胡向東,潘玲燕,葉茂,胡偉卿

(浙江皇冠科技有限公司,浙江杭州　310012)

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高產(chǎn)蝦青素紅法夫酵母菌株的選育和發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化

胡向東,潘玲燕*,葉茂,胡偉卿

(浙江皇冠科技有限公司,浙江杭州310012)

目的:選育出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)蝦青素的紅法夫酵母菌株,并對培養(yǎng)基進行參數(shù)優(yōu)化。方法:以紅法夫酵母(P.Rhodozyma02)為出發(fā)菌株,分別進行紫外-氯化鋰(UV-LiCl)和60Co-γ誘變,從中篩選出高產(chǎn)蝦青素的突變株作為基因組重排育種的出發(fā)菌株;經(jīng)過五輪原生質(zhì)體融合,篩選得到的基因組重排最優(yōu)菌株。通過富含蝦青素合成前體的天然促進劑的添加及對發(fā)酵培養(yǎng)基的參數(shù)優(yōu)化,得到最佳培養(yǎng)基條件。結(jié)果:最終篩選得到高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)蝦青素的融合菌株F5-9,在此基礎(chǔ)上優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)基參數(shù)條件為葡萄糖30.0 g/L,蛋白胨3.0 g/L,酵母浸出粉7.0 g/L,(NH4)2SO45.0 g/L,MgSO4·7H2O 2.75 g/L,KH2PO41.5 g/L,CaCl2·2H2O 0.2 g/L,胡蘿卜汁150 mg/L,最終蝦青素的產(chǎn)量高達(83.39±1.03)mg/L,是原始出發(fā)菌株的17.56倍。結(jié)論:采用傳統(tǒng)誘變和基因組重排技術(shù),能顯著提高蝦青素產(chǎn)量,培養(yǎng)基中添加蝦青素前體物質(zhì)胡蘿卜汁能進一步促進蝦青素產(chǎn)量的提高。

紅法夫酵母,蝦青素,誘變,基因組重排,參數(shù)優(yōu)化

蝦青素具有極強的生物抗氧化性、還具有促進機體抗體產(chǎn)生、增強免疫力以及抗紫外線輻射等作用[1]。因而在食品添加劑、水產(chǎn)養(yǎng)殖、化妝品、保健品和醫(yī)藥工業(yè)方面有廣闊的應(yīng)用前景[2-5]。

紅法夫酵母是蝦青素的主要生物來源之一,但由于蝦青素是胞內(nèi)色素,是一種與細胞生長相偶聯(lián)的次級代謝產(chǎn)物,且紅法夫酵母最適生長溫度低,菌體生長緩慢,所以蝦青素的產(chǎn)量也比較低,目前高產(chǎn)蝦青素酵母菌株主要是通過反復(fù)多次誘變和篩選得到[6-7],但反復(fù)多次誘變會產(chǎn)生有毒的突變株,且會產(chǎn)生抗藥性,難以再大幅度提高產(chǎn)量。

基因組重排技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期,美國加州Maxgen公司Cardayré等首次提出的,是基于DNA Shuffling的原理[8]將傳統(tǒng)誘變技術(shù)和細胞融合技術(shù)相結(jié)合,以整個基因組作為重組對象的多親本原生質(zhì)體遞推融合技術(shù)。2002年Zhang等[9]又進一步提出在細胞水平的基因組重排,該技術(shù)模擬自然進化的過程,將誘變育種技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)相結(jié)合,以分子進化為核心在實驗室實現(xiàn)微生物全細胞快速定向進化。目前,基因組重排主要應(yīng)用于提高微生物代謝產(chǎn)物產(chǎn)率,增強菌株對環(huán)境的耐受性,提高底物利用率和范圍,改變代謝途徑產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物等。Wang等[10]采用紫外線與亞硝基胍(NTG)兩種誘變劑分別對干酪乳桿菌進行誘變,以獲得的突變菌株作為親本株進行了3輪原生質(zhì)體融合,得到的融合子可在pH3.6條件下生長,pH3.8條件下乳酸產(chǎn)量比野生型菌株提高3倍。Wang[11]等對一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌用UV和NTG對原生質(zhì)體誘變建立突變庫,經(jīng)過1輪重排,篩選到一株能產(chǎn)生3種新的倍半萜類化合物的突變株及一株能產(chǎn)生18種其他化合物的重排融合菌株。

針對野生紅法夫酵母菌株蝦青素產(chǎn)量低的問題,本文采用基因組重排技術(shù),即將原始出發(fā)菌株分別經(jīng)UV和60Co-γ誘變,篩選高產(chǎn)量正突變菌株,再進行原生質(zhì)體遞歸融合,最終得到高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)蝦青素的融合菌株,并對蝦青素產(chǎn)量最高菌株的發(fā)酵工藝進行了合理優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

親本菌株紅法夫酵母(P.Rhodozyma02),其來源為浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院保藏,由梁新樂(浙江杭州)贈送,于-80 ℃下保存;

培養(yǎng)基YM培養(yǎng)基、YM-二苯胺選擇性培養(yǎng)基、高滲再生培養(yǎng)基、選擇性再生培養(yǎng)基、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基均參照文獻[12]進行配制,種子培養(yǎng)基為YM液體培養(yǎng)基。

1.2培養(yǎng)及分析方法

1.2.1溶液配制生理鹽水:稱取8.5 g NaCl溶于1000 mL去離子水中,分裝高壓蒸氣滅菌后待用;KCl高滲緩沖液的配制(0.8 mol/L):稱取59.6 g KCl溶解于0.01 mol/L的Tris-HCl(pH7.4)緩沖溶液中,定容到1000 mL,分裝高壓蒸氣滅菌后待用;PTC溶液的配制:分別準(zhǔn)確稱取70 g PEG-4000,0.22 g無水CaCl2,KCl溶液溶解并定容至200 mL;溶壁酶混合液:分別稱取0.6 g溶菌酶,0.6 g蝸牛酶,1.2 g纖維素酶,分別溶于30 mL KCl 緩沖液中,分別用 0.22 μm的無機微孔膜過濾,4 ℃保存,使用時按纖維素酶∶溶菌酶∶蝸牛酶=2∶1∶1 混合。

1.2.2菌種培養(yǎng)菌種的活化、種子培養(yǎng)及搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)均參照文獻[6]的方法進行。

1.2.3蝦青素含量的測定紫外分光光度測定法[13]。

1.2.4菌體生物量的測定取5 mL菌懸液,5000 r/min離心10 min,棄上清,菌體用去離子水洗兩次,在烘箱中于105 ℃烘至恒重,然后稱重。

1.3實驗方法

1.3.1復(fù)合誘變育種將對數(shù)期的出發(fā)菌株菌液用無菌生理鹽水稀釋到106個/mL,參照文獻[6]的誘變方法分別進行UV-LiCl復(fù)合誘變和60Co-γ射線誘變處理,篩選平板中加入40 μmol/L二苯胺進行抗性篩選。

1.3.2原生質(zhì)體的制備見參考文獻[12]。

1.3.3原生質(zhì)體形成率和再生率的測定見參考文獻[14]。

1.3.4原生質(zhì)體融合與再生見參考文獻[12]。

1.3.5融合子的篩選將融合菌株分別劃線于含40 μmol/L濃度二苯胺的YM選擇性培養(yǎng)基平板上,22 ℃培養(yǎng)后觀察平板上菌落的生長情況,從長出的菌落中選出顏色較紅,半徑較大的,蝦青素產(chǎn)量相對高的幾株融合菌株。

1.3.6遞歸融合將篩選出的蝦青素產(chǎn)量相對高的幾株融合菌株繼續(xù)進行步驟1.3.2至1.3.5的操作,將每輪融合菌株分別劃線于含有不同濃度(80～360 μmol/L)的二苯胺的YM選擇性培養(yǎng)基平板上,篩選出蝦青素產(chǎn)量較高的融合菌株,如此循環(huán)往復(fù),進行5輪遞歸融合,最后篩選出蝦青素產(chǎn)量相對較高的幾株菌株。

1.3.7穩(wěn)定性實驗將最終篩選出蝦青素產(chǎn)量相對較高的融合菌株按10%接種量接入裝有30 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng),22±1 ℃,150 r/min,培養(yǎng)48 h,傳代5次,提取發(fā)酵液,測定蝦青素含量,最終得到蝦青素含量穩(wěn)定的融合菌株。

1.3.8高產(chǎn)融合子發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的工藝優(yōu)化影響紅法夫酵母高產(chǎn)蝦青素的因素有很多,如培養(yǎng)基的成分和配比、發(fā)酵pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、轉(zhuǎn)速、裝液量等,另有研究報道一些天然促進劑,如橙子、茶葉汁、胡蘿卜汁、番茄汁[15-16]等,在紅法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的過程中,對于提高蝦青素產(chǎn)量有著重要的作用。本實驗主要針對天然促進劑種類及各營養(yǎng)物質(zhì)的比例對發(fā)酵蝦青素的影響進行考查,設(shè)計5因素4水平正交實驗,按正交表L16(45)進行發(fā)酵實驗,測定蝦青素的產(chǎn)量。

2　結(jié)果與討論

2.1誘變育種的結(jié)果

2.1.1UV-LiCl復(fù)合誘變育種結(jié)果參考文獻[6],得到H1-2和H1-12兩株蝦青素產(chǎn)量較高的突變株,產(chǎn)量分別是(9.62±0.16)、(9.44±0.14)mg/L,將其作為第一輪原生質(zhì)體融合的親本菌株。

2.1.260Co-γ射線誘變結(jié)果P.rhodozyma02菌株經(jīng)3.5 kGy劑量的60Co-γ射線誘變篩選后,得到10個菌落大、顏色亮而紅的菌株,進行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,測定蝦青素含量和生物量。結(jié)果見表2。從表2中可以看出,突變株Co-4、Co-5和Co-9的蝦青素產(chǎn)量分別是(9.35±0.16)、(9.27±0.07)和(9.46±0.15) mg/L,分別是出發(fā)菌株P(guān). Rhodozyma 02的1.97、1.95和1.99倍。因此將Co-4、Co-5和Co-9作為第一輪原生質(zhì)體融合的親本菌株。

表1　最佳融合菌株發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交實驗因素水平Table 1　Factors and levels of fermentation conditions optimization for the best fusion strains

表2　60Co-γ射線誘變突變株的生物量和蝦青素產(chǎn)量Table 2　Biomass and astaxanthin production of mutants by 60Co-γ radiation

2.2原生質(zhì)體融合結(jié)果

2.2.1第一輪原生質(zhì)體融合結(jié)果將經(jīng)UV-LiCl和60Co-γ誘變方式篩選得到的5株突變株作為出發(fā)菌株進行第一輪的原生質(zhì)體融合,從黃色菌株中挑選生長較好的30個菌株進行搖瓶復(fù)篩,以菌株編號為橫坐標(biāo),蝦青素產(chǎn)量為縱坐標(biāo)繪圖,如圖1。最終得到6株融合子 F1-8、F1-10、F1-12、F1-17、F1-21、F1-27,蝦青素產(chǎn)量都有所提高,其中F1-17的蝦青素產(chǎn)量為(17.48±0.36) mg/L,是原始出發(fā)菌株P(guān).Rhodozyma02的3.68倍。

圖1　第一輪融合子搖瓶發(fā)酵復(fù)篩 Fig.1　The screening of the first round generation fusants of shake-flask fermentation

2.2.2第二輪原生質(zhì)體融合結(jié)果第一輪融合子F1-8、F1-10、F1-12、F1-17、F1-21、F1-27作為第二輪融合的出發(fā)菌株,進行步驟1.3.2至1.3.5的操作進行原生質(zhì)體的制備和融合,本輪抗性平板中二苯胺濃度為80 μmol/L。從篩選平板上挑選顏色深且生長較好的30個菌株進行搖瓶復(fù)篩,結(jié)果如圖2。最終得到5株融合子F2-6、F2-11、F2-25、F2-26、F2-28蝦青素產(chǎn)量都有所提高,其中F2-28的蝦青素產(chǎn)量為(26.91±0.07) mg/L,是原始出發(fā)菌株P(guān).Rhodozyma02的5.66倍。

圖2　第二輪融合子搖瓶發(fā)酵復(fù)篩Fig.2　The screening of the second round generation fusants of shake-flask fermentation

2.2.3第三輪原生質(zhì)體融合結(jié)果將第二輪得到的蝦青素產(chǎn)量較高的5株融合子作為第三輪融合的出發(fā)菌株,步驟同“2.2.2”,本輪抗性平板中二苯胺濃度為160 μmol/L。結(jié)果如圖3所示,最終得到5株融合子F3-2、F3-8、F3-12、F3-15、F3-19、蝦青素產(chǎn)量較高,其中F3-15的蝦青素產(chǎn)量為(42.09±1.08) mg/L,是原始出發(fā)菌株P(guān).Rhodozyma02的8.86倍。

圖3　第三輪融合子搖瓶發(fā)酵復(fù)篩Fig.3　The screening of the third round generation fusants of shake-flask fermentation

2.2.4第四輪原生質(zhì)體融合結(jié)果將第三輪得到的蝦青素產(chǎn)量較高的5株融合子作為第四輪融合的出發(fā)菌株,步驟同“2.2.2”,本輪抗性平板中二苯胺濃度為240 μmol/L,從篩選平板上挑選顏色深且生長較好的20個菌株進行搖瓶復(fù)篩。結(jié)果如圖4所示,最終得到4株融合子F4-4、F4-7、F4-10、F4-18蝦青素產(chǎn)量較高,其中F4-4和F4-10的蝦青素產(chǎn)量分別為(56.88±0.74)和(56.89±0.61) mg/L,是原始出發(fā)菌株P(guān).Rhodozyma02的11.98倍。

圖4　第四輪融合子搖瓶發(fā)酵復(fù)篩Fig.4　The screening of the fourth round generation fusants of shake-flask fermentation

2.2.5第五輪原生質(zhì)體融合結(jié)果將第四輪得到的蝦青素產(chǎn)量較高的4株融合子作為第四輪融合的出發(fā)菌株,步驟同“2.2.2”,本輪抗性平板中二苯胺濃度為360 μmol/L,從篩選平板上挑選顏色深且生長較好的10個菌株進行搖瓶復(fù)篩。結(jié)果如圖5所示,最終得到3株融合子F5-2、F5-5、F5-9蝦青素產(chǎn)量較高,蝦青素產(chǎn)量分別為(67.96±0.69)、(68.09±0.86)和(68.23±0.75) mg/L。

圖5　第五輪融合子搖瓶發(fā)酵復(fù)篩Fig.5　The screening of the fifth round generation fusants of shake-flask fermentation

2.3原生質(zhì)體融合子穩(wěn)定性測試結(jié)果

通過5輪原生質(zhì)體融合后得到的3株產(chǎn)量較高的菌株,進行搖瓶穩(wěn)定性遺傳實驗,考察菌株穩(wěn)定性,結(jié)果見表3。傳代5次后,發(fā)現(xiàn)F5-9具有良好的穩(wěn)定性,體積產(chǎn)量達到(68.10±0.56)mg/L,而F5-2、F5-5遺傳穩(wěn)定性較差,蝦青素體積產(chǎn)量不穩(wěn)定,所以最終得到一株穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)蝦青素的法夫酵母菌株F5-9。

表3　紅法夫酵母菌株遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 3　Inheritance stability tests of P. rhodozyma mutants

2.4融合菌株F5-9發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素工藝條件的優(yōu)化

2.4.1天然促進劑選擇了橙汁、綠茶汁、胡蘿卜汁、番茄汁作為天然促進劑添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中,各濃度均為100 ml/L,發(fā)酵結(jié)果見表4。結(jié)果表明加入橙汁和胡蘿卜汁,生物量和蝦青素的體積產(chǎn)量提高較明顯,加入番茄汁反而抑制了蝦青素的產(chǎn)量,可能是由于菌體在利用番茄汁進行生長的同時合成了其他物質(zhì),從而使蝦青素的合成受阻。從經(jīng)濟成本角度考慮,最終選擇胡蘿卜汁作為促進劑添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

表4　天然促進劑對F5-9發(fā)酵蝦青素產(chǎn)量的影響Table 4　Effect of natural promoter on astaxanthin yield of F5-9

表5　融合菌株F5-9發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交實驗結(jié)果分析Table 5　Results and analysis of fermentation conditions optimization for the F5-9 fusion strains

2.4.2正交實驗結(jié)果正交實驗結(jié)果如表5。各因素的極差R值表明,各因素對融合菌株F5-9發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響大小順序為葡萄糖>胡蘿卜汁>蛋白胨>(NH4)2SO4>酵母浸出粉。由表中k值可以確定最適培養(yǎng)基的配方為葡萄糖30.0 g/L,蛋白胨3.0 g/L,酵母浸出粉7.0 g/L,(NH4)2SO45.0 g/L,胡蘿卜汁150 mL/L。

2.4.3最優(yōu)條件下發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素在優(yōu)化后的條件下發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素,發(fā)酵溫度22±1 ℃,發(fā)酵轉(zhuǎn)速150 r/min,pH5.4,蝦青素產(chǎn)量達到最值的時間有所延長,從圖6可以看出,蝦青素體積產(chǎn)量達到最值的時間為60 h,產(chǎn)量最高達(83.39±1.03) mg/L。發(fā)酵時間由原來的48 h延長至60 h,其可能原因是培養(yǎng)基中初始碳源、氮源含量的提高,使菌體的生長時間延長,同時由于天然促進劑胡蘿卜汁的添加,進一步促進了蝦青素的合成。

圖6　發(fā)酵時間對F5-9發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響Fig.6　Effect of fermentation time on astaxanthin yield of F5-9

3　結(jié)論

基因組重排育種技術(shù)作為一種新型、快速、有效的技術(shù),其與經(jīng)典的誘變育種、原生質(zhì)體融合技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢。文獻[6]中依次經(jīng)過兩輪物理復(fù)合誘變得到的菌株產(chǎn)量為25.36 mg/L,較原始出發(fā)菌株有一定的提高,但是單純的物理誘變,會使菌株正突變率低,容易導(dǎo)致回復(fù)突變,出現(xiàn)“疲勞效應(yīng)”[17]。本文經(jīng)誘變和基因組重排最終選育出的一株高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)蝦青素的重組紅法夫酵母菌株F5-9,蝦青素產(chǎn)量達到(68.10±0.56) mg/L,是文獻[6]選育出的菌株產(chǎn)量的2.69倍,這樣做提高了同源重組的頻率,產(chǎn)生各種各樣的突變組合,從而達到快速進化菌株表型的目的,實現(xiàn)多親本的基因水平轉(zhuǎn)移、選育出的子代菌株穩(wěn)定性與安全性高。

從蝦青素生物合成途徑可知,番茄紅素、β-胡蘿卜素等是蝦青素合成的重要前體物質(zhì),自然界中許多植物中都含有較高的此類前體物質(zhì),將其添加到發(fā)酵蝦青素的培養(yǎng)基中,能在一定程度上促進蝦青素的合成,提高蝦青素的產(chǎn)量。本文從降低發(fā)酵成本考慮,最終選擇胡蘿卜汁天然促進劑添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中,并對發(fā)酵培養(yǎng)基進行參數(shù)優(yōu)化,最終培養(yǎng)基成份為:葡萄糖30.0 g/L,蛋白胨3.0 g/L,酵母浸出粉7.0 g/L,(NH4)2SO45.0 g/L,MgSO4·7H2O 2.75 g/L,KH2PO41.5 g/L,CaCl2·2H2O 0.2 g/L,胡蘿卜汁150 mL/L,得到發(fā)酵融合菌株F5-9,蝦青素的產(chǎn)量高達(83.39±1.03)mg/L。

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Screening and fermentation optimization of a high-yield-astaxanthin-producingPhaffiarhodozyma

HU Xiang-dong,PAN Ling-yan*,YE Mao,HU Wei-qing

(Zhejiang Crown Technology Co.Ltd,Hangzhou 310012,China)

Objective:To screen out a high-yield-astaxanthin-producingPhaffiarhodozymaand optimize the culture medium conditions. Method:Phaffiarhodozymastrain(P. rhodozyma 02)was used as original strain treated with UV-LiCl and60Co-γ mutagenesis respectively. Mutant strains with higher astaxanthin productivity were screened out and used as the starting strains for genome shuffling. After 5 rounds of protoplast fusion,obtained the best recombinant with further high yield of astaxanthin. The optimum culture medium conditions was obtained by adding natural promoter rich in synthetic precursor of astaxanthin to the medium and optimizing the parameter of culture medium. Result:a high-yield-astaxanthin-producing recombinant F5-9 was obtained and the optimum culture medium conditions were:glucose 30.0 g/L,peptone 3.0 g/L,yeast extract powder 7.0 g/L,(NH4)2SO45.0 g/L,MgSO4·7H2O 2.75 g/L,KH2PO4 1.5 g/L,CaCl2·2H2O 0.2 g/L,carrot juice 150 mg/L. Eventually the astaxanthin production reached at(83.39±1.03)mg/L,which was 17.56 times than the original strain. Conclusion:The traditional mutation and genome shuffling can significantly improve the yield of astaxanthin and there is room for further improvement in the yield of astaxanthin by adding natural promoter rich in synthetic precursor of astaxanthin carrot juice into culture medium.

Phaffiarhodozyma;astaxanthin;mutagenesis;genome shuffling;parameter optimization

2015-06-05

胡向東(1957-),男,碩士,主要從事微生物發(fā)酵及動物營養(yǎng)方面的研究,E-mail:hxd@zjcrown.cn。

潘玲燕(1987-),女,碩士,主要從事微生物發(fā)酵及提取方面的研究,E-mail:ply1987@126.com。

國家重點新產(chǎn)品計劃項目資助(2010GRC20064);國家發(fā)改委綠色農(nóng)用生物產(chǎn)品高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化專項資助項目(發(fā)改高技【2011】1158號)。

TS202.3

B

1002-0306(2016)05-0142-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.019