xiàn)象。與鏡下觀察比較，RTCA細胞分析系統(tǒng)能夠準確得反映病毒致細胞CPE效應。見圖2。HCMV感染MRC-5細胞后CPE效應隨著時間增加而遞增，并且在不同HCMV感染劑量下，細胞CI值下降隨時間遞增（圖3）。

圖2　HCMV接種MRC-5細胞致CPE效應 ×100

圖3　RTCA監(jiān)測HCMV致MRC-5細胞CPE效應

2.3空斑形成實驗檢測HCMV病毒滴度 結(jié)晶紫染色液染色后，空斑呈無色圓形，散在均勻分布，界限明顯（圖4）?？瞻咝纬蓪嶒灲y(tǒng)計結(jié)果顯示，HCMV接種 MRC-5細胞后在40 h以內(nèi)病毒滴度處于平穩(wěn)期，這個時間包含了病毒的吸附期及隱蔽期，約在50 h時病毒滴度出現(xiàn)陡升，提示病毒在細胞內(nèi)數(shù)量急劇增加，動力學曲線呈線性函數(shù)關系。此時，在顯微鏡下明顯看出CPE。到150 h時病毒增殖速度明顯下降，此時鏡下觀察細胞病變處于“”，部分細胞開始脫落，此時病毒滴度較初始病毒滴度增加約2 000倍（圖5）。

圖4　空斑形成實驗檢測HCMV滴度

圖5　空斑形成實驗檢測HCMV在MRC-5細胞中復制（±s，n=3）

2.4間接免疫熒光驗證HCMV在MRC-5細胞中復制 熒光顯微鏡下觀察，HCMV在細胞中隨著時間的增加，pp65蛋白大量復制表達，感染陽性細胞數(shù)不斷增多（圖6）。將不同方法檢測病毒滴度結(jié)果進行重復測量資料方差分析（表1），間接免疫熒光法和空斑形成實驗相比較，差異無統(tǒng)計學意義（F= 0.745，P=0.437）。

2.5HCMV增殖滴度與CIT50及CI值相關分析 病毒在經(jīng)過10倍系列稀釋梯度下接種細胞后，細胞CIT50值隨病毒滴度遞減而呈遞增趨勢，分別以CIT50值為Y軸，HCMV滴度為X軸繪制曲線，獲得線性圖（圖7）。CIT50值與HCMV感染劑量的log PFU呈反比，R2值為0.957，提示兩者之間有良好的線性回歸關系，通過生成的公式Y(jié)=-26.800X+211.30，由實驗結(jié)果得出的CIT50值可以直接計算出初始病毒的滴度。實驗結(jié)果比較表明，細胞指數(shù)與病毒滴度存在相關性，在病毒接種后36 h內(nèi)，細胞指數(shù)相對穩(wěn)定、貼壁狀況良好；而隨著感染時間的增加，病毒開始大量復制，細胞CPE效應增加，細胞指數(shù)也隨之急劇下降，通過散點圖顯示病毒滴度與細胞指數(shù)是非線性趨勢。因此對細胞指數(shù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換（圖8），轉(zhuǎn)換后的變量結(jié)果為Ln（代表細胞指數(shù)），通過散點圖可以發(fā)現(xiàn)病毒滴度和Ln基本呈線性趨勢，對兩個變量進行正態(tài)性檢驗，結(jié)果表明兩個變量都是正態(tài)分布。滿足線性相關條件。病毒滴度和Ln的相關系數(shù)，二者呈負相關性（r=-0.977，P＜0.05）。以病毒滴度為因變量，Ln為自變量進行線性回歸分析，結(jié)果顯示自變量對變量的影響差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖6　HCMV在MRC-5中不同時間段熒光顯微鏡觀察結(jié)果 ×200

表1　兩種方法檢測HCMV病毒滴度結(jié)果比較（×103，±s）

表1　兩種方法檢測HCMV病毒滴度結(jié)果比較（×103，±s）

方法24 h　48 h　72 h　96 h免疫熒光（GFU/ml）3.16±0.13　3.97±0.32　9.86±0.21　25.2±1.0空斑形成（PFU/ml）3.08±0.16　4.04±0.29　9.74±0.19　23.2±3.3

圖7　MRC-5細胞感染HCMV的滴度與CIT50線性關系

圖8　病毒感染過程中病毒滴度與細胞指數(shù)的相關分析

3　討論

目前對于HCMV增殖復制與宿主間復雜的相互作用缺乏深入了解。研究病毒的最常用方法仍是空斑形成實驗，但此法費時費力，不宜快速檢測，且無法獲取病毒復制及其引起的細胞病變的完整信息。各實驗室條件和體系不同，數(shù)據(jù)無法參比，為基礎研究帶來了困難。另外，此外某些病毒如減毒突變株可能會在細胞內(nèi)復制成功，但由于其作用微弱，在單層細胞上產(chǎn)生的空斑難以識別，因此空斑試驗無法研究此類病毒的CPE。

本研究采用RTCA實時監(jiān)測HCMV在MRC-5細胞中的增殖狀況。在進行MRC-5細胞測試HCMV的CPE檢測之前，先使用RTCA對細胞生長繁殖進行定量分析，以確定病毒感染性實驗的最佳細胞濃度。判斷依據(jù)為正常細胞增殖處于對數(shù)生長期，并且平臺期維持在6 d以上，確保感染病毒后細胞能被持續(xù)觀察。本次實驗結(jié)果得出，當細胞濃度為5.0×104個/孔時，最適合病毒的接種，RTCA檢測細胞接種HCMV后的CI值與空斑形成實驗結(jié)果比較，病毒的滴度與CI值呈明顯負相關性，提示通過RTCA檢測細胞CI值可實時反映病毒的滴度。

RTCA與傳統(tǒng)的檢測方法相比有明顯優(yōu)勢，操作簡單、步驟少、人為干擾??；完整細胞效應圖譜，提供大量、重要的動態(tài)反應信息；實驗結(jié)果客觀、重復性好；降低了操作人員與病毒接觸的次數(shù)（實驗全過程僅需一次），安全系數(shù)高，尤其對高致病性病原體；全自動實時監(jiān)控，全過程動態(tài)觀察；可以高通量的進行特異性抗體的檢測及疫苗的保護性效果評價。RTCA的應用領域非常廣泛，涉及新藥研發(fā)、毒理學、腫瘤學、醫(yī)學微生物學及病毒學等。Lu et al［5］運用RTCA技術評估了H1N1疫苗接種是否成功，Solly et al［6］運用RTCA做一些以細胞為基礎的實驗，為新藥的研發(fā)奠定基礎。

本文運用RTCA細胞分析系統(tǒng)實現(xiàn)了對細胞實時全程動態(tài)監(jiān)測，在臨床疾病指導治療等方面的應用也具有很高的價值，為今后抗病毒藥物的研制及疫苗的研發(fā)提供可靠有力的實驗基本技術。

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［5］Lu H Z，Xu X.Label-free real-time cell based assay system for evaluating H1N1 vaccination success［J］.Asia Pac Biotech News，2010，14（10）：15-7.

［6］Solly K，Wang X，Xu X，et al.Application of real-time cell electronic sensing（RT-CEs）technology to cell-based assays［J］.Assay Drug Dev Technol，2004，2（4）：363-72.

Monitoring of HCMV replication with real-time cell assay on MRC-5

Zhang Yeting，Zhong Feng，Yao Yao，et al
（Dept of Microbiololgy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To detect the human cytomegalovirus（HCMV）replication in MRC-5 cells by applying realtime cell assay（RTCA）system，and evaluate the applicable value of this method in the dynamic monitoring of viral replication.Methods RTCA was applicated to monitor cell index（CI）in different growth stages.The optimal concentration of cell was selected to study HCMV replication.Additionally，traditional plaque formation assay and immunofluorescence assay were used to compare and validate the result of RTCA system.Results The most suitable cell concentration was 0.5×105cells per plate.Compared with the plaque formation assay and immunofluorescence assay，the value of half cell index（CIT50）had a satisfactory linear correlation with the initial virus titer.The RTCA system showed a significant negative correlation with time continuation for the detection of cell index and the virus titer（r=-0.977，P＜0.05）.Conclusion RTCA technique is successfully established to monitor the growth status of the cells in real time，which might reflect the cell's adhesion and spreading.The RTCA system could timely monitor HCMV titer with cell index.All the data are solid and reliable.The method would be helpful for future basic experiments on creating new experimental techniques and methods.

real-time cell assay；human cytomegalovirus；proliferation

R 373.9

A

1000-1492（2016）07-0935-05

2016-02-22接收

國家自然科學基金（編號：30872253）；安徽高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2012ZD08）

安徽醫(yī)科大學微生物學教研室，合肥 230032

張業(yè)婷，女，碩士研究生；王明麗，女，教授，碩士導師，責任作者，E-mail：1952987441 @qq.com