王　博，張夢(mèng)珊，張中玉，李珊珊1,,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所,吉林長(zhǎng)春 130112;2.北華大學(xué) 化學(xué)與生物學(xué)院,吉林吉林 132013;3.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130024)

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菊花蜂花粉多糖的分離純化及抗腫瘤活性研究

王博1,2,3，張夢(mèng)珊3，張中玉3，李珊珊1,3,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所,吉林長(zhǎng)春 130112;2.北華大學(xué) 化學(xué)與生物學(xué)院,吉林吉林 132013;3.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130024)

本文對(duì)蜂花粉多糖進(jìn)行了分離純化和組成分析,并初步分析了各多糖級(jí)分對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。選取菊花蜂花粉為原料,通過(guò)水提、醇沉得到總多糖WDPP,再通過(guò)離子交換層析得到一個(gè)中性糖(WDPP-N)和兩個(gè)酸性糖級(jí)分(WDPP-1,WDPP-2)。通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定各級(jí)分的單糖組成,通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響探討各級(jí)分的抗腫瘤活性。結(jié)果表明,WDPP-N主要由半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖組成,比例為30.3∶31.6∶32.7;WDPP-1和WDPP-2都主要由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖組成,還含有少量的鼠李糖、葡萄糖等。WDPP-N和WDPP-2濃度為5 mg/mL時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞HCT116增殖的抑制率分別為38%和32%,對(duì)HT-29增殖的抑制率為42%和47%,WDPP-1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響不顯著(p>0.05),而WDPP在濃度為5 mg/mL時(shí)對(duì)HCT116和HT-29腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率分別為61%和81%。因此,菊花蜂花粉總多糖WDPP抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性優(yōu)于中性糖和酸性糖。

菊花蜂花粉,多糖,分離純化,抗腫瘤活性

蜂花粉是天然的保健食品與藥品原料,作為純天然無(wú)污染的產(chǎn)品,其保健功能越來(lái)越被人們所青睞?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中均有對(duì)花粉的保健治療作用的記載?；ǚ鄣某煞种饕ǖ鞍踪|(zhì)、糖類、脂質(zhì)、維生素、酚類、微量元素、生長(zhǎng)素等[1],這些成分的種類和含量與植物來(lái)源及采收季節(jié)均有關(guān)系。荷花蜂花粉、菊花蜂花粉、五味子蜂花粉等市面上常見(jiàn)蜂花粉所含營(yíng)養(yǎng)成分大致是:蛋白質(zhì)20%～25%,碳水化合物40%～50%,脂肪5%～10%,礦物質(zhì)2%～3%,木質(zhì)素10%～15%,未知物質(zhì)10%～15%[2]。多糖作為蜂花粉中重要的活性成分,具有多種生物學(xué)活性和藥理作用。國(guó)內(nèi)外對(duì)蜂花粉多糖的結(jié)構(gòu)和活性的報(bào)道較少。山楂蜂花粉多糖能夠激活巨噬細(xì)胞的吞噬活動(dòng),增強(qiáng)人體綜合免疫功能[3];梯牧草蜂花粉多糖[4]含有20%的阿拉伯半乳聚糖蛋白,能夠刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng);油菜蜂花粉多糖[5]能夠顯著抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)率,并可提高小鼠免疫力。除此之外,蜂花粉多糖還有抗衰老、美容、防治腦心血管疾病、減肥、調(diào)節(jié)腸胃功能、保肝護(hù)肝、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等多種功效,對(duì)貧血、糖尿病、改善記憶力、更年期障礙等也有較好效果[6]?，F(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)中,對(duì)蜂花粉多糖分離純化的報(bào)道較少,缺乏系統(tǒng)的分析,針對(duì)上述問(wèn)題設(shè)計(jì)了本文的研究?jī)?nèi)容。

本文選取菊花蜂花粉為原料,對(duì)多糖成分進(jìn)行了提取和純化,共得到一種菊花蜂花粉中性糖和兩種酸性糖級(jí)分,對(duì)各級(jí)分的單糖組成和對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響進(jìn)行了分析,探討了不同的多糖級(jí)分在組成和抗腫瘤活性等方面的差異。本文的結(jié)果可以為蜂花粉多糖的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù),也為菊花蜂花粉多糖的下一步研究提供了指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菊花蜂花粉中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所;人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116、人大腸癌細(xì)胞株HT29中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;單糖標(biāo)準(zhǔn)品Sigma-Aldrich公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

恒流蠕動(dòng)泵BT01-100保定蘭格恒流泵有限公司;自動(dòng)部分收集器BS-100A上海滬西分析儀器廠;低速臺(tái)式離心機(jī)2-6KLSigma-Aldrich公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱MCO-15AC日本三洋儀器公司。

高效液相色譜儀及色譜柱:紫外檢測(cè)器SPD-10Avp日本島津儀器有限公司;溶劑輸送泵,LC-10ATvp日本島津儀器有限公司;柱溫箱AT-330天津奧特賽恩斯儀器有限公司;色譜柱Shim-pack VP-ODS日本島津儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菊花蜂花粉總多糖的提取向干燥的菊花蜂花粉(500 g)中加入8 L蒸餾水,浸泡過(guò)夜,100 ℃提取4 h,離心(4500 r/min,10 min)。沉淀加入8 L蒸餾水重復(fù)提取兩次。合并三次提取所得濾液,60～80 ℃水浴濃縮至800 mL,離心(4500 r/min,10 min),棄去沉淀。向上清液加入4倍量無(wú)水乙醇,沉淀過(guò)夜。離心(4500 r/min,10 min),收集沉淀。向沉淀中加入800 mL蒸餾水,充分溶解,加入4倍量無(wú)水乙醇再次醇沉。依次用300 mL 95%乙醇、300 mL無(wú)水乙醇、100 mL乙醚洗滌。將沉淀置于有五氧化二磷的真空干燥器中,真空干燥24 h,得粉末狀菊花蜂花粉總多糖(WDPP,Water-soluble Dendranthema indicum bee Pollen Polysaccharides)。

1.2.2蜂花粉多糖的分離純化DEAE-纖維素分別用酸堿進(jìn)行預(yù)處理后,裝柱,依次用3倍柱體積的蒸餾水、2倍柱體積的2 mol/L NaCl和2倍柱體積的蒸餾水進(jìn)行平衡,平衡流速為15 cm/h。

取10 g菊花蜂花粉多糖WDPP溶于100 mL蒸餾水中,離心后上樣于平衡好的DEAE-纖維素離子交換層析柱(8.0 cm×20 cm,Cl-型),依次用2 L蒸餾水、0.2、0.4 mol/L NaCl水溶液洗脫,流速12.5 mL/min,每燒杯收集50 mL洗脫液,苯酚-硫酸法檢測(cè)洗脫液中總糖含量分布[7],間羥基聯(lián)苯法測(cè)定洗脫液中糖醛酸含量分布[8]。分別收集不同的洗脫峰,除鹽后減壓凍干,分別獲得蒸餾水洗脫組分WDPP-N和0.2 mol/LNaCl溶液洗脫組分WDPP-1、0.4 mol/L NaCl溶液洗脫組分WDPP-2。

1.2.3理化性質(zhì)測(cè)定采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量,間羥基聯(lián)苯法測(cè)定糖醛酸的含量。

單糖組成分析[9]:稱取多糖樣品2 mg,依次用1 mL 1 mol/L鹽酸-甲醇溶液和1 mL 2 mol/L三氟乙酸水解,PMP衍生化后,濾膜過(guò)濾,加入適量蒸餾水稀釋,HPLC檢測(cè)。取單糖標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照,根據(jù)出峰時(shí)間和峰面積判斷待測(cè)樣品單糖組成類型和比例。采用Shimadzu HPLC系統(tǒng)(LC-10ATvp泵和SPD-10AVD紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器),DIKMA Inertsil ODS-3色譜柱(4.6 mm× 150 mm),流動(dòng)相為82.0% 0.1 mol/L PBS和18.0%乙腈(v/v),流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm。

1.2.4MTT法檢測(cè)菊花蜂花粉多糖各級(jí)分對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖活性的影響將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞傳代后,細(xì)胞密度調(diào)為2×105個(gè)/mL。向96孔板中加入50 μL細(xì)胞液,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。去除原培養(yǎng)基,加入多糖溶液,終濃度分別為0.5、2、5 mg/mL。72 h后,加入MTT染色液培養(yǎng)4 h,吸去上清,加入DMSO,避光振蕩10 min。酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm處的光吸收值,計(jì)算細(xì)胞存活率[6]。

對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),計(jì)算均值及SD值,并用SPSS 12.0進(jìn)行分析,當(dāng)p<0.01時(shí),表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異極其顯著,當(dāng)p<0.05時(shí),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著性差異。

2　結(jié)果與討論

2.1菊花蜂花粉總多糖的提取和分離純化

500 g干燥的菊花蜂花粉經(jīng)熱水煮提,4倍體積乙醇沉淀,常規(guī)干燥,共得到39.5 g菊花蜂花粉總多糖(WDPP),收率為7.9%。WDPP主要由鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)及阿拉伯糖(Ara)組成(表1),還含有少量的葡萄糖醛酸(GlcA)和甘露糖(Man)。其中,半乳糖和阿拉伯糖是總多糖的主要組成成分。

通過(guò)DEAE-纖維素柱層析,對(duì)WDPP進(jìn)行純化,共得到一個(gè)中性糖級(jí)分WDPP-N和兩個(gè)酸性糖級(jí)分WDPP-1、WDPP-2。其洗脫圖如圖1所示。

圖1　WDPP經(jīng)DEAE-纖維素柱層析洗脫后 總糖和糖醛酸分布曲線圖Fig.1　Distribution of total carbohydrate and uronic acid of WDPP on DEAE-Cellulose column

通過(guò)DEAE-Cellulose分離純化,共得到一種菊花蜂花粉中性糖WDPP-N及兩種菊花蜂花粉酸性糖WDPP-1、WDPP-2。

中性糖WDPP-N收率為32.8%,淡黃色粉末。主要由Gal、Ara和Glc組成,比例為30.3∶31.6∶32.7,約為1∶1∶1。推測(cè)其含有阿拉伯半乳聚糖和葡聚糖。同時(shí),中性糖中還含有少量的Man。

WDPP-1主要由Rha(3.4%)、GalA(9.3%)、Gal(38.6%)和Ara(37.1%)組成。Rha和GalA的比例約為1∶3,符合文獻(xiàn)中對(duì)RG-I型果膠的定義[10-11],具有少量的RG-I和HG結(jié)構(gòu)域。Gal和Ara比例約為1∶1,總量達(dá)到75%以上,推測(cè)其中含有大量的阿拉伯半乳聚糖片段。

表1　菊花蜂花粉多糖各級(jí)分收率及組成分析Table 1　Yield and monosaccharide composition of polysaccharides from bee pollen of Dendranthema indicum

注:a多糖產(chǎn)量與蜂花粉干物質(zhì)的百分比;b該級(jí)分與上樣量的百分比。

WDPP-2主要由Rha(10.2%)、GalA(30.4%)、Gal(16.0%)和Ara(40.7%)組成。Rha與GalA的比例約為1∶3,含有大量的RG-I型和HG果膠。Ara含量較高,推測(cè)存在大量的阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖。

菊花蜂花粉中的兩種酸性糖主要由Rha、GalA、Gal和Ara組成,并隨著洗脫液鹽濃度的增加,組成呈現(xiàn)規(guī)律性的變化。當(dāng)洗脫液的鹽濃度較小時(shí),洗脫下來(lái)的酸性糖中鼠李糖和半乳糖醛酸比例較小,同時(shí)阿拉伯糖和半乳糖比例為1∶1。當(dāng)鹽濃度增大時(shí),鼠李糖和半乳糖醛酸含量逐漸增高,同時(shí)阿拉伯糖比例上升,半乳糖比例下降?？傮w來(lái)說(shuō),兩種菊花蜂花粉酸性糖級(jí)分都是含有阿拉伯半乳聚糖片段的RG-I型果膠,同時(shí)有少量HG結(jié)構(gòu)域存在。

2.2菊花蜂花粉多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響

菊花蜂花粉多糖對(duì)HCT116腫瘤細(xì)胞體外增殖活性的影響如圖2所示。低濃度時(shí),各級(jí)分對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性不明顯,高濃度時(shí)抑制活性顯著。WDPP的對(duì)HCT116腫瘤細(xì)胞的抑制活性高于中性糖及酸性糖級(jí)分。

圖2　菊花蜂花粉多糖對(duì)HCT116腫瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.2　Anti-proliferative effects of bee pollen polysaccharides from Dendranthema indicum on HCT116 cells注:*p<0.05差異顯著,**p<0.01差異極顯著。

菊花蜂花粉多糖對(duì)HT-29細(xì)胞的體外增殖活性影響如圖3所示。WDPP、WDPP-N和WDPP-2對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性隨濃度增加而增強(qiáng),具有一定的濃度依賴性。WDPP濃度為5 mg/mL時(shí)腫瘤細(xì)胞存活率低于20%,抑制作用明顯強(qiáng)于其它級(jí)分。

圖3　菊花蜂花粉多糖對(duì)HT-29腫瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.3　Anti-proliferative effects of bee pollen polysaccharides from Dendranthema indicum on HT-29 cells注:*p<0.05差異顯著,**p<0.01差異極顯著。

3　結(jié)論與討論

目前關(guān)于多糖的結(jié)構(gòu)、性能和活性研究越來(lái)越深入,在食品工業(yè)中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛[12]。多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,活性多樣。不同結(jié)構(gòu)的多糖具有不同的生物活性。本研究所得到的菊花蜂花粉總多糖主要由Ara(37.8%)、Gal(27.7%)、Glc(17.2%)和GalA(6.0%)組成。通過(guò)DEAE-Cellulose分離純化,將菊花蜂花粉總多糖分離為幾種不同類型的級(jí)分。WDPP-N主要由Gal(30.3%)、Ara(31.6%)和Glc(32.7%)組成,WDPP-1主要由Rha(3.4%)、GalA(9.3%)、Gal(38.6%)和Ara(37.1%)組成,WDPP-2主要由Rha(10.2%)、GalA(30.4%)、Gal(16.0%)和Ara(40.7%)組成。體外抗腫瘤活性結(jié)果表明,菊花蜂花粉總多糖在濃度為5 mg/mL時(shí)能夠顯著抑制HCT116和HT-29腫瘤細(xì)胞的增殖,抑制率分別為61%和81%,活性優(yōu)于中性糖和酸性糖級(jí)分。本論文的研究結(jié)果能夠?yàn)榫栈ǚ浠ǚ塾行Щ钚猿煞值难芯康於ɑA(chǔ),為蜂花粉多糖的應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)和依據(jù),也可以為其它類型蜂花粉多糖的研究提供一定的思路。

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Study on extraction,purification and antitumor activity of polysaccharide from bee pollen ofDendranthemaindicum

WANG Bo1,2,3,ZHANG Meng-shan3,ZHANG Zhong-yu3,LI Shan-shan1,3,*

(1.Institute of Special Animal and Plant Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130012,China;2.College of Chemistry and Biology,Beihua University,Jilin 132013，China;3.School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China)

The purification procedures,physiochemical features and antitumor activity of polysaccharide fractions from bee pollen ofDendranthemaindicumwere studied in this paper. Polysaccharide fractions(WDPP)was dealed with water-extraction,ethnol-precipetation and ion-exchange chromatography,then one netral(WDPP-N)and two acidic fractions(WDPP-1,WDPP-2)were obtained. The monosaccharide composition was tested through HPLC,the antitumor activity of all fractions were investigated by MTT method. WDPP-N was composed of galactose,arabinose,and glucose with a ratio of 30.3∶31.6∶32.7;WDPP-1 and WDPP-2 were mainly composed by galacturonic acid,galactose and arabinose,rhamose and glucose as small proportion. Total polysaccharide had obvious inhibition effect on HT-29 and HCT116 tumor cells in high concentration compared with neutral and acidic fractions.

bee pollen ofDendranthemaindicum;polysaccharide;extraction and purification;antitumor activity

2015-08-27

王博(1978-),女,博士研究生,講師,研究方向:天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能,E-mail:shanshanli123456@163.com。

李珊珊(1984-),女,博士研究生,助理研究員,研究方向:糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能,Email:lishanshan@caas.cn。

TS201.2

A

1002-0306(2016)05-0358-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.064