成業(yè)，　陳頌，　王曉玉，　熊思藝，　符林春

（廣州中醫(yī)藥大學熱帶醫(yī)學研究所，廣東廣州　510405）

·中藥藥理·

淫羊藿、巴戟天中藥提取物對恒河猴M0、M1型單核衍生巨噬細胞基因表達的影響

成業(yè)，陳頌，王曉玉，熊思藝，符林春

（廣州中醫(yī)藥大學熱帶醫(yī)學研究所，廣東廣州510405）

【目的】探討中藥淫羊藿、巴戟天提取物（中藥注射液喘可治的組成）對恒河猴單核衍生的巨噬細胞在未極化（M0）、M1極化條件下基因表達的影響，分析其可能的免疫調(diào)節(jié)的作用機制?！痉椒ā坎捎妹芏忍荻入x心法分離中國恒河猴外周血單個核細胞（PBMCs），采用貼壁法純化出單核細胞，并以粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激5 d以使單核細胞分化成巨噬細胞；然后不加入極化因子（M0）或以干擾素γ（IFN-γ，繼續(xù)培養(yǎng)2 d）誘導巨噬細胞極化為M1表型，同時分別加入淫羊藿、巴戟天提取物進行干預；然后提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄后，采用實時熒光定量PCR檢測CCR5、CD4、CTLA-4、FoxP3、IDO、IL-10、TGF-β等基因表達量。【結(jié)果】與空白對照組比較，加入巴戟天提取物培養(yǎng)的M0巨噬細胞基因表達上調(diào)不明顯；經(jīng)淫羊藿提取物培養(yǎng)的M0巨噬細胞，CCR5基因表達量上調(diào)4.21倍，TGF-β上調(diào)7.66倍，F(xiàn)oxP3、IL-10輕度上調(diào)，而CD4、CTLA-4、IDO等基因表達改變倍數(shù)無明顯變化。經(jīng)巴戟天提取物刺激的M1型巨噬細胞，CTLA-4基因表達量上調(diào)3.22倍，F(xiàn)oxP3上調(diào)3.69倍，CCR5、CD4、IL-10、IDO基因改變倍數(shù)均無明顯變化，TGF-β未測出；而由淫羊藿提取物刺激的M1型巨噬細胞，IL-10的表達量上調(diào)11.83倍，F(xiàn)oxP3上調(diào)4.55倍，IDO、CCR5、CD4、CTLA-4基因改變倍數(shù)無明顯變化，TGF-β未測出?！窘Y(jié)論】巴戟天和淫羊藿提取物培養(yǎng)能夠上調(diào)M1型巨噬細胞IL-10、FoxP3、CTLA-4等抑炎基因表達，淫羊藿提取物能夠上調(diào)M0巨噬細胞CCR5和TGF-β等基因表達，促進病原體清除和組織修復，從而發(fā)揮多效免疫調(diào)節(jié)作用。

巨噬細胞；淫羊藿；巴戟天；免疫調(diào)節(jié)；基因表達調(diào)控；恒河猴

喘可治注射液是由中藥淫羊藿和巴戟天提取物制成的中藥復方制劑，具有溫補腎陽、納氣平喘的功效。臨床上常用于支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、毛細支氣管炎等肺系疾病的治療。最近也常應用于肺癌［1］、肝癌［2］、艾滋?。?］等疾病的輔助治療，取得不錯的療效。前期研究［4-7］表明，喘可治具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，它通過影響T淋巴細胞的活化、增殖和凋亡，Th1/Th2細胞因子分泌平衡，Th17和Treg細胞平衡等多途徑影響機體免疫，發(fā)揮多效的免疫調(diào)節(jié)作用。

本實驗室前期研究［8］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)喘可治治療后，AIDS猴模型的淋巴結(jié)組織的纖維化得到緩解、被破壞的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)得到部分修復。從藥物療效的定位和細胞功能來看，推測可能與巨噬細胞密切相關。因此，本研究通過觀察喘可治中的淫羊藿、巴戟天的精制提取物對體外培養(yǎng)的單核衍生巨噬細胞基因表達的影響，探討喘可治改善淋巴結(jié)纖維化的作用機理，以及相關免疫調(diào)節(jié)功能的機制，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1實驗動物健康中國恒河猴4只，均為雄性，體質(zhì)量（9.57±1.27）kg，飼養(yǎng)于廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，使用許可證號：SYXK（粵）2015-0146。本實驗獲得廣東省靈長類動物實驗中心批準（文件編號：K09004-IACUC）。

1.2主要儀器和試劑ABI 7500型熒光定量PCR儀器（美國Applied Biosystems公司）；ABI 2720型PCR擴增儀（美國Applied Biosystems公司）；L-550型臺式低速大容量離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；MIKRO 200R高速低溫離心機（德國Hettich公司）；HealForce HF90型二氧化碳培養(yǎng)箱（香港力康生物醫(yī)療科技控股集團）。喘可治主要成分淫羊藿和巴戟天藥物提取物（主要成分分別為淫羊藿苷和巴戟天總黃酮）由廣州萬正藥業(yè)有限公司提供（批號：14102902）；重組蛋白干擾素γ（IFN-γ，美國Peprotech公司）；重組蛋白粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）（吉姆欣，華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司）；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（美國Invitrogen公司）；RNase OUT重組核酸酶抑制劑（美國Invitrogen公司）；SYBR Select Master Mix（美國Applied Biosystems公司）；Trizol Reagent（美國Invitrogen公司）；淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；本研究所用的qPCR引物引用自Hryniewicz［9］和Malnati［10］的文獻，詳見表1。

1.3密度梯度離心法分離外周血單個核細胞群（PBMCs）采集乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝猴血10 mL，用磷酸鹽緩沖液（PBS）1∶1稀釋，然后將稀釋血液緩慢倒至淋巴細胞分離液上層，使稀釋血液和淋巴細胞分離液保持明顯分界；淋巴細胞分離液和原血體積比為1∶1，550×g離心22 min。離心后吸出云霧狀PBMCs層，用20 mL PBS清洗細胞2次，每次300×g離心12 min。

1.4細胞培養(yǎng)及分組收獲細胞，用含體積分數(shù)10%胎牛血清培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，以每孔2.5×106的細胞數(shù)于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)1 h，待巨噬細胞貼壁后，用PBS洗去未貼壁細胞，加入含1.5 mL粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的培養(yǎng)液于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)5 d分化成M0型巨噬細胞。將細胞分為空白對照組、淫羊藿組和巴戟天組?？瞻讓φ战M加入1 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d，淫羊藿組和巴戟天組分別加入1 mL含淫羊藿提取物、巴戟天提取物的培養(yǎng)液培養(yǎng)M0型巨噬細胞2 d；或加入含1 mL IFN-γ培養(yǎng)2 d誘導分化成M1型巨噬細胞。其中空白對照組不加藥，淫羊藿組和巴戟天組分別加入淫羊藿提取物、巴戟天提取物與IFN-γ共同培養(yǎng)。使加入藥物的終濃度分別為GM-CSF 20 ng/mL、IFN-γ 10 ng/mL、淫羊藿提取物2 μg/ mL、巴戟天提取物2 μg/mL。

表1　各基因qPCR引物序列Table 1　Primer sequence of various genes for qPCR

1.5提取總RNA提取方法參照Trizol試劑說明書。每個培養(yǎng)孔加入100 μL焦碳酸二乙酯（DEPC）水，500 μL Trizol，充分吹打數(shù)次；吸取混合液至1.5 mL離心管中，室溫孵育5 min，加入100 μL三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，室溫靜置2～3 min，12 000×g、4℃離心15 min；吸取上層無色溶液至新的1.5 mL離心管，加入250 μL體積分數(shù)100%異丙醇，上下顛倒數(shù)次；室溫靜置10 min，12 000 ×g、4℃離心10 min，傾去上清，加入500 μL體積分數(shù)75%乙醇，短暫渦旋；再以7 500×g、4℃離心5 min，棄上清，干燥RNA小團5～10 min。加DEPC水稀釋。

1.6逆轉(zhuǎn)錄cDNA逆轉(zhuǎn)錄參照莫洛尼氏鼠白血病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV RT）說明書。每1 ng～5 μg 總RNA加入1 μL隨機引物（50 ng/μL），1μL 10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）混合物，補入DEPC水至12 μL?；旌虾笥?5℃加熱5 min，然后迅速置于冰上，短暫離心后加入 2 μL 10×RT Buffer，2 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL 0.1 mmol/L二硫代蘇糖醇（DTT），1 μL RNase OUT核酸酶抑制劑，將各組分輕輕混勻，于37℃孵育2 min；然后加入1 μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，輕輕吹打充分混勻，然后于PCR儀上25℃、10 min，37℃、50 min，70℃、15 min完成逆轉(zhuǎn)錄。

1.7實時熒光定量PCR以cDNA為模板擴增CCR5、CD4、CTLA-4、FoxP3、 IDO、IL-10、TGF-β、GAPDH基因編碼片段，每5 μL cDNA模板加入12.5 μL SYBR Select Master Mix，0.5 μL 20 nmol/L上游引物，0.5 μL 20 nmol/L下游引物，補充DEPC水至25 μL。PCR反應條件如下：50℃、2 min，95℃、10 min預變性；95℃變性15 s，60℃延伸1 min，40個循環(huán)。

1.8統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)來自于3次獨立實驗，以GAPDH為內(nèi)參基因，以空白組為對照組，ABI 7500 software V2.0.6軟件自動分析得出熒光閾值循環(huán)數(shù)（Ct值），計算2-ΔΔCt為所得改變倍數(shù)，并以均數(shù)±標準誤（±SE）表示。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)資料采用One-Way ANOVA檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，并且改變倍數(shù)＞2為有影響［11］。

2　結(jié)果

2.1巴戟天和淫羊藿提取物對M0巨噬細胞基因表達的影響表2結(jié)果顯示：與空白對照組比較，巴戟天提取物組M0巨噬細胞CCR5、CTLA-4、FoxP3、IDO、IL-10、TGF-β基因表達顯著升高（P＜0.05），但改變倍數(shù)不顯著。而淫羊藿提取物刺激M0巨噬細胞后，CCR5基因顯著增加4.21倍（P＜0.01）、TGF-β基因顯著增加7.66倍（P＜0.01），并能夠上調(diào) IL-10、FoxP3的表達（P＜0.01），CTLA-4基因與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但對改變倍數(shù)無顯著影響。

2.2巴戟天和淫羊藿提取物對M1巨噬細胞基因表達的影響表3結(jié)果顯示：與空白對照組比較，經(jīng)巴戟天提取物刺激的M1型巨噬細胞CTLA-4基因增加3.22倍（P＜0.01），F(xiàn)oxP3基因增加3.69倍（P＜0.01），CCR5、CD4、IDO基因改變差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），但改變倍數(shù)無明顯變化，TGF-β基因未測出。而由淫羊藿提取物刺激的M1型巨噬細胞IL-10基因顯著增加11.83倍（P＜0.01），F(xiàn)oxP3基因顯著增加4.55倍（P＜0.01），IDO、CCR5、CD4、CTLA-4基因改變差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），但改變倍數(shù)無顯著變化，TGF-β基因未測出。

表2　各組M0巨噬細胞炎癥基因表達的比較Table 2　Comparison of inflammatory gene expression levels of M0 macrophages in rhesus monkeys of different groups?。ā繱E，n2-ΔΔCt）

表2　各組M0巨噬細胞炎癥基因表達的比較Table 2　Comparison of inflammatory gene expression levels of M0 macrophages in rhesus monkeys of different groups?。ā繱E，n2-ΔΔCt）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對照組比較

表3　各組M1型巨噬細胞炎癥基因表達的比較Table 3　Comparison of inflammatory gene expression levels of M1 macrophages in rhesus monkeys of different groups?。ā繱E，n2-ΔΔCt）

表3　各組M1型巨噬細胞炎癥基因表達的比較Table 3　Comparison of inflammatory gene expression levels of M1 macrophages in rhesus monkeys of different groups?。ā繱E，n2-ΔΔCt）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對照組比較

組別空白對照組巴戟天組淫羊藿組N 3 3 3 CCR5 1±0 0.57±0.22①0.54±0.21①CD4 1±0 0.27±0.16②0.39±0.13②CTLA-4 1±0 3.22±0.40②1.33±0.20①FoxP3 1±0 3.69±0.22②4.55±0.66②IDO 1±0 0.37±0.18②1.70±0.23②IL-10 1±0 1.03±0.21 11.83±0.86②TGF-β ---

3　討論

巨噬細胞在炎癥、組織損傷和修復過程中有重要的作用。并且不同極化狀態(tài)的巨噬細胞的作用有很大的區(qū)別。某些類型巨噬細胞能夠分泌轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）β1、血小板衍生因子（PDGF）等細胞因子促進組織修復的過程，而某些類型巨噬細胞可產(chǎn)生白細胞介素-10（IL-10）、抵抗素樣分子（RELM）α和精氨酸酶（ARG）1，減輕組織損害，改善組織纖維化。

M1型巨噬細胞在體外特征性表達為 IL-12hiIL-23hiIL-10lo表型，其能高效分泌毒性效應分子（ROS和NO）和促炎細胞因子（IL-1β、TNF、IL-6），作為誘導物或效應細胞參與Th1應答；同時還介導對細胞內(nèi)寄生蟲和腫瘤的抑制作用［12］。M1型巨噬細胞是典型的促炎癥細胞，在組織修復過程中，M1型巨噬細胞能夠釋放金屬蛋白酶（MMPs）如MMP2和MMP9有助于降解細胞外基質(zhì)（ECM），促進炎癥細胞募集至受損的組織處；如果受損的組織持續(xù)受到刺激，激活的M1型巨噬細胞進一步募集大量的Th17細胞和嗜中性粒細胞至受損組織，加劇炎癥應答，導致大量的組織損傷。因此，在組織細胞損傷修復的過程中，M1型巨噬細胞可以促進炎癥反應，加重損傷組織部位的炎癥應答，導致組織損傷，從而不利于組織修復［13］。

本研究結(jié)果顯示：經(jīng)淫羊藿提取物培養(yǎng)的M1型巨噬細胞，IL-10基因呈現(xiàn)高表達量，與空白對照組比較增加11倍以上。IL-10是一個大小約35 kDa同型二聚體細胞因子，它可以由T細胞、單核細胞、巨噬細胞等多種細胞產(chǎn)生。IL-10最初被描述為一個細胞因子合成抑制因子，是因為其能極大地激活巨噬細胞/單核細胞，同時能減少促炎細胞因子的產(chǎn)生［14-15］。然而，IL-10除了強效抗炎癥作用，還表現(xiàn)出調(diào)節(jié)致纖維細胞因子的分泌，如TGF-β等［16］。有研究［17］表明，在小鼠切開傷口中，IL-10的高表達能夠減少疤痕組織的形成。而另一項研究［18］表明，在增生瘢痕組織中，IL-10的濃度增加，能夠表現(xiàn)出一種新的抗纖維化機制，其能促進蛋白激酶B（AKT）和信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子3 （STAT3）聯(lián)合激活信號轉(zhuǎn)換通路之間的交聯(lián)，從而阻礙纖維化相關基因的表達和過多ECM成分的蓄積。因此，淫羊藿通過上調(diào)IL-10的表達，從而抑制組織纖維化。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天提取物和淫羊藿提取物能夠上調(diào)M1型巨噬細胞叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3（FoxP3）的表達。調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）是人體必要的免疫調(diào)節(jié)細胞，能負調(diào)控免疫應答，維持對自身的免疫耐受和抑制自身免疫性疾病的發(fā)生。Treg細胞能夠通過抑制T細胞的活化和增殖、抑制IL-2和其他細胞因子在效應T細胞的表達、分泌抑制性細胞因子、負調(diào)控抗原提呈細胞、裂解效應T細胞和抗原提呈細胞等途徑發(fā)揮免疫失能和免疫抑制的功能。FoxP3對Treg細胞在胸腺的正常生長和發(fā)育中具有重要作用，同時是維持Treg細胞功能的重要轉(zhuǎn)錄因子［19］。因此，巴戟天提取物和淫羊藿提取物可能通過上調(diào)FoxP3基因的表達，發(fā)揮免疫耐受作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)巴戟天提取物能夠上調(diào)M1巨噬細胞的細胞毒性T細胞相關淋巴抗原-4（CTLA-4）的表達。CTLA-4與CD28是調(diào)控T細胞激活的兩個作用相反的共刺激信號分子［20］，CD28是激活T細胞的共刺激分子，而CTLA-4對T細胞的激活有反饋調(diào)節(jié)的作用。CTLA-4和CD28兩者結(jié)構(gòu)相似，它們有共同的配體B7（CD80和CD86）［21］。但是，CTLA-4與B7的親和力比CD28分子高［22］，CTLA-4能競爭性地與抗原提呈細胞B7分子結(jié)合，從而抑制T細胞的激活，發(fā)揮免疫抑制作用。因此，巴戟天提取物能夠通過影響M1巨噬細胞CTLA-4的表達，發(fā)揮免疫抑制的功能。

淫羊藿提取物培養(yǎng)M0型巨噬細胞后能上調(diào)其CCR5和TGF-β的基因表達。CCR5是趨化因子受體家族的一員，為7次跨膜的G-蛋白偶聯(lián)受體，其是HIV-1感染免疫細胞的重要輔助受體。此外，CCR5還可以介導單核巨噬細胞和自然殺傷細胞的募集［23-24］，以及影響IL-2和活化T細胞核因子（NFAT）的表達，繼而進一步影響STAT5和CD25的磷酸化過程和T細胞的增殖［25］，從而促進病原體清除的發(fā)生。TGF-β是組織創(chuàng)傷修復中重要的調(diào)控細胞因子，TGF-β能夠通過促進纖維原細胞分化成成肌纖維細胞，同時增加組織金屬蛋白酶移植物的表達，阻止細胞外基質(zhì)（ECM）的降解，并通過直接刺激成肌纖維細胞中的間質(zhì)纖維蛋白合成體，加速組織修復，減輕炎癥反應［26-27］。本研究結(jié)果顯示：淫羊藿提取物對M0巨噬細胞CCR5和TGF-β基因有促進表達的作用，使M0型巨噬細胞表現(xiàn)出一種促進病原體清除和組織修復的作用。

當巴戟天和淫羊藿提取物分別與IFN-γ共同刺激M0型巨噬細胞向M1型極化時，TGF-β并未測出，這與M1型巨噬細胞低分泌TGF-β相符合［28］。

M1型巨噬細胞是一類常見的炎癥性巨噬細胞，能夠促進機體的炎性免疫應答。經(jīng)巴戟天和淫羊藿提取物培養(yǎng)后，M1型巨噬細胞能上調(diào)IL-10、FoxP3、CTLA-4等抑炎基因表達，發(fā)揮免疫抑制作用，有利于組織結(jié)構(gòu)的維持和保護。而經(jīng)淫羊藿提取物培養(yǎng)的M0型巨噬細胞，則能夠上調(diào)CCR5 和TGF-β的基因表達，呈現(xiàn)出促進病原體清除和組織修復的作用?？偨Y(jié)本研究的結(jié)果，巴戟天和淫羊藿提取物通過對巨噬細胞M0和M1型基因表達影響的不同，發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用。

（致謝：廣州萬正藥業(yè)有限公司惠贈供研究使用的“喘可治”注射液的單一藥物提取物；本研究的檢測分析在廣州中醫(yī)藥大學省“211工程”建設項目、廣州中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床基礎國家重點學科實驗室完成。感謝鄧文娣、賴春輝、于靚、周映云、秦小平老師提供的技術(shù)幫助?。?/p>

［1］胡蓉.喘可治注射液聯(lián)合化療治療老年非小細胞肺癌的臨床研究［D］.廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2013.

［2］陶嵐.喘可治注射液治療中晚期原發(fā)性肝癌的臨床研究［D］.廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2005.

［3］孟坤，吳葵生，杜式群.HAART聯(lián)合中藥喘可治注射液治療3例艾滋病臨床觀察［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（5）：331.

［4］盧耀增，吳小閑，符林春，等.“喘可治”治療SIV/SAIDS猴的療效觀察［D］.中華中醫(yī)藥學會防治艾滋病學術(shù)研討會暨2006年年會論文集，2006：5.

［5］孫成宏，張亞興，唐先高，等.中藥喘可治對小鼠T淋巴細胞活化的雙向調(diào)節(jié)作用機理研究［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，5（8）：672.

［6］王幼萍，曾耀英，肇靜嫻.喘可治注射液對小鼠體外CD4+CD25+T細胞的影響［J］.生命科學研究，2006，10（4）：338.

［7］肇靜嫻，曾耀英，王青，等.喘可治注射液對人外周血單個核細胞Th1/Th2細胞因子譜的影響［J］.中國免疫學雜志，2006，22（4）：356.

［8］陳瀅宇，陳頌，符林春，等.中藥注射液喘可治對艾滋病猴模型Th17和Treg平衡的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，2014，31 （4）：566.

［9］Hryniewicz A，Boasso A，Edghill-Smith Y，et al.CTLA-4 blockade decreases TGF-beta，IDO，and viral RNA expression in tissues of SIVmac251-infected macaques［J］.Blood，2006，108（12）：3834.

［10］Malnati M S，Scarlatti G，Gatto F，et al.A universal real-time PCR assay for the quantification of group-M HIV-1 proviral load［J］.Nat Protoc，2008，3（7）：1240.

［11］Kaushik DK，Gupta M，Kumawat KL，et al.NLRP3 inflammasome：key mediator of neuroinflammation in murine Japanese encephalitis［J］.PloS One，2012，7（2）：e32270.

［12］Gordon S，Taylor P R.Monocyte and macrophage heterogeneity ［J］.Nat Rev Immunol，2005，5（12）：953.

［13］Murray P J，Wynn T A.Protective and pathogenic functions of macrophage subsets［J］.Nat Rev Immunol，2011，11（11）：723.

［14］Fortunato S J，Menon R，Lombardi S J.The effect of transforming growth factor and interleukin-10 on interleukin-8 release by human amniochorion may regulate histologic chorioamnionitis ［J］.Am J Obstet Gynecol，1998，179（3 Pt 1）：794.

［15］Moore K W，de Waal Malefyt R，Coffman R L，et al. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor［J］.Annu Rev Immunol，2001，19：683.

［16］Yamamoto T，Eckes B，Krieg T.Effect of interleukin-10 on the gene expression of type I collagen，fibronectin，and decorin in human skin fibroblasts： differential regulation by transforming growth factor-beta and monocyte chemoattractant protein-1［J］. Biochem Biophys Res Commun，2001，281（1）：200.

［17］Gordon A，Kozin E D，Keswani S G，et al.Permissive environment in postnatal wounds induced by adenoviral-mediated overexpression of the anti-inflammatory cytokine interleukin-10 prevents scar formation［J］.Wound Repair Regen，2008，16（1）：70.

［18］Shi J，Li J，Guan H，et al.Anti-fibrotic actions of interleukin-10 against hypertrophic scarring by activation of PI3K/AKT and STAT3 signaling pathways in scar-forming fibroblasts［J］.PLoS One，2014，9（5）：e98228.

［19］Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3［J］.Science，2003，299（5609）：1057.

［20］Lenschow D J，Walunas T L，Bluestone J A.CD28/B7 system of T cell costimulation［J］.Annu Rev Immunol，1996，14：233.

［21］Sansom D M.CD28，CTLA-4 and their ligands：who does what and to whom［J］.Immunology，2000，101（2）：169.

［22］Collins A V，Brodie D W，Gilbert R J，et al.The interaction properties of costimulatory molecules revisited［J］.Immunity，2002，17（2）：201.

［23］Van Elssen C H，Vanderlocht J，F(xiàn)rings P W，et al.Klebsiella pneumoniae-triggered DC recruit human NK cells in a CCR5-dependent manner leading to increased CCL19-responsiveness and activation of NK cells［J］.Eur J Immunol，2010，40（11）：3138.

［24］Berghuis D，Santos S J，Baelde H J，et al.Pro-inflammatory chemokine-chemokine receptor interactions within the Ewing sarcomamicroenvironment determineCD8（+）T-lymphocyte infiltration and affect tumour progression［J］.J Pathol，2011，223 （3）：347.

［25］Camargo J F，Quinones M P，Mummidi S，et al.CCR5 expression levels influence NFAT translocation，IL-2 production，and subsequent signaling events during T lymphocyte activation ［J］.J Immunol，2009，182（1）：171.

［26］Roberts A B，Sporn M B，Assoian R K，et al.Transforming growthfactor typebeta： rapidinductionof fibrosis and angiogenesis in vivo and stimulation of collagen formation in vitro ［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1986，83（12）：4167.

［27］Sunderkǒtter C，Steinbrink K，Goebeler M，et al.Macrophages and angiogenesis［J］.J Leukoc Biol，1994，55（3）：410.

［28］Italiani P，Boraschi D.From monocytes to M1/M2 macrophages：phenotypical vs functional differentiation［J］.Front Immunol，2014，5：514.

【責任編輯：黃玲】

Influence of Extracts from Herba Epimedii and Radix Morindae Officinalis on Gene Expression of M0 and M1 Type Monocyte-derived Macrophages in Rhesus Monkeys

CHENG Ye，CHEN Song，WANG Xiaoyu，XIONG Siyi，F(xiàn)U Linchun
（Institute of Tropical Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

ObjectiveTo study the influence of the extracts fromHerba Epimedii（Yinyanghuo）and Radix Morindae Officinalis（Bajitian），the main ingredients of Chinese herbal injection Chuankezhi，on the gene expression of unpolarized（M0）and polarized（M1）monocyte-derived macrophages in rhesus monkeys，and to analyze the immunoregulatory mechanisms.Methods Peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in rhesus monkeys were isolated by density-gradient centrifugation method，and were purified by adherent culture method.The purified mononuclear cells were induced to differentiate into M0 macrophages following stimulation with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（GM-CSF）for 5 days，and then the M0 macrophages were induced into M1 macrophages without polarization factor added or with IFN-γ added for 2 days.After M1 macrophages were treated with the extracts from Yinyanghuo or Bajitian，the total mRNA was extracted and then was used for reverse transcription to cDNA.The gene expression of CCR5， CD4， CTLA-4， FoxP3，IDO，interleukine（IL）-10 and transforming growth factor（TGF）-β was measured by real-time polymerase chain reaction（PCR）.Results Compared with the blank control group，the gene expression of M0 macrophagescultured with Bajitian extract showed no obvious change，while the gene expression of CCR5 in M0 macrophages cultured with Yinyanghuo extract was up-regulated by 4.21 folds， TGF-β was up-regulated by 7.66 folds，F(xiàn)oxP3 and IL-10 were up-regulated mildly，and no obvious changes were shown in the up-regulation folds of CD4，CTLA-4 or IDO.The gene expression of CTLA-4 in M1 macrophages cultured with Bajitian extract was up-regulated by 3.22 folds，F(xiàn)oxP3 was up-regulated by 3.69 folds，no obvious changes were shown in the upregulation folds of CCR5，CD4，IL-10 or IDO，and TGF-β was undetectable.In M1 macrophage treated with Yinyanghuo extract，IL-10 gene expression was up-regulated by 11.83 folds，F(xiàn)oxP3 was up-regulated by 4.55 folds，no obvious changes were shown in the up-regulation folds of IDO，CCR5，CD4 or CTLA-4，and TGF-β was also undetectable.Conclusion The extracts from Bajitian and Yinyanghuo can up-regulate the antiinflammatory genes，F(xiàn)oxP3 IL-10 and CTLA-4 in M1 macrophages；Yinyanghuo extract can up-regulate CCR5 and TGF-β gene expression of M0 macrophages，and promote pathogen clearance and tissue repair，so as to achieve multiple-effect immunological regulation.

macrophages；Herba Epimedii（Yinyanghuo）；Radix Morindae officinalis（Bajitian）；immune regulation；gene expression regulation；rhesus monkeys

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0520-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.019

2016-03-01

成業(yè)（1989-），男，碩士研究生；E-mail：cy890913@sina.com

符林春（1957-），男，研究員；E-mail：fulc01@126.com；陳頌（1977-），男，助理研究員；E-mail：chensong@gzucm.edu.com

國家科技重大專項資助項目（編號：2014ZX10005002）