于清華, 李俊明,, 趙硯瑾, 劉意林 , 江發(fā)龍, 李庶心*,

(1. 江西中醫(yī)藥大學　研究生部,江西 南昌　330006; 2. 軍事醫(yī)學科學院 放射與輻射醫(yī)學研究所,北京　100850)

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·研究論文·

新型苯甲酰胺類HDAC抑制劑的合成及其抗腫瘤活性

于清華1, 李俊明1,2, 趙硯瑾2, 劉意林1, 江發(fā)龍1, 李庶心1*,

(1. 江西中醫(yī)藥大學研究生部,江西 南昌330006; 2. 軍事醫(yī)學科學院 放射與輻射醫(yī)學研究所,北京100850)

以MS-275為先導化合物,設計并合成了7個新型苯甲酰胺類化合物(6a～6c, 14a, 14b, 15a和18)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和ESI-MS表征。采用MTT法測定了6a～6c, 14a, 14b, 15a和18對人急性白血病細胞(HL60)和人乳腺癌細胞(MCF-7)的體外抗腫瘤細胞增殖活性。結(jié)果表明：N-(2-氨基苯)-3-[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-氨基]己酰胺(6a),N-(2-氨基苯)-4-【3-{4-[(二乙胺基)甲基]苯基}丙烯?！勘郊柞０?14a)和N-(2-氨基苯)-4-[3-(吡啶-3-基)丙烯酰]丙酰胺(18)的抑制活性較好，其GI50依次為5.72 μmol·L-1, 6.91 μmol·L-1, 7.11 μmol·L-1和3.46 μmol·L-1, 4.12 μmol·L-1, 3.97 μmol·L-1,優(yōu)于MS-275(7.88 μmol·L-1和4.49 μmol·L-1)。

MS-275; 苯甲酰胺; 組蛋白去乙?；敢种苿? 合成; 抗腫瘤活性

近年來，組蛋白去乙?；?HDAC)已成為治療癌癥最熱門和最有效的靶標之一。HDAC抑制劑作為一類新型的抗腫瘤藥物，可通過誘導腫瘤細胞生長停滯、分化或凋亡，從而達到抑制腫瘤細胞增殖的效果,且對正常細胞作用毒性較低[1-3]。目前，HDAC類抑制劑品種較少，生產(chǎn)技術(shù)大多被國外機構(gòu)壟斷，價格較高。因此，研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型HDAC 抑制劑具有較大的實際意義[4-6]。

Mitsui Chemicals公司開發(fā)的苯甲酰胺類化合物物MS-275【化學名為N-【【4{[( 2-氨基苯基) 氨基]甲酰}苯基】甲基】氨基甲酸-3-吡啶基甲基酯, Chart 1】是首個被證明在動物體內(nèi)具有口服抗癌活性的低毒HDAC抑制劑，雖然該藥目前在美國已進入白血病、晚期淋巴癌及實體瘤的Ⅱ 期臨床研究階段，但仍然存在選擇性較低，毒性較大，不良反應較多等缺點[7-10]。

Scheme 1

本文在課題組前期研究的基礎上，根據(jù)苯甲酰胺類HDAC 抑制劑的結(jié)構(gòu)特點，在保留“連接區(qū)”的剛?cè)嵝越Y(jié)構(gòu)特征的同時，通過在表明識別區(qū)引入吡嗪環(huán)，利用“插烯規(guī)律”改變連接區(qū)長度，考察延長連接區(qū)長度對抗腫瘤活性的影響。此外，還通過修飾酶抑制區(qū)結(jié)合基團，以期提高抗腫瘤活性。以MS-275為先導化合物,設計并合成了7個新型苯甲酰胺類化合物(6a～6c, 14a, 14b, 15a和18, Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和ESI-MS表征。采用MTT法測定了6a～6c, 14a, 14b, 15a和18對人急性白血病細胞(HL60)和人乳腺癌細胞(MCF-7)的體外抗腫瘤細胞增殖活性。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

RY-1型熔點儀(溫度未校正)；JNM-ECA-400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標);Q-TOF型質(zhì)譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2合成

(1) 2a～2c的合成(以2c為例)

在單口瓶中加入甲基異硫脲硫酸鹽5.3 g和1 mol·L-1NaOH溶液20 mL,攪拌使其溶解；冰浴下緩慢滴加6-氨己酸(1c)5 g，滴畢，攪拌下于室溫反應過夜。析出白色固體，過濾，濾餅干燥得白色固體6-胍基己酸(2c)6 g，收率75%, m.p.>250 ℃。

用類似的方法合成白色固體2a, 2b，收率74.3%, 76.3%, m.p.>250 ℃。

(2) 3,3-二甲基氨基-1-吡啶-3-基-丙烯酮(4)的合成

在反應瓶中加入3-乙酰吡啶(3)20 g和DMF 50 mL，攪拌使其溶解；滴加DMA 50 mL，滴畢，于110 ℃反應3 h(薄層層析檢測)。減壓回收DMF，殘余物置于冰箱中過夜，析出黃色固體，抽濾，濾餅用混合溶劑[V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶1]洗滌得黃色固體4 22 g，收率75.9%, m.p.75～78 ℃。

(3) 5a～5c的合成(以5c為例)

在單口瓶中加入2c 4 g, 4 4 g, K2CO34 g和無水異丙醇100 mL，攪拌使其溶解；回流反應48 h。冷卻至室溫，濾除不溶物，濾液減壓蒸除溶劑，殘余物用水(15 mL)溶解，用濃鹽酸調(diào)至pH 4～5，析出大量白色固體，抽濾得白色固體6-[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-氨基]己酸(5c)1.6 g，收率26.2%, m.p.>250 ℃。

用類似的方法合成白色固體5a和5b。

(4) 6a～6c的合成(以6c為例)

氮氣保護下，在三口瓶中加入5c 0.38 g, EDCl 0.23 g和無水THF 20 mL，攪拌使其溶解；加入鄰苯二胺0.2 g，冰浴下滴加三乙胺0.12 g，攪拌10 min，于室溫反應過夜(TCL檢測)。減壓回收溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑A:V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)=10 ∶1]純化后濃縮，殘余物析晶得淡灰色固體N-(2-氨基苯)-6-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-氨基)己酰胺(6c)0.12 g，收率55.6%, m.p.167～174 ℃。

用類似的方法合成淡灰色固體N-(2-氨基苯)-3-[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-氨基]己酰胺(6a)，收率81.6%, m.p.160～164 ℃和淡灰色固體N-(2-氨基苯)-4-[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-氨基]己酰胺(6b)，收率78.3%, m.p.163～168 ℃。

6a:1H NMRδ: 2.587(m, 2H), 3.666(s, 2H), 4.860(s, 2H), 6.519(t,J=3.7 Hz, 1H), 6.702(d,J=3.6 Hz, 1H), 6.886(t,J=4.5 Hz, 1H), 7.154(d,J=3.6 Hz, 1H), 7.257(d,J=2.6 Hz, 1H), 7.389(t,J=2.6 Hz, 1H), 7.550(q,J=3.2 Hz, 1H), 8.425(m, 2H), 8.695(m, 1H), 9.157(s, 1H), 9.299(m, 1H); ESI-MSm/z: 334{[M+H]+}。

6b:1H NMRδ: 1.903(d,J=6.2 Hz, 2H), 2.412(t,J=7.2 Hz, 2H), 3.424(s, 2H), 4.841(s, 2H), 6.522(m,J=7.4 Hz, 1H), 6.708(m, 1H), 6.883(m, 1H), 7.187(m, 2H), 7.390(t,J=6.9 Hz, 1H), 7.517(t,J=7.6 Hz, 1H), 8.415(m, 2H), 8.687(m, 1H), 9.119(s, 1H), 9.275(s, 1H); ESI-MSm/z: 348{[M+H]+}。

6c:1H NMRδ: 2.587(m, 2H), 3.666(s, 2H), 4.860(s, 2H), 6.519(t,J=3.2 Hz, 1H), 6.702(d,J=3.6 Hz, 1H), 6.886(t,J=3.6 Hz, 1H), 7.154(d,J=3.6 Hz, 1H), 7.257(d,J=2.6 Hz, 1H), 7.389(t,J=2.3 Hz, 1H), 7.550(q,J=3.2 Hz, 1H), 8.425(m, 2H), 8.695(m, 1H), 9.157(s, 1H), 9.299(m, 1H); ESI-MSm/z: 376{[M+H]+}。

(5) 對甲基苯丙烯酸乙酯(8)的合成

攪拌下，在反應瓶中加入對甲基苯甲醛12 g，丙二酸15 g和吡啶8 g，回流反應4 h。冷卻至室溫，過濾，濾餅用冰水(2×30 mL)洗滌，干燥得4-甲基苯丙烯酸粗品7 15 g，不需純化，直接投入下步反應。

在單口瓶中加入7 10 g，無水乙醇80 mL和氯化亞砜10 mL，回流反應3 h。減壓蒸除溶劑得淡黃色油狀液體8 12 g，收率61.9%。

(6) 二乙胺甲基苯丙烯酸乙酯(10)的合成

在三口瓶中加入8 10 g, NBS 9.8 g,無水四氯化碳80 mL和催化量過氧化苯甲酰(BPO)，回流反應6 h。過濾，濾液減壓蒸除溶劑，殘余物用乙酸乙酯溶解，依次用水(2×50 mL)，飽和食鹽水(50 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥得淡黃色油狀液體4-溴甲基苯丙烯酸乙酯(9)15 g，不需純化，直接投入下步反應。

在單口瓶中加入二乙胺乙醇8 mL和二氯甲烷60 mL，冰浴下滴加9 14 g的二氯甲烷(10 mL)溶液,滴畢，于室溫反應3 h。加入飽和碳酸鈉溶液50 mL，分液，水相用二氯甲烷(3×50 mL)萃取，合并有機相，用飽和食鹽水(2×50 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸除溶劑得淡黃色膏狀固體10 12 g，收率71.4%。

(7) 4-二乙胺甲基苯丙烯酸(11)的合成

在單口瓶中加入10 10 g, 3 mol·L-1NaOH溶液40 mL和THF 20 mL，于45 ℃反應3 h。減壓蒸除THF，殘余物用稀鹽酸調(diào)至pH 7，析出白色固體，過濾，濾餅依次用水(3×50 mL)和乙醇(50 mL)洗滌，干燥得淡黃色固體11 5.2 g，收率79.2%, m.p.>250 ℃。

(8) 13a～13c的合成(以13a為例)

在單口瓶中加入11 5 g, CDI 5.2 g和THF 60 mL，于45 ℃反應16 h(TLC檢測)。冷卻得反應液A。

在三口瓶中加入對氨基苯甲酸(12a)2.9 g和2 mol·L-1NaOH溶液10 mL，攪拌使其溶解；倒入A中，于室溫反應12 h。減壓蒸除溶劑，用稀鹽酸調(diào)至pH 7,抽濾，濾餅用乙醇(2×20 mL)洗滌，干燥得灰白色固體4-【3-{4-[(二乙胺基)甲基]苯基}丙烯?！勘郊姿?13a)2.2 g，收率23.9%, m.p.>250 ℃。

用類似的方法合成灰白色固體13b 2.3 g，收率31.2%, m.p.>250 ℃,灰白色固體13c 6.1 g，收率49.2%, m.p.>250 ℃。

(9) 14a～14b的合成(以14a為例)

在單口瓶中加入13a 2 g, CDI 1.4 g和THF 60 mL，于45 ℃反應14 h(TLC檢測)。冷卻得反應液B。

在三口瓶中加入鄰苯二胺0.6 g和THF 10 mL，攪拌使其溶解；加入三氟乙酸1.3 g，攪拌5 min后加入B中，于45 ℃反應12 h。減壓蒸除大部分有機溶劑，用碳酸氫鈉調(diào)至pH 8～9,加入乙酸乙酯80 mL，分液，水相用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾餅經(jīng)硅膠柱層析(梯度洗脫劑:A=10 ∶1～1 ∶1)純化得灰色固體N-(2-氨基苯)-4-【3-{4-[(二乙胺基)甲基]苯基}丙烯?！勘郊柞０?4a 0.27 g，收率10.4%, m.p. 234～238 ℃。

用類似的方法合成灰白色固體N-(2-氨基苯)-4-【3-{4-[(二乙胺基)甲基]苯基}丙烯?！勘郊柞０?14b)，收率9.2%, m.p.227～232 ℃。

(10) 4-【3-{4-[(二胺乙基)甲基]苯基}丙烯】異羥肟酸(15a)的合成

在錐形瓶中加入鹽酸羥胺0.1 mol和無水甲醇100 mL，冰浴下分3批加入KOH 0.1 mol，攪拌30 min；靜置1 h，過濾得濾液C。

在三口瓶中加入13a的甲酯鹽酸鹽1.0 g和甲醇20 mL，攪拌使其溶解；加入KOH 0.14 g，攪拌5 min；滴加C 2.5 mL，滴畢，于室溫反應12 h。減壓蒸除大部分有機溶劑，殘余物用混合溶劑[V(乙醇) ∶V(乙酯)=1 ∶1]10 mL溶解，通入干燥HCl，過濾，濾液蒸干后用甲醇重結(jié)晶得淡黃色固體15a 0.12 g，收率11.5%, m.p.>250 ℃。

(11) 3-吡啶丙烯酰氯(16)的合成

在單口瓶中加入3-吡啶丙烯酸10 g和氯化亞砜80 mL，回流反應3 h。減壓蒸除氯化亞砜得灰白色固體16 11 g,收率98.2%, m.p.>250 ℃。

(12) 4-[3-(吡啶-3-基)丙烯酰]丁酸(17)的合成

在反應瓶中加入4-氨基丁酸2 g和DMF 50 mL，攪拌使其溶解；加入三乙胺6 g，冰浴下分3批加入16 4 g，加畢，反應30 min；于室溫反應6 h(TLC檢測)。劇烈攪拌下，將反應液倒入冰水中，析出白色固體，抽濾，濾餅用混合溶劑[V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶1]洗滌得黃色固體17 3.1 g,收率55.4%, m.p.248～251 ℃。

(13)N-(2-氨基苯)-4-[3-(吡啶-3-基)丙烯酰]丙酰胺(18)的合成

氮氣保護下，在三口瓶中加入16 1.0 g,鄰苯二胺0.5 g, EDCl 0.9 g和無水THF 30 mL，攪拌使其溶解；冰浴下滴加三乙胺1.1 g，攪拌10 min，于室溫反應過夜(TLC檢測)。減壓回收溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A)純化后濃縮，殘余物析晶得灰白色固體18 0.42 g，收率30.4%, m.p.184～186 ℃。

14a:1H NMRδ: 0.984(m, 6H), 2.501(m, 4H), 3.318(s, 2H), 6.836(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.167(s, 1H), 7.398(d,J=3.8 Hz, 2H), 7.621(t,J=7.6 Hz, 3H), 7.684(d,J=7.4 Hz, 1H), 7.859(dd,J=4.4 Hz, 11.2 Hz, 2H), 7.936(s, 2H), 8.237(s, 1H), 10.652(s, 1H) ; ESI-MSm/z: 526{[M+H]+}。

14b:1H NMRδ: 0.980(s, 6H), 2.500(s, 4H), 4.260(d,J=3.6 Hz, 2H), 5.250(s, 2H), 3.547(s, 2H), 4.480(d,J=4.0 Hz, 2H), 4.880(s, 2H), 6.680(m, 3H), 6.970(t,J=2.6 Hz, 1H), 7.165(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.455(m, 7H), 7.950(d,J=4.0 Hz, 2H); ESI-MSm/z: 560{[M+H]+}。

15:1H NMRδ: 1.260(m, 3H), 3.030(d,J=4.0 Hz, 2H), 4.315(d,J=4.0 Hz, 1H), 7.045(m, 1H) , 7.760(m, 5H), 10.835(m, 1H), 11.180(m, 1H); ESI-MSm/z: 451{[M+H]+}。

18:1H NMRδ: 1.804(m, 2H), 2.366(t,J=3.6 Hz, 2H), 3.256(m, 2H), 6.527(t,J=9.5 Hz, 1H), 6.728(d,J=10.4 Hz, 1H), 6.888(t,J=4.6 Hz, 1H), 7.157(d,J=3.8 Hz, 1H), 7.433(d,J=1.2 Hz, 2H), 7.939(d,J=4.0 Hz, 1H), 8.247(m, 1H), 8.552(d,J=2.4 Hz, 1H), 8.759(s, 1H), 9.101(s, 1H); ESI-MSm/z: 522{[M+H]+}。

1.3體外抗腫瘤增殖活性測試

以MS-275 為陽性對照物，采用MTT法測定了6a～6c, 14a, 14b, 15a和18對人急性白血病細胞(HL60)和人乳腺癌細胞(MCF-7)的體外抗腫瘤細胞增殖活性。取對數(shù)生長期的細胞制成細胞懸液，以2～4×104個/mL的細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔180 μL。于37 ℃, 5%CO2的溫箱中孵育24 h。將待測化合物加入96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。將MTT溶液5 mg·mL-1加入96孔板中，每孔20 μL，于37 ℃溫育4 h。吸出上清液，每孔加入DMSO 200 μL，用平板搖床搖勻，用自動分光光度計讀取波長490 nm處吸光度值A490，計算待測化合物的半數(shù)增殖抑制濃度(GI50)。

2　結(jié)果與討論

2.1體外抗腫瘤增殖活性

表1為6a～6c, 14a, 14b, 15a和18對HL60和MCF-7的體外抗腫瘤細胞增殖活性。

表1　化合物對腫瘤細胞的抑制活性

由表1可見，6a, 14a和18的抑制活性較好，其GI50依次為5.72 μmol·L-1, 6.91 μmol·L-1, 7.11 μmol·L-1和3.46 μmol·L-1, 4.12 μmol·L-1, 3.97 μmol·L-1,優(yōu)于MS-275(7.88 μmol·L-1和4.49 μmol·L-1)。其可能原因為：在酶結(jié)合區(qū)引入吡嗪環(huán)和碳碳雙鍵在一定程度上增加了化合物對腫瘤細胞的抑制活性；在酶抑制區(qū)引入異羥肟酸結(jié)構(gòu)和延長連接區(qū)脂肪鏈長度均不利于提高抑制活性。

以MS-275為先導化合物,設計并合成了7個新型苯甲酰胺類化合物(6a～6c, 14a, 14b, 15a和18)?？鼓[瘤活性測試結(jié)果表明：N-(2-氨基苯)-3-[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-氨基]己酰胺(6a),N-(2-氨基苯)-4-【3-{4-[(二乙胺基)甲基]苯基}丙烯酰】苯甲酰胺(14a)和N-(2-氨基苯)-4-[3-(吡啶-3-基)丙烯酰]丙酰胺(18)的抑制活性較好，其GI50依次為：5.72 μmol·L-1, 6.91 μmol·L-1, 7.11 μmol·L-1和3.46 μmol·L-1, 4.12 μmol·L-1, 3.97 μmol·L-1,優(yōu)于MS-275(7.88 μmol·L-1和4.49 μmol·L-1)。本研究對優(yōu)化苯甲酰類抗腫瘤藥物結(jié)構(gòu)有一定借鑒意義。

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Synthesis and Antitumor Activities of Benzamide Histone Deacetylase Inhibitors

YU Qing-hua1,LI Jun-ming1,2,ZHAO Yan-jin2,LIU Yi-lin1,JIANG Fa-long1,LI Shu-xin1*

(1. Department of Postgraduate， Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330006， China；2. Institute of Radiation and Irradiation Medicine， Academy of Military Medical Science， Beijing 100850， China)

Seven novel benzamide compounds(6a～6c, 14a, 14b, 15a and 18) were designed and synthesized using MS-275 as the leading compound. The structures were characterized by1H NMR and ESI-MS. Theinvitroantitumor activities of 6a～6c, 14a, 14b, 15a and 18 against human acute leukemia cells(HL60) and human breast cancer cells(MCF-7) were investigated by MTT method. The results indicated that 6a, 14a and 18 showed good inhibition activities with GI50of 5.72 μmol·L-1, 6.91 μmol·L-1, 7.11 μmol·L-1and 3.46 μmol·L-1, 4.12 μmol·L-1, 3.97 μmol·L-1, better than MS-275(7.88 μmol·L-1and 4.49 μmol·L-1).

MS-275; benzamide; histone deacetylase inhibitor; synthesis; antitumor activity

2015-09-15;

2016-05-31

國家自然科學基金資助項目(30772628)

于清華(1990-)，男，漢族，山東威海人，碩士研究生，主要從事藥物分子的設計與合成研究。

通信聯(lián)系人： 李庶心，研究員， E-mail: lisx28@163.com

O625.6; O626.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.08.15306