陳旭升,狄佳春,趙 亮

(江蘇省農業(yè)科學院 經濟作物研究所/農業(yè)部 長江下游棉花與油菜重點實驗室,江蘇 南京 210014)

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陸地棉低毒Bt基因對棉鈴蟲抗性的遺傳效應分析

陳旭升,狄佳春,趙 亮

(江蘇省農業(yè)科學院 經濟作物研究所/農業(yè)部 長江下游棉花與油菜重點實驗室,江蘇 南京 210014)

以Bt低毒表達的陸地棉種質系WG-20為試驗材料,與若干Bt高毒表達的抗蟲棉品系配制雜交組合,對其F1的Bt毒蛋白表達量、生物學抗蟲性進行了分析。結果顯示: Bt低毒表達性狀對高毒表達性狀表現為顯性,生物學抗蟲性也是低抗性狀對抗級性狀表現為顯性,即低毒Bt基因對高毒Bt基因表現為顯性抑制現象； Bt高毒表達材料之間雜交組合的F1則呈現Bt高毒表達,生物學抗性表達規(guī)律也是如此，即高毒Bt基因間不存在同源Bt基因表達的沉默現象。

陸地棉;低毒Bt基因;抗蟲性;遺傳效應

我國棉花的生產與消費在國計民生中的地位舉足輕重。鱗翅目害蟲一直嚴重危害棉花生產。從20世紀80年代末至90年代初,棉鈴蟲在我國主產棉區(qū)持續(xù)性大暴發(fā),給棉花生產造成了災難性的損失,僅1997年在長江流域棉區(qū)凈減產就約達10萬t,黃河流域棉區(qū)凈減產則高達152萬t,造成的經濟損失近100億元[1]。傳統(tǒng)的作物育種技術無法從根本上解決抗棉鈴蟲的難題。而自20世紀90年代以來,轉基因技術通過導入外源抗蟲基因再結合傳統(tǒng)育種技術,在棉花抗蟲育種方面取得了巨大成功。轉基因抗蟲棉除對棉鈴蟲等鱗翅目害蟲具有顯著的抑制與毒殺作用外,還可以降低棉鈴蟲等害蟲的蟲口基數,從而使棉花受棉鈴蟲的危害大大降低。同時,種植抗蟲棉,因大大減少了棉田農藥噴施,使高溫季節(jié)棉農中毒概率急劇下降,不但保護了棉田生態(tài)環(huán)境,也有效地保障了棉農在棉田作業(yè)中的生命安全[2-4]。

相關研究業(yè)已表明:轉基因抗蟲棉的抗性維系,一方面取決于Bt毒蛋白的表達劑量，另一方面取決于棉花群體的抗蟲性純度[5-6]。Bt基因低毒蛋白的表達易誘導鱗翅目昆蟲產生抗性,從而可能使棉花抗蟲性體系崩塌。因此,我國轉基因棉花品種的生產應用安全性評價,對抗蟲棉毒蛋白的表達量極為關注,并作為一個品種能否通過安全性評價的重要依據。本研究以一個高產但Bt基因低毒表達的陸地棉品系WG-20為試驗材料,將其與Bt高毒表達的抗蟲棉品系進行雜交,分析了雜交后代毒蛋白表達的遺傳效應與生物學抗蟲性,旨在為轉基因抗蟲棉的遺傳育種與生產安全應用提供參考依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

本實驗采用5個抗蟲棉種質系:WG-20、SM-14、L1138、SM037、K047，其中WG-20為Bt低毒表達親本,其余為Bt高毒表達親本。然后配制5個雜交組合:SM-14×WG-20、WG-20×L1138、SM037×WG-20、SM037×L1138、SM037×K047。

1.2試驗方法

1.2.1毒蛋白含量的測定在花蕾期,取各親本與雜交組合的頂部小真葉,對每個材料隨機取5片，然后磨樣、稱重。毒蛋白的定量測定采用Bt(Cry1Ab/Ac)ELISA試劑盒,按說明書中的方法進行。每個材料測定3次,取平均值。

1.2.2生物學抗蟲性的測定棉鈴蟲抗性鑒定在江蘇省農科院植保所進行。從棉田采集棉鈴蟲,在恒溫養(yǎng)蟲室內用人工飼料飼養(yǎng)形成標準蟲種。養(yǎng)蟲室內溫、光條件:每日光照16 h,溫度為26 ℃。試驗開始于7月13日,取羽化后室內交配2 d的棉鈴蟲蛾，用于棉田罩籠接蛾鑒定試驗:在每個罩籠中接入棉鈴蟲蛾75對,任其產卵為害；于接蛾后第10天、14天,兩次檢查記載蕾鈴總數、被害蕾鈴數、棉鈴蟲活蟲數與活蟲齡期等,每重復每品種檢查10株。

抗性評判:將各品種單次表現“高抗”的抗性值賦為4,表現“抗”的賦為3,“低抗”的賦為2,“不抗”的賦為1,累計各項次鑒定的抗性值，取平均數,得到該品種的平均抗性值(PK)。綜合評判的抗性等級根據PK值的大小來量化,其抗級評判標準為: PK≤1.5，不抗；1.53.5，高抗。

1.2.3雜交育種實踐以WG-20為親本，與高毒Bt抗蟲親本J668雜交,配制組合WG-20×J668。該雜交組合于2012年參加了江蘇省棉花區(qū)域試驗。試驗方法與結果統(tǒng)計按江蘇省區(qū)試試驗方法進行。該年度參試的雜交組合共計12個,對照為抗蟲雜交棉“泗雜3號”。全省布8個試點(大豐、東臺、東辛、灌云、六合、射陽、太倉、鹽城)。隨機區(qū)組排列,3次重復,小區(qū)面積20 m2。江蘇省農業(yè)科學院植保所進行抗棉鈴蟲、抗病性鑒定,農業(yè)部棉花品質監(jiān)督檢測測試中心檢測纖維品質。

2　結果與分析

2.1親本及其雜交F1的Bt毒蛋白表達量

前人的研究顯示,外源Bt基因在雜交后代呈簡單的顯性質量遺傳方式[7-10];但迄今未見低毒Bt基因與高毒Bt基因之間的顯隱性關系的研究報道。本研究將低毒Bt表達親本與高毒Bt表達親本雜交，以及在高毒Bt表達親本之間進行雜交,測定各親本及其雜交F1的Bt毒蛋白表達量，將測定結果列于表1。由表1可見:親本WG-20屬于Bt低毒表達,毒蛋白平均值為88.8 ng/g；其余親本SM-14、L1138、SM037和K047為Bt高毒表達,它們的毒蛋白表達量分別為1997.5、520.4、1348.7、1928.4 ng/g。

從表1還可以看出:(1)以低毒Bt表達親本WG-20所配的3個雜交組合SM-14×WG-20、WG-20×L1138、SM037×WG-20,不管WG-20作為父本還是母本,其F1均為Bt低毒表達。其中雜交組合SM-14×WG-20 F1的Bt毒蛋白表達量為245.2 ng/g,只有高毒親本表達量的12.3%、中親值的23.5%。組合WG-20×L1138 F1的Bt毒蛋白表達量為154.1 ng/g,只有高毒親本表達量的29.6%、中親值的50.6%。組合SM037×WG-20 F1的Bt毒蛋白表達量為191.2 ng/g,只有高毒親本表達量的14.2%、中親值的26.6%。以上結果表明低毒Bt對高毒Bt的表達在遺傳上呈現顯性抑制效應；(2)高毒Bt親本間的2個雜交組合,其F1均呈現Bt毒蛋白的高表達，其中組合SM037×K047 F1的Bt毒蛋白表達量為1826.6 ng/g,為高毒親本表達量的94.7%、中親值的111.5%。組合SM037×L1138 F1的Bt毒蛋白表達量為1318.0 ng/g,為高毒親本表達量的97.7%、中親值的141.0%。以上結果表明高毒Bt基因間的表達在遺傳上并不存在同源Bt基因間的抑制效應。

表1　親本與雜交F1葉片樣品的Bt毒蛋白表達量 ng/g

2.2親本及其雜交F1的生物學抗蟲性表現

由于棉鈴蟲的為害主要在棉花蕾鈴期,因此Bt抗蟲棉在蕾鈴期對棉鈴蟲的抗性顯得尤為重要。蕾鈴期的生物學抗蟲性鑒定采用田間罩籠接蛾法,將試驗結果列于表2。由表2可見:以低抗親本WG-20與抗性親本SM-14、L1138、SM037雜交,其雜交F1的生物學抗蟲性均表現為低抗;而抗性親本SM037與抗性親本L1138、K047雜交,其F1的生物學抗蟲性則均表現為抗;而常規(guī)棉對照蘇棉9號對棉鈴蟲的抗性為“感”。以上結果表明: Bt低抗性狀對抗級性狀的表達表現為顯性抑制效應;而在Bt抗級性狀間則不存在同源Bt基因的抗性沉默效應,其雜交F1仍表現為抗級。

表2　抗蟲親本及其雜交F1在蕾鈴期的生物學抗蟲性

注:在綜合抗性級別欄中，HR代表高抗, R代表抗,LR代表低抗,S代表感或不抗。

2.3雜交育種實踐驗證結果

以大鈴高衣分陸地棉種質系WG-20為親本,與高毒Bt抗蟲親本J668配制雜交棉組合:WG-20×J668。該組合參加了2012年的江蘇省雜交棉區(qū)域試驗。

試驗結果:該雜交棉生育期130 d。株形緊湊,株高113.2 cm,果枝較長、平展,莖稈粗壯,茸毛較少,葉片較大,葉色較深,果枝始節(jié)位6.9節(jié),單株結鈴數29.1個,鈴卵圓形,單鈴重6.5 g,衣分40.7%,子指11.4 g,霜前花率88.0%,僵瓣率10.1%。出苗好,長勢較強,吐絮暢。在病圃接種鑒定中表現為耐枯萎病和耐黃萎病(枯萎病病指16.2,黃萎病病指33.1)。在纖維品質測試中， HVICC纖維上半部平均長度為30.6 mm,斷裂比強度32.7 cN/tex,馬克隆值5.3,斷裂伸長率5.6%,反射率78.1%,黃色深度7.2,整齊度指數86.2%,紡紗均勻性指數154。籽棉和皮棉產量分別為3807.0、1552.5 kg/hm2,分別比對照泗雜3號增產9.1%、4.3%,增產幅度均達極顯著水平,居12個參試組合的第2位。在生物學抗蟲性鑒定中，該雜交棉平均抗性值PK為2.08,表現為低抗。

試驗結論:該雜交棉籽棉、皮棉產量高,鈴大、衣分高,纖維品質較好;但因其生物學抗蟲性檢測結果為低抗棉鈴蟲,基于抗蟲棉生產應用安全性的考量，決定將其淘汰,不再進入下一輪區(qū)試。

3　討論

對于轉Bt基因抗蟲棉,國內外已有很多研究報道;但不同抗蟲棉的Bt基因是否可能存在同源基因表達的抑制現象;不同轉基因事件之間的同源Bt基因序列重復是否會引起基因沉默,這些問題尚存爭議。有研究者認為在同一個體中,如果同時存在多個同源的外源基因,不管是轉化后再次得到的,還是通過有性雜交獲得的,這些外源基因的表達都會受到抑制[11-12]。也有研究者認為情況并非如此,外源基因的表達具有劑量與累加效應:單拷貝插入的高表達株間相互雜交,其F1代的轉基因活性與雙親相當,在F2代分離群體中,各單株的轉基因活性隨拷貝數多少而呈疊加性效應[13-14]。唐燦明等(1997)[7]曾利用3個抗蟲親本配制雜交組合，其雜交F1的抗蟲性與親本類似,表明抗蟲基因在雜合狀態(tài)下無共抑制現象存在。

本研究涉及1個低毒Bt基因,研究顯示WG-20中的低毒Bt基因在F1呈顯性表達,毒蛋白含量低,即低毒Bt基因對高毒Bt基因的表達具有顯性抑制效應。由此可見,前人有關同源Bt基因之間沉默效應的報道,是否可能是某些低毒表達轉化事件對高毒表達轉化事件產生的顯性抑制效應,從而在表型上表現為同源Bt基因的抑制或基因沉默效應,這個問題值得進一步甄別澄清。也許所謂某些同源Bt基因之間的表觀沉默效應,可能只是由Bt低毒表達基因對高毒表達基因的顯性抑制效應所致。這就提示我們:在轉基因過程中,對獲得的低劑量表達轉化事件要及時予以剔除;否則很容易對后續(xù)的高表達轉化事件基因產生顯性抑制作用,在表觀上呈現所謂的基因沉默效應。

本研究使用的親本WG-20,雖然Bt毒蛋白為低毒表達,但其綜合農藝性狀優(yōu)良,并具有大鈴、高衣分特點(平均單鈴重達6.31 g,衣分高達44.3%),因此常被我們用做雜交育種親本。然而,低毒抗蟲棉的Bt基因由于在雜交后代呈顯性表達,在育種上是一個很不利的性狀。因此當利用某些低毒Bt基因的優(yōu)良種質系作為雜交親本時,建議在大田不治蟲條件下對其雜交分離群體進行抗蟲性篩選,將不抗蟲或抗蟲性差的材料在大田及時淘汰,這樣可以防止低毒Bt基因的不經意擴散,而將抗蟲性強的轉基因材料保留下來，從而有效保障創(chuàng)制的抗蟲棉新種質具有高效的抗蟲性與育成抗蟲棉的生產應用安全。

[1] 何忠偉,周文新,陳艷芬,等.中國轉基因抗蟲棉發(fā)展的現狀與對策[J].科技和產業(yè),2004,4(11):27-30.

[2] 陳旭升,狄佳春,劉劍光,等.轉基因棉花育種進展及其產業(yè)化前景分析[J].中國農學通報,2002(2):72-74.

[3] 郭三堆,王遠,孫國清,等.中國轉基因棉花研發(fā)應用二十年[J].中國農業(yè)科學,2015,48(17):3372-3387.

[4] 戴茂華,劉麗英,鄭書宏,等.河北省轉基因抗蟲棉遺傳改良成效分析[J].江西農業(yè)學報,2015,27(1):1-5.

[5] 陳旭升,狄佳春,宋錦花,等.抗蟲棉群體Npt-Ⅱ標記基因純度與其抗蟲性強度的相關分析[J].棉花學報,2004,16(3):137-141.

[6] 陳旭升,狄佳春,許乃銀,等.轉基因抗蟲棉育種及良種繁育技術研究進展[J].江西農業(yè)學報,2007,19(3):14-16.

[7] 唐燦明,朱協飛,張?zhí)煺?等.轉Bt基因抗蟲棉R19品系的棉鈴蟲抗性表現及抗蟲性遺傳研究[J].農業(yè)生物技術學報,1997,5(2):194-200.

[8] 李汝忠,沈法富,王宗文,等.轉Bt基因抗蟲棉抗蟲性遺傳研究[J].棉花學報,2001,13(5):268-272.

[9] 袁小玲,唐燦明,張?zhí)煺?轉Bt+CpTI雙價基因抗蟲棉棉鈴蟲抗性的遺傳分析[J].棉花學報，2001,13(6):342-345.

[10] Bakhsh A, Rao A Q, Shahid A A, et al. CaMV35S is a developmental promoter being temporal and spatial in expression pattern of insecticidal genes (Cry1Ac & Cry2A) in cotton [J]. Aust J Basic Appl Sci, 2010(4): 37-44.

[11] Flavell R B. Inativation of gene expression in plant as consequence of specific sequence duplication [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 3490-3491.

[12] 郭旺珍,孫敬,郭玉芳,等.轉基因抗蟲棉Bt基因不同劑量的聚合與抗蟲性表現[J].遺傳學報,2001,28(7):668-676.

[13] Hobbs S L A, Warkentin T D, DeLong C M O. The effect of T-DNA copy number, position and methylation on reporter gene expression in tobacco transformation [J]. Plant Mo1 Biol, 1990, 5: 851-864.

[14] Hobbs S L A, Warkentin T D, DeLong C M O. Transgene copy number can be positively or negatively associated with transgene expression [J]. Plant Mol Biol, 1993, 21: 17-26.

(責任編輯:黃榮華)

Genetic Effect Analysis of Resistance of An Upland Cotton with Low-toxic Bt Gene to Cotton Bollworm

CHEN Xu-sheng, DI Jia-chun, ZHAO Liang

(Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Cotton and Rape in Lower Reaches of Yangtze River, Ministry of Agriculture, Nanjing 210014, China)

In this study, the upland cotton germplasm WG-20 with low-toxic Bt gene was used as experimental material. Several hybrid combinations were made by crossing between WG-20 and some high-toxic-Bt insect-resistant cotton strains. The expression level of Bt toxalbumin, and the biological insect-resistance in F1were analyzed. The results showed that the expression character of low-toxic Bt was dominant to that of high-toxic Bt, and the character of low insect-resistance was also dominant to that of high insect-resistance, namely the expression of low-toxic Bt gene dominantly inhibited to the expression of high-toxic Bt gene. The expression of high-toxic Bt gene was found in the F1of hybrid combinations from high-toxic Bt cotton strains, and so was the expression of biological insect-resistance, namely the silent expression of homologous Bt gene did not exist among high-toxic Bt genes.

Upland cotton; Low-toxic Bt gene; Insect resistance; Genetic effect

2016-03-07

高產轉基因棉花新品種培育科技重大專項子課題(2014ZX08005-001);轉基因生物新品種培育重大專項子課題(2016ZX08005-005)。

陳旭升(1965─),男,浙江樂清人,研究員,博士,主要從事棉花抗病蟲遺傳育種工作。

S435.622.9

A

1001-8581(2016)08-0001-04