張永杰,董菲菲,鄧志偉,張婷婷,楊生玉,*

(河南大學生命科學學院,生物工程研究所,河南開封 475004)

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一株產(chǎn)聚羥基丁酸(PHB)菌株的篩選及鑒定

張永杰1,董菲菲2,鄧志偉2,張婷婷2,楊生玉1,*

(河南大學生命科學學院,生物工程研究所,河南開封 475004)

以甘油作為碳源,采用尼羅藍熒光法結(jié)合蘇丹黑B染色法從污水中篩選到一株產(chǎn)聚羥基丁酸(PHB)的菌株,基于生理生化特性鑒定及16S rDNA基因序列分析,確定該菌屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)pudita,將其命名為PP25。采用次氯酸鈉-氯仿法提取聚羥基丁酸,最終通過紫外可見分光光度法、紫外光譜法、傅里葉紅外光譜法及核磁共振法確定了一株高產(chǎn)PHB菌株P(guān)P25,PHB產(chǎn)量為2.456 g/L。

聚羥基丁酸,假單胞菌,鑒定

聚羥基丁酸(PHB)是一種胞內(nèi)存儲的生物可降解材料,其是大量微生物在碳、氮營養(yǎng)失衡的條件下,作為碳源和能源而儲存于細胞內(nèi)的物質(zhì),其物理、化學性質(zhì)和傳統(tǒng)的塑料聚丙烯相似[1]。PHB可以在自然界中被微生物完全的分解利用,且其具有良好的生物相容性,是一種很有應(yīng)用前景和開發(fā)價值的新型環(huán)保材料[2-4]。因此對PHB的研究成為生物技術(shù)以及新型材料領(lǐng)域的一個熱點。

尼羅藍是一種熒光染料,能特異性地對聚羥基丁酸進行熒光染色[5],起初尼羅藍僅僅作為PHB熒光檢測時的染液使用,且尼羅藍很容易以懸液的形式滲入細胞內(nèi)部與PHB結(jié)合,因此在菌體細胞生長的同時就能依據(jù)熒光現(xiàn)象,方便快捷的挑選出PHB產(chǎn)生菌[6]。目前報道能積累聚羥基丁酸的菌株有真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligeneseutropbus)、圓褐固氮菌和巨大芽孢桿菌等300多種,其中研究最廣泛的是真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌[7]。國內(nèi)也有學者利用葡萄糖、蔗糖、糖蜜作為主要碳源篩選出能夠產(chǎn)PHB的性能優(yōu)良的菌株,但目前利用甘油作為碳源篩選產(chǎn)PHB菌株的研究在國內(nèi)尚屬空白。因此,本文研究以甘油作為碳源篩選出的30株產(chǎn)PHB菌株為基礎(chǔ),以次氯酸鈉-氯仿(v∶v=1∶1)法提取PHB,并通過紫外光譜法、傅里葉紅外光譜法及核磁共振法進行定性和定量分析[8-10]。最終篩選得到一株性能優(yōu)良的菌株P(guān)P25。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株(PseudomonasputidaPP25)由本實驗室從污水中篩選分離獲得;PHB標準品Sigma公司;KBr色譜純,尼羅蘭Solarbio公司;蘇丹黑BAladdin公司;甘油食品級;實驗室所用試劑均為分析純。

UV-1750型紫外-可見光分光光度計日本Shimadzu公司;752N型紫外可見分光光度計上海儀電分析儀器有限公司;傅立葉變換紅外光譜儀Spectrum Two,美國PerkinElmer公司;核磁共振波譜儀AVANCE Ⅲ HD 400 MHz,瑞士Bruker Biospin公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基(g/L):甘油10.0,酵母浸粉10.0,KH2PO410.0 pH自然。篩選培養(yǎng)基(g/L):甘油20.0,(NH4)2SO45.0,K2HPO45.0,MgSO4·7H2O 1.2,檸檬酸2,瓊脂20,尼龍?zhí)m0.03,pH7.0。斜面保藏培養(yǎng)基(g/L):甘油 5.0,(NH4)2SO45.0,K2HPO45.0,MgSO4·7H2O 1.2,檸檬酸2,pH6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基:(g/L):甘油20,(NH4)2SO410.0,KH2PO410.0,MgSO4·7H2O 1.2,檸檬酸2,pH7.0。上述培養(yǎng)基均在115 ℃條件下滅菌20 min。每個實驗設(shè)計4個平行,取平均值并計算誤差。

1.2.2菌株的分離與篩選從河南省達利園食品有限公司污水、河南慶安化工(集團)有限公司污水、河南大學實驗田土壤取樣,取3 g樣品加入27 mL富集培養(yǎng)基中(30 ℃,200 r/min)有氧培養(yǎng)24 h。取富集培養(yǎng)液,用生理鹽水稀釋成一系列濃度梯度。取10-4、10-5、10-6三個梯度0.1 mL稀釋液涂布在平板篩選培養(yǎng)基上(每個梯度做4個平行),置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將平板放在熒光透射儀下照射挑取熒光較強且菌落較大的菌落,蘇丹黑B染色鏡檢觀察PHB的黑色顆粒,獲得能夠產(chǎn)聚羥基丁酸(PHB)的單菌落。選取發(fā)出熒光較多的平板,從其上提取菌落較大且熒光較強的接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,200 r/min,30 ℃有氧培養(yǎng)72 h,離心獲取沉淀檢測PHB得含量及菌體干重。斜面保藏PHB產(chǎn)量最高的菌株,進行下一步實驗。

1.2.3分析方法

1.2.3.1菌體干重測定取發(fā)酵液10 mL,8000 r/min離心10 min,水洗3次,真空冷凍干燥稱重,得細胞干重。

1.2.3.2PHB含量測定采用Law[11]方法進行定量分析。PHB濃硫酸100 ℃加熱條件下會降解為巴豆酸(丁烯酸),巴豆酸在235 nm紫外光譜區(qū)有吸收峰,通過紫外可見分光光度儀測定其吸光值,根據(jù) PHB標準曲線計算PHB含量。

1.3胞內(nèi)PHB顆粒分析

1.3.1PHB的提取與純化

1.3.1.1PHB的提取從-80 ℃超低溫冰箱中取一支甘油管保藏菌接種到30 mL活化培養(yǎng)基中,培養(yǎng)20 h。以6%接種量,接種于種子培養(yǎng)基(50 mL裝液量)中,培養(yǎng)8 h。接種于5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)(裝液量2 L,接種量5%)中,培養(yǎng)60 h。將發(fā)酵液以8000 r/min離心15 min,蒸餾水洗滌、離心,然后冷凍干燥備用。取5 g干菌粉與100 mL體積比為1∶1的氯仿-次氯酸鈉混合液中,在30 ℃下攪拌2 h?；旌弦航?jīng)離心(10000 r/min,10 min)后分為3層,上層是次氯酸鈉溶液,中間層是非PHB的細胞物質(zhì)及未被破胞的細胞,下層為含有PHB的氯仿溶液。用吸管吸取氯仿相,將其加入到正在攪拌的50 mL冷甲醇(4 ℃)中,并在4 ℃冰箱中放置1 h,過濾后將固體物于60 ℃烘24 h備用。

1.3.1.2PHB的純化將粗提取的PHB固體包于脫脂的濾紙內(nèi),放入索氏提取器的提取管內(nèi)。提取瓶內(nèi)加入50 mL氯仿,加熱提取瓶,氯仿氣化,由連接管上升進入冷凝器,凝成液體滴入提取管內(nèi),浸提樣品中的PHB粗品。待提取管內(nèi)氯仿液面達到一定高度,溶有PHB的氯仿經(jīng)虹吸管流入提取瓶。流入提取瓶內(nèi)的氯仿繼續(xù)被加熱氣化、上升、冷凝,滴入提取管內(nèi),如此循環(huán)往復,純化2 h,通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將得到PHB氯仿溶液濃縮為20 mL左右,按照1.3.1.1中的方法處理得到純化后的PHB樣品。

1.3.2紫外吸收光譜分析取3 μg/mL的PHB標準品氯仿溶液、5 μg/mL的PHB樣品氯仿溶液及氯仿溶液(空白對照)1 mL于25 mL的比色管中100 ℃水浴50 min,將氯仿充分蒸出,各加入10 mL濃硫酸100 ℃水浴10 min(3個平行),冷卻至室溫。在波長200～300 nm處測定吸光值。

1.3.3傅里葉變換紅外光譜分析取PHB標準品、PHB樣品與KBr按照1∶200比例混勻壓片,于4000～450 cm-1進行紅外光譜掃描檢測。

1.3.4核磁共振分析取5 mg PHB標準品及PHB樣品于核磁管中,再加入0.5 mL氘代氯仿,加熱溶解為澄清溶液,于400 MHz核磁共振波譜檢測。

1.4菌種鑒定

1.4.1生理生化特征鑒定根據(jù)《伯杰氏手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》,選取淀粉水解、吲哚生成、檸檬酸鹽利用、苯丙氨酸脫氨酶、H2S生成,明膠水解、MR實驗、接觸酶等特征性生理生化項目進行鑒定[12-15]。

1.4.216S rDNA基因序列分析取平板上的菌體于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中變性后離心取上清作為模板。反應(yīng)條件:80 ℃,15 min;使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176),進行PCR擴增目的片段;反應(yīng)體系:上述變性液1 μL、PCR Premix 25 μL、Forward primer(20 pmol/μL)0.5 μL、Reverse primer2(20 pmol/μL)、16S-free H2O 23 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火 1 min,72 ℃延伸1.5 min,72 ℃ 5 min,30個循環(huán);使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)切膠回收目的片段;委托寶生物工程(大連)有限公司進行DNA測序;在NCBI網(wǎng)站上用BLAST檢索GenBank中相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列,用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進化樹分析,確定該菌的分類地位。

2　結(jié)果與討論

2.1菌種篩選

2.1.1產(chǎn)PHB菌株的篩選與分離根據(jù)1.2.2方法采集處理樣品,分離純化菌株,按照1.2.3方法檢測菌體干重及菌體中PHB的含量。經(jīng)過初篩,共獲得25株能夠產(chǎn)生PHB的菌株,采用搖瓶發(fā)酵法對初篩得到的25株菌株進行復篩,并檢測菌體干重及菌體中的PHB含量。其中從化工廠污水中分離到的1株菌2-5,菌體干重及PHB含量最高,分別達到4.367,2.456 g/L,將其命名為PP25。

圖1　尼羅藍平板菌落形態(tài)Fig.1　Nile blue plate colony morphology

圖2　蘇丹黑B染色結(jié)果Fig.2　Sudan black B dyeing results

2.2胞內(nèi)PHB顆粒鑒定結(jié)果

2.2.1PHB的紫外光譜法分析結(jié)果紫外吸收光譜分析:在波長200～300 nm范圍內(nèi)測定光吸收度。由圖3可知,采用次氯酸鈉-氯仿法提取的PHB樣品在235 nm處有強吸收峰,與標準品的峰十分接近,且純度較高。

圖3　PHB樣品和標準品的紫外吸收光譜分析結(jié)果Fig.3　UV absorption spectra of PHB sample and reference substance

2.2.2傅立葉紅外光譜分析為了確定從PP25菌株中提取得到的物質(zhì)是否為聚羥基丁酸(PHB),對提取的樣品進行傅立葉紅外光譜分析,鑒定其特征性官能團,結(jié)果如圖4所示:提取樣品在1057、1101、1229、1279、1380、1456、1723、2875 cm-1處均有較大吸收峰。與PHB標準品的紅外光譜(圖4)進行對比,其主要官能團一致。其中,1057、1101 cm-1是C-OH伸縮振動引起的吸收峰,1229 cm-1是-CH2的搖擺振動引起的吸收峰,1279 cm-1對應(yīng)于C-O-C的伸縮振動吸收峰,1456 cm-1是-CH2剪式振動吸收峰,1723 cm-1是C=O的伸縮振動吸收峰,2875 cm-1對應(yīng)于-CH3的反對稱伸縮振動吸收峰。由提取樣品與標準品紅外光譜圖對比(圖4)可知,提取物質(zhì)即為聚羥基丁酸且純度較高。

圖4　PHB標準品和提取樣品的紅外光譜分析結(jié)果Fig.4　Infrared spectra of PHB reference substance and PHB sample

2.2.3核磁共振分析結(jié)果分別對PHB標準品和篩選菌株發(fā)酵后提取得到樣品進行核磁共振(氫譜)檢測,結(jié)果如圖5所示。

圖5　PHB標準品和提取樣品的核磁共振氫譜分析結(jié)果Fig.5　Nuclear magnetic resonance of PHB reference substance and PHB sample

由圖5可知,提取PHB樣品與PHB標準品的氫譜中的氫元素數(shù)目及元素遷移情況相一致,并且圖譜整齊無雜質(zhì)峰出現(xiàn),表明從惡臭假單胞菌PP25提取所得的物質(zhì)為PHB且純度高。

2.3PHB產(chǎn)生菌的鑒定

2.3.1生理生化鑒定根據(jù)革蘭氏染色、芽孢染色、氧化酶、明膠液化、產(chǎn)吲哚、淀粉水解、MR、產(chǎn)H2S、苯丙氨酸脫氨酶等屬間特征生理生化反應(yīng)結(jié)果及16S rDNA鑒定結(jié)果鑒定該菌株屬于Pseudomonas屬,根據(jù)反硝化、檸檬酸鹽利用、酯酶、精氨酸雙水解等種間生理生化特性鑒定該菌株為Pseadomonasputida。生理生化特征鑒定結(jié)果見表1。

表1　菌株P(guān)P25生理生化鑒定指標Table 1　Physiological and biochemical characteristicsof strain PP25

注:+：90%或以上的菌株為陽性;-：90%或以上的菌株為陰性。

2.3.2基因序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育分析經(jīng)測序,獲得16S rDNA 1481 bp長度全序列。將該序列與GenBank中相關(guān)數(shù)據(jù)進行相似性分析,并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進化樹(見圖6)。通過16S rDNA序列分析和構(gòu)建進化樹分析得到PP25與Pseudomonassp、Pseudomonasputida親緣關(guān)系較近。

圖6　基于菌株P(guān)P-25和參比菌株的 16S rDNA基因同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6　Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences similarity of strain PP25 and reference

經(jīng)鑒定確定該菌屬于假單胞菌科、假單胞菌屬(Pseudomonas)putida,擬將該菌株命名為PP25。

3　討論與結(jié)論

本文以甘油作為碳源采用尼羅藍平板法、蘇丹黑B染色法同紫外吸收光譜(UV)、傅里葉變換紅外光譜(IR)、及核磁共振(NMR)相結(jié)合的方法進行PHB產(chǎn)生菌的篩選。通過尼羅藍平板、蘇丹黑同 UV、IR、NMR相結(jié)合篩選得到的菌株更加準確。同時通過16S rDNA及生理生化鑒定所篩選的菌株為假單胞菌屬(Pseudomonas)pudita。采用氯仿萃取法提取PHB,并對提取得到的PHB固體進行紫外吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜、及核磁共振分析,并與標準品比較。紫外光譜中無雜質(zhì)峰且與PHB標準品的吸收峰一致,初步確定該提取物為PHB類似物;進一步通過對PHB標準品及樣品的傅里葉變換紅外光譜及核磁共振氫譜分析得出,從惡臭假單胞菌內(nèi)提取的物質(zhì)為聚羥基丁酸,從而表明所篩選的惡臭假單胞菌為目標菌株。

同時,利用野生型的惡臭假單胞菌培養(yǎng)生產(chǎn)PHB與實際應(yīng)用及工業(yè)化生產(chǎn)還存在較大的差距,但與其他野生菌株相比具有一定優(yōu)勢,其可以利用工業(yè)甘油作為碳源合成PHB可以有效地降低生產(chǎn)成本。同時可以采用誘變技術(shù)選育優(yōu)良菌株,或利用基因工程、酶工程定向改造菌株,從而大幅度提高PHB產(chǎn)量,進一步降低生產(chǎn)成本。

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Screening and identification of a strain producing polyhydroxybutyrate

ZHANG Yong-jie1,DONG Fei-fei2,DENG Zhi-wei2,ZHANG Ting-ting2,YANG Sheng-yu1,*

(Institute of Bioengineering,School of Life Sciences,Henan University,Kaifeng 475004,China)

A polyhydroxybutyrate(PHB)strain was isolated from sewage by Nile blue fluorescence staining combining with Sudan black B,which was based on glycerol as the carbon source. A series of analyses on physiological and biochemical characterization and sequence analysis of 16S rRNA revealed that it belonged to the genusPseudomonaspudita,which namedPseudomonaspuditaPP25. PHB was extracted with sodium hypochlorite- chloroform. Finally,a high yield PHB strain named PP25 was determined by UV spectroscopy,Fourier transform infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance spectroscopy,yield of PHB was 2.456 g/L.

polyhydroxybutyrate;Pseudomonas;identification

2016-01-06

張永杰(1989-),男,在讀碩士研究生,研究方向:發(fā)酵工程,E-mail:1292365735@qq.com。

楊生玉(1962-),男,本科,教授,研究方向:工業(yè)微生物育種和發(fā)酵工程,E-mail:yangshengyu@henu.edu.cn。

河南省科技攻關(guān)重點項目(152102210254)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)14-0223-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.037