樂(lè)　薇,李　剛

(武漢工商學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院,湖北武漢 430065)

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內(nèi)部沸騰法提取箬葉總黃酮的研究

樂(lè)薇,李剛

(武漢工商學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院,湖北武漢 430065)

目的:確定內(nèi)部沸騰法提取箬葉總黃酮的優(yōu)化工藝。方法:以黃酮得率為指標(biāo),分別在解吸過(guò)程和提取過(guò)程的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),考察內(nèi)部沸騰法提取箬葉總黃酮含量的最佳條件,并與回流法、超聲波法、微波法進(jìn)行了比較。結(jié)果:內(nèi)部沸騰法提取箬葉總黃酮最佳條件是在固液比1∶3的90%乙醇溶液中解吸25 min后,在85 ℃下,在固液比為1∶30的30%乙醇溶液中提取5 min,箬葉總黃酮的得率達(dá)到2.05%,異葒草苷含量為1.656 mg·g-1,葒草苷含量為0.454 mg·g-1,與回流法、超聲波法和微波法相比,黃酮得率差異不顯著(p>0.05),但乙醇用量少,成本低。

內(nèi)部沸騰法,總黃酮,箬葉

箬葉為禾本科竹亞科箬竹屬植物葉的總稱。該屬植物約為20種以上,均產(chǎn)至我國(guó),主要分布于長(zhǎng)江以南各省區(qū),自古以來(lái)就是端午節(jié)標(biāo)志食品-粽子的包裝物[1]。據(jù)我國(guó)醫(yī)書(shū)記載,箬葉味甘,性寒,有清熱止血、解毒消腫之功效。箬葉中含有黃酮類、活性多糖、特種氨基酸和肽類、微量元素、維生素、揮發(fā)油等多種功能性成分,殺菌、防腐、抗癌等多種功能作用顯著,可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及日化用品等[2-9]。作為箬葉中重要的抗菌活性成分之一,箬葉總黃酮已經(jīng)逐漸引起研究者的重視[10-12],但關(guān)于總黃酮的提取方法報(bào)道不多,已有報(bào)道采用的是常規(guī)的回流法[13],但該法提取時(shí)間長(zhǎng),能量消耗大,溶劑量大。內(nèi)部沸騰法是一種新型的提取分離技術(shù),該法首先用少量低沸點(diǎn)溶劑浸潤(rùn)物料,使被提取組分得到充分浸潤(rùn),然后加入另外一種高于浸泡物料溶劑沸點(diǎn)的提取劑,讓滲入物料內(nèi)部的溶劑來(lái)不及擴(kuò)散就沸騰,從而將被提取組分大量的挾帶至提取溶劑中,可大大縮短提取時(shí)間,強(qiáng)化了提取過(guò)程[14-16]。目前內(nèi)部沸騰法已在丹參[17]、三七皂苷[18]、香菇多糖[19]、絞股藍(lán)總黃酮[20]等的提取中取得了較好的效果。本文擬采用內(nèi)部沸騰法對(duì)箬葉總黃酮進(jìn)行強(qiáng)化提取,旨在為箬葉的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

箬葉湖北武陵山區(qū),洗凈后于烘箱中40 ℃干燥6 h,于粉碎機(jī)中粉碎,過(guò)16目篩,于樣品袋中冷藏保存。

氫氧化鈉天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;95%無(wú)水乙醇天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司;亞硝酸鈉洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠;硝酸鋁天津市天力化學(xué)試劑有限公司;冰乙酸天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;以上試劑均為分析純;乙腈色譜純、天津市化學(xué)試劑三廠;甲醇色譜純、天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;葒草苷、異葒草苷、蘆丁 標(biāo)準(zhǔn)品 南京春秋生物工程有限公司。

722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司;KQ3200E超聲波發(fā)生器昆山市超聲儀器有限公司;LC-1000型高效液相色譜儀山東魯南瑞虹化工儀器有限公司;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;FD-1A-50冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2箬葉黃酮含量的測(cè)定

1.2.1光度法測(cè)定總黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15 mg溶于30%乙醇中,并定容至100 mL。用移液管分別取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中,加入5%亞硝酸鈉0.3 mL,使其混勻,放置6 min后加入10%硝酸鋁0.3 mL。搖勻靜置6 min后加入4 mL 4%氫氧化鈉,以30%乙醇定容至刻度,搖勻靜置10 min后在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)吸光度,參比為不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的溶液。以測(cè)定的吸光度A為縱坐標(biāo),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度c為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。箬葉提取液中黃酮含量的測(cè)定:準(zhǔn)確移取1.00 mL黃酮提取液于10 mL容量瓶中,按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法加入各種試劑,以不加黃酮提取液的溶液為參比,在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度,并按式(1)計(jì)算總黃酮得率:

(式1)

式中:c為總黃酮的濃度(μg·mL-1);m為箬葉粉末的質(zhì)量(g);V為溶液的體積(mL);n為稀釋倍數(shù)。

1.2.2HPLC測(cè)定提取液中黃酮碳苷的含量制備標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取異葒草苷、葒草苷各10 mg分別于50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,用超聲震蕩輔助對(duì)照品溶解。制成濃度為200 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液;HPLC檢測(cè)條件:C18色譜柱(150 mm×4.6 mm);流動(dòng)相:乙腈/水(14/86,v/v),水中含有0.5%的乙酸;流速:0.8 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm[21-23]。

1.3內(nèi)部沸騰法提取箬葉總黃酮

準(zhǔn)確稱取1.0 g箬葉粉末后,采用單因素及正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行內(nèi)部沸騰法提取箬葉總黃酮,測(cè)定各提取液中總黃酮的含量,并計(jì)算出對(duì)應(yīng)的得率,具體步驟如下:

1.3.1解吸過(guò)程的單因素實(shí)驗(yàn)采取少量乙醇潤(rùn)濕箬葉粉末一段時(shí)間,以使箬葉黃酮能被解吸。乙醇濃度的影響:取3 mL一定濃度乙醇溶液解吸20 min后,在85 ℃下用25 mL的30%乙醇溶液提取5 min,共進(jìn)行兩次;解吸時(shí)間的影響:取3 mL 的80%乙醇溶液解吸一定時(shí)間后,在85 ℃下用25 mL的30%乙醇溶液進(jìn)行提取5 min,共進(jìn)行兩次;解吸劑用量的影響:取一定體積的80%乙醇溶液解吸20 min后,在85 ℃下用25 mL的30%乙醇溶液提取5 min,共進(jìn)行兩次。

1.3.2解吸過(guò)程的正交實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取1.0 g箬葉粉末,按表1進(jìn)行解吸過(guò)程的正交實(shí)驗(yàn),然后在85 ℃下用25 mL 30%乙醇溶液提取5 min,共提取兩次,以箬葉總黃酮的得率為指標(biāo)進(jìn)行考察。

表1　解吸過(guò)程的正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　The factors and levels of orthogonal test for desorption process

1.3.3提取過(guò)程的單因素實(shí)驗(yàn)乙醇濃度的影響:取3 mL 90%乙醇溶液解吸20 min后,在85 ℃下用25 mL的一定濃度乙醇溶液提取5 min,共進(jìn)行兩次;提取溫度的影響:取3 mL 90%乙醇溶液解吸20 min后,在不同溫度下用25 mL的30%乙醇溶液進(jìn)行提取5 min,共進(jìn)行兩次;提取劑用量:取3 mL 90%乙醇溶液解吸20 min后,在85 ℃下用不同體積的30%乙醇溶液進(jìn)行提取5 min,共進(jìn)行兩次;提取時(shí)間的影響:取3 mL 90%乙醇溶液解吸20 min后,在85 ℃下用25 mL 30%乙醇溶液提取5 min,共進(jìn)行兩次。

1.3.4提取過(guò)程的正交實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取1.0 g箬葉粉末,取3 mL 90%乙醇溶液解吸20 min后,按照表2進(jìn)行提取過(guò)程的正交實(shí)驗(yàn),共提取兩次,以箬葉總黃酮的得率為指標(biāo)進(jìn)行考察。

表2　提取過(guò)程的正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2　The factors and levels of orthogonal test for extraction process

1.3.5其他方法提取箬葉總黃酮選取了前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)優(yōu)化的箬葉黃酮提取工藝條件分別對(duì)箬葉總黃酮進(jìn)行提取,并測(cè)定提取液中的總黃酮含量及異葒草苷、異牡荊苷的含量。超聲波法提取箬葉總黃酮:按固液比為1∶25加入60%的乙醇溶液,在150 W的超聲波清洗機(jī)超聲提取35 min,共提取兩次;回流法提取箬葉總黃酮:按固液比1∶20加入85%的乙醇回流50 min,共提取兩次;微波法提取箬葉總黃酮:按固液比1∶20加入80%的乙醇,700 W微波提取2 min,共提取兩次。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(M±SE)表示,采用Origin軟件進(jìn)行做圖。

2　結(jié)果與討論

2.1光度法測(cè)定箬葉黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

按1.2.1操作,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,得到回歸方程為A=0.0105c+0.0017,R2=0.9998。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of rutin

2.2內(nèi)部沸騰法解吸過(guò)程的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1解吸劑濃度對(duì)箬葉總黃酮得率的影響解吸劑濃度對(duì)箬葉總黃酮得率的影響如圖2所示?？芍?解吸劑體積分?jǐn)?shù)在50%～80%間,箬葉總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于80%后,得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而減小。原因可能是乙醇的體積分?jǐn)?shù)不同,滲透進(jìn)入箬葉細(xì)胞內(nèi)部的能力也不同,解吸黃酮的效果也有差別。在一定乙醇濃度范圍內(nèi),解吸黃酮的能力隨乙醇的體積分?jǐn)?shù)增大而增大,但是當(dāng)乙醇濃度增大到一定程度時(shí),乙醇的滲透能力下降,反而導(dǎo)致黃酮浸出受影響。所以解吸劑最佳體積分?jǐn)?shù)約80%。

圖2　解吸劑濃度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2　The effect of desorption agent’s concentration on the yield of flavonoids

2.2.2解吸時(shí)間對(duì)箬葉總黃酮得率的影響解吸時(shí)間對(duì)箬葉總黃酮得率的影響如圖3所示。可知在5～20 min間,箬葉黃酮得率隨解吸時(shí)間的增大而增大,20 min后箬葉總黃酮浸出量趨于穩(wěn)定,說(shuō)明此解吸過(guò)程可能以普通的分子擴(kuò)散過(guò)程為主。為節(jié)省時(shí)間,解吸時(shí)間選擇為20 min。

2.2.3解吸劑用量對(duì)箬葉總黃酮得率的影響由圖4可知解吸劑用量少時(shí),箬葉總黃酮的滲透及解吸不充分,但進(jìn)一步增大用量時(shí),箬葉黃酮與解吸劑接觸表面積增大,可充分解吸,用量為3 mL時(shí)趨于穩(wěn)定,此后再增加解吸劑用量,黃酮得率基本不變。因此選擇3 mL乙醇溶液解吸。

圖3　解吸時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3　The effect of desorption time on the yield of flavonoids

圖4　解吸劑用量對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4　The effect of desorption agent’volume on the yield of flavonoids

2.3解吸過(guò)程的正交實(shí)驗(yàn)

2.3.1正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3　箬葉中提取總黃酮中解吸過(guò)程正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3　The results of orthogonal test for desorption process

可知箬葉總黃酮得率受解吸劑濃度影響程度達(dá)到顯著水平,對(duì)黃酮得率的極差分析可知影響能力大小順序?yàn)?解吸劑濃度>解吸時(shí)間>解吸劑用量。由正交實(shí)驗(yàn)可得解吸階段最佳工藝水平是3 mL的90%的乙醇解吸25 min。

表4　解吸過(guò)程正交結(jié)果方差分析Table 4　The analysis of variance for desorption process

2.3.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在解吸最佳條件下,重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5,可知,實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。

表5　解吸過(guò)程的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5　The results of repetivite experiment for desorption process

2.4內(nèi)部沸騰法提取過(guò)程的單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1提取劑濃度對(duì)箬葉總黃酮得率的影響由圖5可知,隨著提取劑乙醇濃度的提高,總黃酮得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),在30%時(shí)黃酮得率最高。這可能是增大乙醇濃度時(shí),一方面使提取過(guò)程中黃酮溶解速度加快,但同時(shí)也使乙醇溶液汽化揮發(fā)加快,沸騰持續(xù)過(guò)程短,降低了黃酮在箬葉中的傳質(zhì)效果。因此選取提取劑的最適濃度是30%。

圖5　提取劑濃度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5　The effect of extrction agent’s concentration on the yield of flavonoids

2.4.2提取溫度對(duì)箬葉總黃酮得率的影響由圖6可知,當(dāng)溫度范圍處于75～85 ℃之間時(shí),黃酮浸出效果隨溫度的增大而增強(qiáng),溫度大于85 ℃后,黃酮浸出量反而減小。溫度低于85 ℃時(shí),黃酮成分在提取溶液中擴(kuò)散較慢,溶解不完全,提取效果較差,隨著溫度的增大,乙醇沸騰越來(lái)越劇烈。當(dāng)沸騰速度超過(guò)一定速度時(shí),由于乙醇揮發(fā)較快,對(duì)流傳質(zhì)持續(xù)的過(guò)程不長(zhǎng),同樣造成箬葉中黃酮浸提不完全。因此選擇提取的最佳溫度是85 ℃。

2.4.3提取劑用量對(duì)箬葉總黃酮得率的影響由圖7可知,提取劑用量低于25 mL時(shí),黃酮浸出不充分,隨著提取劑的增加,黃酮得率提高,在25 mL時(shí)基本達(dá)到最大浸出,此時(shí)箬葉中黃酮成分基本浸出,繼續(xù)增加提取劑用量而黃酮不再增加,即25 mL為最合適的提取劑用量。

圖6　提取溫度對(duì)總黃酮浸出量的影響Fig.6　The effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

圖7　提取劑用量對(duì)總黃酮浸出量的影響 Fig.7　The effect of extraction agent’volume on the yield of flavonoids

2.4.4提取時(shí)間對(duì)箬葉總黃酮得率的影響由圖8可知,在1～5 min間,隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng),箬葉中提取的黃酮得率越來(lái)越高,5～9 min間,黃酮提取量趨于穩(wěn)定而不再增加,內(nèi)部沸騰法提取黃酮效率較高,在5 min完成浸提,繼續(xù)浸提沒(méi)有更多黃酮浸出。所以提取過(guò)程選擇5 min。

圖8　提取時(shí)間對(duì)總黃酮浸出量的影響Fig.8　The effect of extraction time on the yield of flavonoids

2.5提取過(guò)程的正交實(shí)驗(yàn)

內(nèi)部沸騰法提取過(guò)程的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6和表7?？芍枞~總黃酮的提取過(guò)程中,四種因素對(duì)黃酮得率均未達(dá)到顯著影響,影響能力大小順序是提取劑用量>提取劑濃度>提取溫度>提取時(shí)間。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)可知內(nèi)部沸騰法的提取階段最佳工藝為30 mL的30%的乙醇溶液在90 ℃下提取7 min,但由于提取時(shí)間和提取溫度對(duì)箬葉黃酮的得率影響較小,從生產(chǎn)成本考慮,可進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝為30 mL的30%的乙醇溶液在85 ℃下提取5 min。

表7　提取過(guò)程正交結(jié)果方差分析Table 7　The analysis of variance for extraction process

表6　箬葉中總黃酮提取過(guò)程正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6　The results of orthogonal test for extraction process

2.6內(nèi)部沸騰法提取箬葉中總黃酮的重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化的解吸及提取條件下重復(fù)三次實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表8,說(shuō)明優(yōu)化工藝的穩(wěn)定性良好。并將提取液減壓濃縮后冷凍干燥,得到浸膏,浸膏中黃酮含量為19%。

表8　內(nèi)部沸騰法提取箬葉總黃酮的重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)Table 8　The results of repetivite experiment for extraction process

2.7內(nèi)部沸騰法與其他提取箬葉總黃酮方法的比較

采用不同方法對(duì)箬葉總黃酮進(jìn)行提取,結(jié)果如表9～表10所示。超聲波法、微波法、回流法和內(nèi)部沸騰法等提取方法對(duì)箬葉黃酮得率不存在顯著差異(p>0.05)。在4種提取方法中,回流法能耗最高,微波法所需時(shí)間最短。但內(nèi)部沸騰法實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單,無(wú)需超聲波法和微波法所需的特殊儀器,且消耗乙醇量最少,單次提取時(shí)間僅比微波法多3 min,盡管比其他方法多了25 min的潤(rùn)濕時(shí)間(即解吸時(shí)間),但此步過(guò)程不需加熱,所以內(nèi)部沸騰法成本更低。

3　結(jié)論

通過(guò)解吸過(guò)程和提取過(guò)程的單因素實(shí)驗(yàn)確定了內(nèi)部沸騰法提取箬葉總黃酮的最適條件。解吸過(guò)程最佳條件為:解吸劑濃度90%乙醇、解析時(shí)間20 min、解吸劑用量3 mL·g-1。提取過(guò)程最佳條件為:提取劑濃度30%、提取時(shí)間5 min、提取溫度85 ℃、提取劑用量30 mL·g-1。通過(guò)解吸過(guò)程的正交實(shí)驗(yàn)得到三個(gè)因素的影響能力大小順序?yàn)?解吸劑濃度>解吸時(shí)間>解吸劑用量。提取過(guò)程的正交實(shí)驗(yàn)得到四個(gè)因素的影響能力大小順序?yàn)?提取劑用量>提取劑濃度>提取溫度>提取時(shí)間。與超聲波法、微波法及回流法相比,內(nèi)部沸騰法在黃酮得率上無(wú)顯著差異,但成本更低,可以用于箬葉總黃酮的提取。

表9　提取方法對(duì)箬葉總黃酮含量的影響Table 9　The effect of extraction methods on the yield of flavonoids

表10　多種方法提取箬葉總黃酮的比較Table 10　The comparison of different methods for extraction of flavonoids

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Extraction of total flavonoids from leaves of Indocalamus using inner ebullition method

YUE Wei,LI Gang

(Wuhan Technoligy and Business University,Wuhan 430065,China)

Objective:To explore the optimum extraction process of total flavonoids from leaves of Indocalamus by inner ebullition method. Methods:Through single-factor experiments of desorption/extraction process and the orthogonal experiments,the optimal extract conditions of the total flavonoids from leaves of Indocalamus by using inner ebullition method was studied. The method was also compared with reflux method,ultrasonic method and microwave method. Results:The optimal desorption conditions were as follows:solid-liquid ratio was 1∶3,ethanol concentration was 90%,the resolution time was 25 min. The optimal extraction conditions were:solid-liquid ratio was 1∶30,the temperature was 85 ℃,ethanol concentration was 30%,the extraction time was 5 min .The yield of total flavonoids was 2.05%,the content of isoorientin and orientin was 1.656,0.454 mg·g-1.Comparing with reflux method,ultrasonic method and microwave method,the inner ebullition method had no significant difference of yield of flavonoids,but lesser amount of ethanol and cheaper cost.

inner ebullition;total flavonoids;Indocalamus

2015-06-18

樂(lè)薇(1979-)，女，碩士，副教授，研究方向：生物分析：E-mail:yuewei11@126.com。

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013C111)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)05-0263-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.043