支梓鑒,俞邱豪,程　煥,陳健樂(lè),葉興乾,陳士國(guó)

(浙江大學(xué),生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,馥莉食品研究院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058)

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腸道微生物體外發(fā)酵模型研究進(jìn)展及其在食品中的應(yīng)用

支梓鑒,俞邱豪,程煥,陳健樂(lè),葉興乾,陳士國(guó)*

(浙江大學(xué),生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,馥莉食品研究院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058)

隨著分子微生態(tài)學(xué),特別是高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,人們對(duì)腸道微生物的作用有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。腸道不僅是消化吸收的場(chǎng)所,其微生物菌群現(xiàn)更被認(rèn)為是一個(gè)高度特異化的“器官”,其代謝活力直接影響人體的健康。但直接對(duì)人體或動(dòng)物模型腸道內(nèi)容物取樣進(jìn)行研究,操作復(fù)雜且有悖道德倫理,因此近來(lái)體外腸道發(fā)酵模型成為研究熱點(diǎn),為此類研究提供了一個(gè)新的可行性途徑。本文綜述了體外發(fā)酵模型的研究進(jìn)展及其在食品功能研究中的部分應(yīng)用,并結(jié)合相關(guān)高通量檢測(cè)技術(shù)發(fā)展提出展望,以期為腸道微生物或食品代謝等相關(guān)研究提供一定的參考依據(jù)。

腸道微生物,體外發(fā)酵模型,高通量測(cè)序

人體腸道菌群是高度復(fù)雜多樣性的微生物菌落,其數(shù)量眾多、種類豐富,廣泛參與人體多種生理活動(dòng),對(duì)人體健康起著至關(guān)重要的作用[1-4]。正常成年人腸道微生物主要包括厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、梭桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)[5],其中,擬桿菌門(mén)和梭桿菌門(mén)參與分解代謝產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸鹽,抑制炎癥和結(jié)腸癌;雙歧桿菌、乳酸桿菌可合成部分維生素,促進(jìn)腸道蠕動(dòng),抑制致病菌生長(zhǎng);真桿菌和一些梭菌代謝產(chǎn)生次級(jí)膽酸,提高膽固醇含量,具有誘變和致癌作用[6]。同時(shí),近些年研究表明,人體腸道不僅負(fù)責(zé)食物加工,而且其微生物菌群與心情、免疫、肥胖、糖尿病、大腸癌、心腦血管疾病等有著密切關(guān)系[3-4,7]。

目前,腸道微生物生物組成和多樣性評(píng)價(jià)主要集中于利用宏基因組學(xué)等方法檢測(cè)糞便樣品,但這僅代表了遠(yuǎn)端大腸的菌群特征。然而這些研究并未提供深入探討動(dòng)態(tài)微生物進(jìn)程和腸道特定位置功能或消化性能的信息。體外發(fā)酵模型從簡(jiǎn)單的厭氧環(huán)境中糞便微生物的批量發(fā)酵到復(fù)雜的一級(jí)或多級(jí)連續(xù)發(fā)酵模型,為其逐步演變?yōu)榭茖W(xué)研究提供了更多可能。體外發(fā)酵模型是研究大量底物篩選的有效工具,其中包括膳食組分、藥物和有毒或放射性組分,同時(shí)也可對(duì)腸道微生物環(huán)境的變化進(jìn)行測(cè)定。模型的主要目的是在可控條件下培育復(fù)雜腸道微生物菌群,用于微生物調(diào)控和代謝的相關(guān)研究。目前,有關(guān)體外發(fā)酵模型和腸道微生物的相關(guān)研究已成為食品領(lǐng)域的新熱點(diǎn),但還比較薄弱,需要進(jìn)一步深入研究。本文就國(guó)內(nèi)外目前經(jīng)典的體外腸道模型及其發(fā)展和應(yīng)用進(jìn)行綜述,旨在加快該領(lǐng)域的發(fā)展。

表1　體外發(fā)酵模型特定及其局限性Table 1　The characteristics and limitations of in vitro fermentation models

1　體外發(fā)酵模型

從單一發(fā)酵罐到多相連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng),體外發(fā)酵模型的設(shè)計(jì)和復(fù)雜性隨著接種技術(shù)的發(fā)展而不斷升級(jí)[8-11]。模型均需特定的時(shí)間使完整的微生物菌群處于穩(wěn)定狀態(tài),因此需根據(jù)研究目標(biāo)進(jìn)行不同的選擇,其中,模型種類、特點(diǎn)及其局限性如表1所示。

1.1批式發(fā)酵模型

批式發(fā)酵是單一或混合細(xì)菌懸浮液在特定選擇培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵,期間不再添加新的營(yíng)養(yǎng)物,且模型一般為密封瓶子或反應(yīng)器,保證其厭氧環(huán)境。此模型具有簡(jiǎn)單、易操作和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。然而,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,微生物發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致短鏈脂肪酸產(chǎn)生并積累,從而造成發(fā)酵系統(tǒng)中pH的改變,影響發(fā)酵正常進(jìn)行。系統(tǒng)中微生物的生長(zhǎng)主要依靠接種濃度和底物消耗速率控制。低細(xì)胞濃度接種的系統(tǒng)呈現(xiàn)出典型的S-型生長(zhǎng)曲線,發(fā)酵前期存在豐富營(yíng)養(yǎng)物,隨后營(yíng)養(yǎng)物被消耗,同時(shí)產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物積累,生長(zhǎng)受到抑制。微生物菌群的評(píng)價(jià)和微生物代謝調(diào)控等復(fù)雜性實(shí)驗(yàn)需要連續(xù)性的底物補(bǔ)給,否則,發(fā)酵時(shí)間會(huì)大大縮短，從而抑制體外穩(wěn)定條件的形成。因此,此模型僅適用于短期發(fā)酵的相關(guān)研究,以及底物對(duì)腸道微生物生理和生物多樣性的影響。如抗性淀粉和果聚糖等碳水化合物是否具有益生元潛力[12-13],以及食物組分被腸道微生物作用時(shí)短鏈脂肪酸短期代謝情況研究[14]。

1.2連續(xù)發(fā)酵模型

連續(xù)發(fā)酵模型克服了批式發(fā)酵模型的一些弱點(diǎn),通過(guò)連續(xù)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)底物,同時(shí)轉(zhuǎn)移有毒代謝產(chǎn)物,達(dá)到延長(zhǎng)微生物發(fā)酵時(shí)間的目的。連續(xù)發(fā)酵模型分為單相和多相連續(xù)發(fā)酵模型,其中,單相發(fā)酵模型能夠較好模擬盲腸和升結(jié)腸的消化情況,因此常被用于闡明近端結(jié)腸功能和代謝活力[9]。

然而,人體腸道環(huán)境是一個(gè)多相環(huán)境,分為升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸三個(gè)區(qū)域,每個(gè)區(qū)域在代謝活力和微生物組成上均存在差異。因此,多相連續(xù)發(fā)酵模型設(shè)置不同反應(yīng)器模擬腸道不同階段,能更準(zhǔn)確模擬腸道生態(tài)環(huán)境。Macfarlane等[15]開(kāi)發(fā)出三相發(fā)酵模型,如圖1所示,圖中Vessel 1、Vessel 2和Vessel 3三個(gè)恒化器串聯(lián)模擬近端、橫向、遠(yuǎn)端結(jié)腸區(qū)域,其體積分別為0.22、0.32和0.32 L,pH分別為5.5、6.6和6.8,系統(tǒng)溫度維持在37 ℃,且充入CO2保持厭氧環(huán)境。整體系統(tǒng)參數(shù)按照人體生理情況進(jìn)行設(shè)定,實(shí)現(xiàn)發(fā)酵在空間、時(shí)間、營(yíng)養(yǎng)和理化特性上的準(zhǔn)確性和合理性。此外,微生物接種液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵模型過(guò)程中的適應(yīng)、生長(zhǎng)和增殖均要依靠環(huán)境參數(shù),如pH、保留時(shí)間、溫度、厭氧環(huán)境和介質(zhì)流速,因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格控制參數(shù)是構(gòu)建微生物組成和代謝活力穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。

圖1　三相發(fā)酵模型示意圖Fig.1　Schematic diagram of the three-stage fermentation model

圖2　五相發(fā)酵模型示意圖Fig.2　Schematic diagram of the five-stage fermentation model

1993年,Molly等[16]開(kāi)發(fā)SHIME(The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem)模型。它是一個(gè)五相發(fā)酵模型,包含五部分組件,分別模擬了食物經(jīng)過(guò)上消化道(胃部、小腸)和下消化道(升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸)整個(gè)過(guò)程。整個(gè)SHIME反應(yīng)器應(yīng)在37 ℃進(jìn)行工作,反應(yīng)器均為雙層夾套的玻璃容器,且通過(guò)磁力攪拌進(jìn)行混合溶液。研究人員需每天添加3次營(yíng)養(yǎng)液至胃室,胰液和膽汁至小腸室。在胃和小腸室內(nèi)消化的基礎(chǔ)上,懸浮液在泵作用下抽入升結(jié)腸容器進(jìn)行結(jié)腸消化。消化液在反應(yīng)器中的保留時(shí)間可根據(jù)研究目的通過(guò)改變流速進(jìn)行調(diào)整,胃室、小腸室、升結(jié)腸室、橫結(jié)腸室、降結(jié)腸室反應(yīng)體積分別為0.2、0.3、0.7、1.3、0.8 L,保留時(shí)間分別為2、6、18、36、22 h,pH分別為2、6.8、5.6～5.9、6.1～6.4和6.6～6.9。同時(shí),整個(gè)模型通過(guò)頂端空間充入氮?dú)饣騈2/CO2(9∶1)來(lái)維持厭氧環(huán)境。

粘膜微生物是腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,它與腔內(nèi)微生物在菌群組成上存在本質(zhì)區(qū)別,且定居于腸道上皮細(xì)胞的粘液,因此,粘膜微生物對(duì)調(diào)節(jié)腸道健康有更高效能[17]。Abbeele等發(fā)現(xiàn)柔嫩梭菌(aecalibacterium prausnitzii)的存在能夠抑制克羅恩病的發(fā)生[17]和術(shù)后復(fù)發(fā)[18]。隨后,Abbeele等[19]通過(guò)黏蛋白覆蓋微生物群來(lái)模擬粘膜微生物群落,梭狀芽孢桿菌IV和XIVa產(chǎn)生大量丁酸并轉(zhuǎn)運(yùn)至結(jié)腸細(xì)胞,加強(qiáng)細(xì)胞間連,提高腸道屏障功能。同時(shí),研究表明,M-SHIME模型能夠維持個(gè)體微生物群落中粘膜微生物組成特有屬性。

此外,為解決發(fā)酵過(guò)程中系統(tǒng)游離細(xì)胞不易控制等問(wèn)題,細(xì)胞固定化技術(shù)與連續(xù)發(fā)酵聯(lián)用以期達(dá)到持久發(fā)酵等目的,其中,應(yīng)用最為廣泛固定化技術(shù)的是多孔糖基質(zhì)固定化。固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)液后,受到底物和產(chǎn)物擴(kuò)散的限制,能夠在糖基質(zhì)上形成高細(xì)胞密度層(1010～5×1011),隨后細(xì)胞釋放在培養(yǎng)液中,并維持高細(xì)胞活力。研究發(fā)現(xiàn)[20],細(xì)胞固定化發(fā)酵過(guò)程中,乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量明顯優(yōu)于傳統(tǒng)游離細(xì)胞發(fā)酵,同時(shí),可防止長(zhǎng)期連續(xù)發(fā)酵時(shí)沖洗現(xiàn)象,減少污染敏感性和噬菌體攻擊,增強(qiáng)質(zhì)粒穩(wěn)定性,防止細(xì)胞受到磁力攪拌剪切力影響。因此,Cinquin等[11]利用固定化的糞便微生物模擬腸道發(fā)酵,固定化復(fù)合糞便微生物模型能快速達(dá)到系統(tǒng)平衡,維持高細(xì)胞密度,并能利用預(yù)固定化基質(zhì)進(jìn)行多參數(shù)實(shí)驗(yàn),同時(shí)可通過(guò)修飾細(xì)菌生理參數(shù)改善腸道模型。

1.3自動(dòng)化發(fā)酵模型

隨著科技的快速發(fā)展,計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)推動(dòng)了發(fā)酵模型的進(jìn)一步發(fā)展。Minekus等[21]開(kāi)發(fā)出一項(xiàng)新型電腦控制的腸道發(fā)酵模型——TIM-2模型，如圖3所示。發(fā)酵裝置主要由四部分相互連接的玻璃腔室(a)組成,每個(gè)腔室內(nèi)部均有一個(gè)彈性薄膜。在玻璃夾套和彈性膜之間泵入37 ℃水維持恒溫環(huán)境,通過(guò)改變泵入水壓造成彈性膜壓縮或舒張來(lái)模擬腸道蠕動(dòng),同時(shí)形成蠕動(dòng)波推動(dòng)食糜內(nèi)容物在環(huán)形體系中移動(dòng)。TIM-2模型系統(tǒng)pH由pH電極(b)在線監(jiān)測(cè),并通過(guò)添加1 mol/L NaOH(c)中和微生物產(chǎn)生的酸性物質(zhì)控制pH恒定在5.8左右。為防止代謝產(chǎn)物累積造成微生物菌群生長(zhǎng)抑制或死亡,系統(tǒng)配備一個(gè)由中空纖維膜構(gòu)成的透析系統(tǒng)(d),它能夠截留50000 u的分子,穩(wěn)定模型中微生物代謝產(chǎn)物的生理濃度,如短鏈脂肪酸生理濃度為80～120 mmol/L,從而維持系統(tǒng)3周的微生物活力。隨著透析液和食物的攝入和增加,系統(tǒng)體積不斷增加,當(dāng)達(dá)到一定體積后,水平檢測(cè)器(e)激活排出閥,維持內(nèi)容物體積在120 mL左右的水平。此外,系統(tǒng)持續(xù)吹入氮?dú)?f)保證厭氧環(huán)境,加之微生物活力,使得系統(tǒng)氧化還原電位穩(wěn)定在300 mV左右。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,可通過(guò)取樣口(g)或回收透析液(d)進(jìn)行取樣。該模型的優(yōu)點(diǎn)是存在蠕動(dòng)和透析系統(tǒng)以維持代謝產(chǎn)物的生理濃度和正常濃度下的高微生物活性,同時(shí),可改變單參數(shù)研究對(duì)微生物代謝活力的影響。但TIM-2模型僅動(dòng)態(tài)模擬了大腸發(fā)酵的環(huán)境,為了達(dá)到更好的模擬效果,該模型可與TIM-1模型連用,模擬整個(gè)人體消化道生理環(huán)境。

圖3　TIM-2示意圖Fig.3 Schematic diagram of TIM-2 注:(a)蠕動(dòng)室；(b)pH電極；(c)堿液泵；(d)含有中空纖維膜的透析液回路；(e)水平檢測(cè)器；(f)N2入口；(g)取樣口；(h)氣體出口；(i)回腸流出液集中室；(j)溫度檢測(cè)器。

SIMGI(SIMulator Gastro-Intestinal)也是一個(gè)體外自動(dòng)化發(fā)酵模型,通過(guò)內(nèi)置編程軟件的操作板控制動(dòng)態(tài)模擬從胃、小腸消化到大腸發(fā)酵、生物代謝轉(zhuǎn)換等完整生理過(guò)程[22]。其中,升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸pH分別為5.6±0.2、6.3±0.2和6.8±0.2,體積分別為250、400和300 mL。發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液包含阿拉伯半乳聚糖(1 g/L)、蘋(píng)果果膠(2 g/L)、木聚糖(1 g/L)、土豆淀粉(3 g/L)、葡萄糖(0.4 g/L)、酵母提取物(3 g/L)、蛋白胨(1 g/L)、黏蛋白(4 g/L)、L-半胱氨酸(0.5 g/L)。該模型的主要優(yōu)點(diǎn)是靈活性的組件和自控化控制參數(shù)模擬生理?xiàng)l件,同時(shí)具有胃和小腸排空功能,但模型需14 d的穩(wěn)定周期后才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。同樣,模型缺少腸道菌群與宿主間的相互作用,可嘗試將上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞共培養(yǎng)模擬腸道生理環(huán)境。

圖4　SIMGI模型示意圖Fig.4　Schematic diagram of the SIMGI

2　體外消化模型在食品中的應(yīng)用

2.1食品組分對(duì)腸道微生物菌群變化的研究

人體腸道菌群種類復(fù)雜、數(shù)量豐富,高達(dá)1013～1014,超過(guò)人體細(xì)胞總數(shù)10倍,所編碼的基因是人類基因組的150倍以上[1-2]。腸道微生物與其代謝產(chǎn)物在人體能量代謝、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、先天和獲得性免疫、胃腸道功能等方面發(fā)揮主要作用[23]。此外,腸道微生物菌群的組成易受年齡、體重、性別、飲食[24]等因素影響,因而不同人群的腸道菌群表現(xiàn)出個(gè)體差異性。Kemperman等[25]利用SHIME模型研究了紅茶和葡萄酒中酚類物質(zhì)對(duì)腸道微生物的影響,研究發(fā)現(xiàn),兩種酚類提取物均可選擇性抑制腸道致病菌,且能夠使厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)比例發(fā)生變化。紅茶酚類提取物刺激克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸球菌(Enterococci)和Akkermansia生長(zhǎng),抑制雙歧桿菌(Bifidobacteria)、B.coccoides、Anaeroglobus、食物谷菌屬的生長(zhǎng);葡萄酒中酚類物質(zhì)能夠促進(jìn)克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、Alistipes、Cloacibacillus和Victivallis的生長(zhǎng),減少雙歧桿菌(Bifidobacteria)、B.coccoides、Anaeroglobus、Subdoligranulum和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)的數(shù)量。但Parker等[26]則認(rèn)為對(duì)腸道微生物起調(diào)節(jié)作用的是酚類物質(zhì)的代謝物,而非多酚本身。Abbeele等[27]利用SHIME模型和TIM-2模型研究長(zhǎng)鏈阿拉伯木聚糖和菊粉的發(fā)酵方式的區(qū)別,實(shí)驗(yàn)證明,長(zhǎng)鏈阿拉伯木聚糖和菊粉能夠分別增加丙酸和丁酸代謝產(chǎn)物的含量,阿拉伯木聚糖促進(jìn)長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)生長(zhǎng),而菊粉選擇性促進(jìn)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)。此外,Kortman等[28]研究了利用體外模型鐵補(bǔ)充劑對(duì)腸道微生物代謝的影響,研究表明,鐵離子的補(bǔ)充會(huì)造成雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)和乳酸菌科(Lactobacillaceae)水平降低,羅斯氏菌屬(Roseburia)和普雷沃菌屬(Prevotella)水平升高,代謝產(chǎn)生的支鏈脂肪酸和氨的含量顯著增加,同時(shí),在富含鐵條件下,其代謝液對(duì)Caco-2細(xì)胞毒性增加。

2.2腸道微生物對(duì)功能因子代謝酵解研究

膳食中的功能多糖和多酚類物質(zhì)等在進(jìn)入腸道后,易受到腸道微生物作用而發(fā)生一定的代謝降解,進(jìn)而發(fā)揮生理功能。Hu等[29]利用體外發(fā)酵模型研究車(chē)前子多糖在大腸酵解中的變化,結(jié)果表明,以乙酸、丙酸和正丁酸為主要組成成分的短鏈脂肪酸總量隨酵解時(shí)間的增加而增加,其中,乙酸和正丁酸的增加主要是由于車(chē)前子多糖中葡萄糖醛酸和木糖的酵解,而丙酸的增加主要是由于多糖中阿拉伯糖和木糖的酵解。同樣,Min等[30]發(fā)現(xiàn)青錢(qián)柳葉多糖在體外模型酵解過(guò)程中短鏈脂肪酸含量增加,多糖被部分酵解,與半乳糖醛酸相連的糖苷鍵更容易被腸道微生物攻擊。Gonthier等[31]利用批量發(fā)酵模型研究綠原酸的降解路徑,綠原酸的酯鍵在腸道微生物作用下發(fā)生水解,并通過(guò)脫羧反應(yīng)、雙鍵還原反應(yīng)或去羥基化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為乙基兒茶素或3-羥基苯甲酸,后經(jīng)β-氧化形成苯甲酸。

3　展望

3.1體外腸道發(fā)酵模型的接種和重現(xiàn)性

盡管存在多種體外發(fā)酵模型的組合設(shè)計(jì),但仍然存在許多挑戰(zhàn)和局限制約著這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。體外模型中腸道微生物的重現(xiàn)性和功能穩(wěn)定性頻受質(zhì)疑,模型穩(wěn)定性主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)微生物組分和代謝活力的影響,而并非腸道微生物對(duì)模擬腸道環(huán)境的適應(yīng)能力。在環(huán)境因素和初始菌種多樣性等條件下,系統(tǒng)在接種和增殖后腸道微生物會(huì)形成新的平衡。近幾年研究發(fā)現(xiàn),利用腸芯片技術(shù)檢測(cè)TIM-2和SHIME模型中微生物分布,細(xì)菌比例會(huì)產(chǎn)生明顯差異[8,32]。嚴(yán)格、可重復(fù)性的糞便收集過(guò)程在發(fā)酵過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用,其能夠保證接種液新鮮度,并決定其在腸道中的增殖速率。模型中菌種還受到連續(xù)取樣等因素影響而發(fā)生不斷變化,也易造成生物重現(xiàn)性差等現(xiàn)象。因此,開(kāi)發(fā)出在線可控腸道微生物模型,嚴(yán)格準(zhǔn)確監(jiān)控模型參數(shù)至關(guān)重要。

3.2功能穩(wěn)定的體外腸道發(fā)酵模型的“組學(xué)”分析

蛋白質(zhì)譜測(cè)序技術(shù)已成功發(fā)掘了腸道菌群發(fā)酵過(guò)程(體內(nèi)及原位)中復(fù)雜的交互作用及其代謝的主要途徑,但是對(duì)體外菌群的發(fā)酵機(jī)制的研究仍不清楚[33-35]。目前,“組學(xué)”技術(shù)在體外發(fā)酵模型中的應(yīng)用僅局限于利用微陣列技術(shù)或SIP技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析[8,32,36]。SIP技術(shù)應(yīng)用于微生物代謝中,用13C標(biāo)記底物追蹤菌群代謝中某一物質(zhì)的路徑[37-38]。宏基因組學(xué)研究技術(shù)在各種實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)特定的人體腸道菌群潛在的基因進(jìn)行分類,表明組學(xué)技術(shù)可用于研究人體腸道菌群[39-40]。盡管宏基因組分析技術(shù)能夠提供菌群潛在的基因,但并不代表具有此類基因的菌群具有相應(yīng)的功能。環(huán)境轉(zhuǎn)錄組學(xué)在環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)方面的研究進(jìn)展提高了識(shí)別基因表達(dá)所引起功能變化的能力[34,41]。然而,由于翻譯后調(diào)控等機(jī)制的存在,環(huán)境轉(zhuǎn)錄組學(xué)所研究出來(lái)的結(jié)果并不能明確的說(shuō)明mRNA豐度與其轉(zhuǎn)錄出的蛋白活性有直接的關(guān)系。從復(fù)雜的生物樣品中提取、分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)等方法上的缺陷仍阻礙著人類腸道菌群功能相關(guān)的蛋白組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展[42]。代謝和細(xì)胞內(nèi)的生化過(guò)程產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物,并被分配給腸道內(nèi)特定菌群供其發(fā)揮功能,這可能由代謝組學(xué)技術(shù)來(lái)闡明此類研究[43-44]。人體腸道微生物作用下的酚類代謝研究就是利用蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)識(shí)別菌群和代謝間交互作用的重要例子。同時(shí),鑒于薈萃分析技術(shù)的研究進(jìn)展,生物信息學(xué)領(lǐng)域面臨的最大挑戰(zhàn)可能在于建立完善的基因數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)明更快、更簡(jiǎn)單的分析方法用以分析來(lái)自于高通量測(cè)序和代謝組學(xué)分析腸道微生物相關(guān)信息所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)。

3.3體外模型的應(yīng)用展望

闡明人類腸道菌群在體外模型中的調(diào)控機(jī)制和代謝概況需要“組學(xué)”為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)。多學(xué)科系統(tǒng)研究法結(jié)合“組學(xué)”技術(shù)將促成新的研究系統(tǒng)去推動(dòng)復(fù)雜微生物和宿主因素對(duì)人類腸道微生物功能性相關(guān)研究。體外腸道發(fā)酵模型無(wú)法有效模擬宿主響應(yīng)是目前面臨的主要技術(shù)難題,但宿主應(yīng)答可通過(guò)體外酵解模型和體外小腸細(xì)胞模型結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn),如Caco-2細(xì)胞[45]。未來(lái)體外發(fā)酵模型系統(tǒng)還應(yīng)涉及“患病者”微生物群的建立和穩(wěn)態(tài),使其便于進(jìn)行炎性腸疾病中腸道微生物功能性的研究,如克羅恩疾病和潰瘍性結(jié)腸炎,且目前這些疾病病理學(xué)研究主要集中在復(fù)雜的免疫系統(tǒng)功能[46]?；隗w外模型的不斷發(fā)展,也可促進(jìn)免疫系統(tǒng)之外疾病的相關(guān)研究,同時(shí)關(guān)于腸道微生物的研究為“人體腸道系統(tǒng)生物學(xué)”方法提供了新的契機(jī)。

4　結(jié)論

體外發(fā)酵模型是一種創(chuàng)新技術(shù)平臺(tái),其最大優(yōu)點(diǎn)能夠表現(xiàn)出優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)性能,同時(shí)不受人類道德約束。但大量體外發(fā)酵模型僅模擬了宿主部分腸功能,且微生物菌群平衡仍然是面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。然而,在實(shí)驗(yàn)中宿主機(jī)能不能被完全忽略,因此可結(jié)合人體腸道細(xì)胞提供宿主應(yīng)答等信息,為體外研究提供更加準(zhǔn)確的結(jié)果。鑒于更準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)體內(nèi)研究結(jié)果,必須結(jié)合體外和體內(nèi)模型進(jìn)行結(jié)果互補(bǔ),這樣不僅能加強(qiáng)體外模型的整體有效性,同時(shí)可區(qū)分腸道微生物與人體間的功能關(guān)系。目前,我國(guó)學(xué)者在體外腸道模擬研究腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能領(lǐng)域的研究相對(duì)較少,歸根到底是模型建立存在一定問(wèn)題,因此,進(jìn)一步完善和開(kāi)發(fā)體外腸道模型,在線精確控制進(jìn)程參數(shù)等工作亟需加強(qiáng)。此外,利用體外模型相關(guān)實(shí)驗(yàn),不能僅停留在表觀微生物改變和代謝產(chǎn)物的變化,梳理酵解過(guò)程中食品成分結(jié)構(gòu)變化及相關(guān)機(jī)理才是未來(lái)發(fā)現(xiàn)的新方向。

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Advances ininvitrofermentation model of gut microbiota and its applications in food

ZHI Zi-jian,YU Qiu-hao,CHENG Huan,CHEN Jian-le,YE Xing-qian,CHEN Shi-guo*

(College of Biosystems Engineering and Food Science,Fuli Institute of Food Science,Zhejiang Key Laboratory for Agro-food Processing,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

With the rapid development of molecular microbial ecology,especially high-throughput sequencing technology,people have a better understanding of gut microbial communities. Intestinal is more than a place of digestion and absorption of food component,and the gut microbiota inside is even regarded as a highly specialized organ whose metabolic activity has a direct impact on human health. However,direct sampling from human or animal model is complex and contrary to ethics. Thus,invitrogut fermentation model presents a novel system for relevant research. This paper summarized the advances ininvitrofermentation models and their applications in functional food research,and proposes the forecast combined with the high-throughput sequencing technology,aiming to provide valuable references for in-depth study on gut microorganism and the metabolism of food.

gut microbiota;invitrogut fermentation model;high-throughput sequencing technology

2016-01-06

支梓鑒(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：zhizijian8866@163.com。

陳士國(guó)(1982-)，男，副教授，研究方向：糖化學(xué)和糖生物學(xué)，E-mail：chenshiguo210@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31301417)；浙江省公益項(xiàng)目(2014C32G2010026)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)14-0353-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.062