張　弘,馬偉超,陳可泉

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 211816)

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戊二胺高通量檢測(cè)方法的研究

張弘,馬偉超,陳可泉*

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 211816)

本文以全細(xì)胞催化法制備的1,5-戊二胺轉(zhuǎn)化液為檢測(cè)對(duì)象,通過對(duì)萃取劑、反應(yīng)溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,建立了一種基于分光光度法的高通量生物胺檢測(cè)方法。結(jié)果表明,使用對(duì)二甲苯為萃取劑更有利于排除底物L(fēng)-賴氨酸的影響,1,5-戊二胺與2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)衍生反應(yīng)的最佳條件為42 ℃,反應(yīng)6 min。應(yīng)用該方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2為0.9988,線性范圍為4.176～20.88 μg。方法學(xué)研究表明本方法有較好的精確度(RSD=1.722%)與重現(xiàn)性(RSD=6.414%),其加標(biāo)回收率為100.5%。本方法操作簡(jiǎn)單,省時(shí),適用于生物胺的常規(guī)快速定量檢測(cè)。

生物胺,分光光度法,高通量檢測(cè)

生物胺是一類堿性含氮、具有生物活性的小分子有機(jī)物的總稱,包括尸胺、組胺、多巴胺等,廣泛存在于生物體中,具有重要的生理作用[1],其含量的高低可作為疾病診斷[2]或食品檢驗(yàn)[3]的指標(biāo)。此外,生物胺中的尸胺(1,5-戊二胺)可作為尼龍單體與丁二酸、癸二酸等聚合生成PA5.4、PA5.10等生物尼龍[4],特別是近期利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)1,5-戊二胺的研究,使其產(chǎn)量較發(fā)酵法有大幅度的提升,具有廣闊的工業(yè)化前景[5-6]。生物胺的快速、高通量檢測(cè)在食品安全、疾病診斷以及工業(yè)化生產(chǎn)中都具有重要的意義,目前常用的檢測(cè)方法中液相色譜應(yīng)用較廣泛,回收率可控制在83%～116%[7],但需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理,過程復(fù)雜,耗時(shí)較長(zhǎng),樣品衍生及檢測(cè)耗時(shí)約1.5 h[8];氣相色譜法需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,不同生物胺的檢測(cè)方法通用性較差,且準(zhǔn)確性相對(duì)較差,部分樣品回收率可控制在74%～115%[9];而薄層色譜操作簡(jiǎn)單,成本低廉,但其通用性較差,且耗時(shí)較長(zhǎng),檢測(cè)全程需1～1.5 h,部分樣品回收率可控制在85%～92%[10]。因而都無法滿足高通量檢測(cè)的要求。由于生物胺可以與顯色劑TNBS反應(yīng),且具有特定的紫外吸收峰[11],因而可應(yīng)用這一特性,利用分光光度法實(shí)現(xiàn)生物胺的高通量定量檢測(cè)。本文利用分光光度法,以全細(xì)胞催化法獲得的1,5-戊二胺轉(zhuǎn)化液為研究對(duì)象,建立了一種1,5-戊二胺的高通量檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

戊二胺梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;5%(w/v)2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)Sigma公司;L-賴氨酸鹽酸鹽生工生物工程上海(股份)有限公司;其它試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀美國(guó)賽默飛世爾科技公司;GZX-9140 MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;UV-star 96孔板德國(guó)Greiner Bio-one公司;96孔深孔板生工生物工程上海(股份)有限公司;MS 3數(shù)顯混勻器德國(guó)IKA集團(tuán);Multipette M4分液器德國(guó)Eppendorf公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別稱取0.1044 g 1,5-戊二胺和0.1100 gL-賴氨酸,配制濃度為20.88 g/L的1,5-戊二胺溶液和22.00 g/L的L-賴氨酸溶液,再將其分別稀釋100倍,配制2.088 g/L的1,5-戊二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和2.200 g/L L-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。10 mol/L TNBS溶液的配制:取5%(w/v)TNBS 294 μL,用超純水定容于5 mL容量瓶中。

1.2.21,5-戊二胺樣品的制備利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法制備1,5-戊二胺樣品[5],經(jīng)HPLC法檢測(cè),確定其1,5-戊二胺濃度為2.667 g/L。

1.2.31,5-戊二胺的測(cè)定取5 μL的樣品,用水補(bǔ)充至50 μL,與50 μL的1 mol/L NaCO3和50 μL的10 mmol/L TNBS在一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間;取100 μL冷卻后的反應(yīng)混合物至96孔深孔板中,加入500 μL的甲苯(或?qū)Χ妆?震蕩萃取2 min后室溫靜置分相3 min;分別吸取100 μL上層萃取液和100 μL無水乙醇至UV-star 96孔板中進(jìn)行混合,利用酶標(biāo)儀在340 nm下測(cè)其吸光度。

1.2.4底物賴氨酸對(duì)檢測(cè)的影響為檢驗(yàn)剩余的底物L(fēng)-賴氨酸對(duì)1,5-戊二胺檢測(cè)的影響,分別制備兩組實(shí)驗(yàn)樣品,其中樣品1為含10.44 μg戊二胺的水溶液;樣品2包含10.44 μg 1,5-戊二胺及11.00 μg L-賴氨酸。將兩份樣品按方法1.2.3進(jìn)行檢測(cè)(反應(yīng)溫度為42 ℃,反應(yīng)時(shí)間為6 min),分別用甲苯和對(duì)二甲苯進(jìn)行萃取,用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光值。

1.2.5反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)溫度優(yōu)化:按1.2.3的方法檢測(cè)1,5-戊二胺在34、38、42、44、46 ℃條件下與TNBS反應(yīng)6 min后的吸光值變化。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化:按1.2.3的方法檢測(cè)1,5-戊二胺在優(yōu)化后的溫度下與TNBS分別反應(yīng)2、4、6、8、10 min后的吸光值變化。

1.2.61,5-戊二胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別取質(zhì)量為4.176、8.352、12.528、16.704、20.88 μg的1,5-戊二胺,按1.2.5所確定的方法對(duì)各樣品的吸光度進(jìn)行檢測(cè),繪制出吸光度-戊二胺質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2　結(jié)果與分析

2.1底物賴氨酸對(duì)檢測(cè)的影響

由于底物L(fēng)-賴氨酸也可與TNBS反應(yīng),其生成的N,N′-雙三硝基苯酰賴氨酸(TNP-lysine)在340 nm下也具有紫外吸收[11],但由于TNP-lysine主要溶于水相,而TNBS與1,5-戊二胺的衍生產(chǎn)物N,N′-雙三硝基苯酰戊二胺(TNP-cadaverine)溶于有機(jī)相,因而通過選擇適宜的有機(jī)萃取劑,可有效排除底物L(fēng)-賴氨酸對(duì)檢測(cè)的影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲苯和對(duì)二甲苯作為萃取劑對(duì)檢測(cè)的影響,結(jié)果如圖1所示。用甲苯作為萃取劑時(shí),樣品1(1,5-戊二胺)和樣品2(1,5-戊二胺+L-賴氨酸)的吸光值具有顯著差異(p<0.05),而用對(duì)二甲苯作為萃取劑時(shí),樣品1和樣品2的吸光值沒有顯著差異(p>0.05),說明使用對(duì)二甲苯作為萃取劑可以有效排除L-賴氨酸對(duì)檢測(cè)的干擾。

圖1　賴氨酸對(duì)檢測(cè)的影響Fig.1　The influence of lysine on the determination of cadaverine

2.2最佳反應(yīng)溫度的確定

在衍生化反應(yīng)中,溫度具有重要影響,其過低或過高都會(huì)影響分析效果[12]。本實(shí)驗(yàn)取1,5-戊二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μL(含1,5-戊二胺10.44 μg),按1.2.3的方法檢測(cè)在34、38、42、44、46 ℃條件下反應(yīng)6 min后的吸光值變化。結(jié)果表明,在42 ℃下反應(yīng)物的吸光值最高(如圖2所示),說明在42 ℃時(shí)1,5-戊二胺與TNBS反應(yīng)較充分,且形成的絡(luò)合物也最穩(wěn)定,因此本方法采用的反應(yīng)溫度為42 ℃。

圖2　反應(yīng)溫度的優(yōu)化Fig.2　The optimization of reaction temperature

2.3最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

TNBS與1,5-戊二胺反應(yīng)時(shí)間過短,反應(yīng)無法充分進(jìn)行,若反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng),不僅降低實(shí)驗(yàn)效率,而且還可能會(huì)對(duì)產(chǎn)物穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[11]。本實(shí)驗(yàn)取1,5-戊二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μL(含1,5-戊二胺10.44 μg),按1.2.3的方法在42 ℃分別反應(yīng)2、4、6、8、10 min。結(jié)果表明,反應(yīng)6 min時(shí)反應(yīng)物的吸光值達(dá)到最大值(如圖3所示),說明反應(yīng)6 min時(shí),1,5-戊二胺與TNBS反應(yīng)比較充分,反應(yīng)產(chǎn)物也比較穩(wěn)定。因此本方法采用的反應(yīng)時(shí)間為6 min。

表1　精密度實(shí)驗(yàn)Table 1　Results of precision tests

表2　重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)Table 2　Results of reproducibility tests

圖3　反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化Fig.3　The optimization of reaction time

2.41,5-戊二胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以1.2.3中的方法為基礎(chǔ),反應(yīng)溫度定為42 ℃,反應(yīng)時(shí)間定為6 min,建立最終的檢測(cè)方法。運(yùn)用該方法測(cè)定不同質(zhì)量的戊二胺,結(jié)果表明,1,5-戊二胺質(zhì)量與吸光度具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2為0.9988,方程為:Y=0.04035X-0.0681,線性范圍為4.176～20.88 μg(如圖4所示)。

圖4　1,5-戊二胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　Standard curve of Cadaverine

2.5方法學(xué)考察

2.5.1精密度實(shí)驗(yàn)取6 μL全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液樣品,按1.2.5所確定的方法進(jìn)行檢測(cè),連續(xù)測(cè)量6次[13],結(jié)果顯示精密度實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.722%(如表1所示),表明該方法具有良好的精密度。

2.5.2重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)同一批次6份樣品各取3 μL測(cè)量其1,5-戊二胺含量,進(jìn)行方法的重現(xiàn)性考察[13]。結(jié)果表明,重現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.414%(如表2所示),表明該方法具有較好的重現(xiàn)性。

2.5.3加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)取全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液樣品5 μL,向其中加入5 μg 1,5-戊二胺標(biāo)品,按1.2.5的方法進(jìn)行檢測(cè),連續(xù)測(cè)量5次,每次測(cè)量3個(gè)平行樣,計(jì)算其回收率[14-15]。結(jié)果表明,各組的回收率均在95%～105%范圍內(nèi),平均回收率為100.5%,顯示該方法具有較高的準(zhǔn)確性(如表3所示)。

表3　回收率實(shí)驗(yàn)Table 3　Results of recovery tests

3　結(jié)論

本文通過對(duì)萃取劑的選擇、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化,建立了一種快速、高通量檢測(cè)1,5-戊二胺的方法,且有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。在本方法中,最佳反應(yīng)溫度為42 ℃,最佳反應(yīng)時(shí)間為6 min,采用對(duì)二甲苯為萃取劑可以有效排除底物L(fēng)-賴氨酸對(duì)檢測(cè)的影響。吸光度-1,5-戊二胺質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2為0.9988,線性范圍為4.176～20.88 μg。此外,由于使用了高通量檢測(cè)儀器,檢測(cè)效率明顯提高,在實(shí)際應(yīng)用中,該方法可以用于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液等組分比較單一的樣品的定性、定量分析,也可用于食品安全等領(lǐng)域的生物胺初步、快速檢測(cè)。

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Study on the high-throughput detection of cadaverine

ZHANG Hong,MA Wei-chao,CHEN Ke-quan*

(Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 211816,China)

In this paper,to develop a high-throughput bioamine detection method based on spectrophotometry,the cadaverine concentration in a whole-cell bioconversion solution was determined,and the extracting agent,reaction temperature and time were optimized. The results showed that the use of p-xylene as the extraction agent was more conducive to eliminate the influence of theL-lysine on bioamine detection,and the optimal conditions for the derivatization of cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)were 42 ℃ and 6 min. By using this method,a standard curve with a correlation coefficient(R2)of 0.9988 was obtained,and the linear range was 4.176～20.88 μg. The results of validation studies showed that,this method was precise(RSD=1.722%)and reproducible(RSD=6.414%),and the recovery was 100.5%. This method was simple,time-saving and suitable for the conventional rapid quantitative detecting of biogenic amines.

cadaverine;spectrophotometry;high-throughput detection

2015-08-27

陳可泉(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：生物催化工程,E-mail:kqchen@njtech.edu.cn。

張弘(1989-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：分子生物學(xué)與發(fā)酵工程,E-mail:zh644705227@hotmail.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21390200);國(guó)家自然科學(xué)基金(31440024)；“973”計(jì)劃(2011CBA00807)；“863”計(jì)劃(2014AA021703)。

TS207.7

A

1002-0306(2016)05-0283-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.048