趙朕華　王錄美　劉牧云　朱曙光　于金　趙安靜　胡良皞　滿曉華　金晶　吳洪玉 高軍　劉善榮　李兆申　廖專

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·論著·

改良組織塊法培養(yǎng)C57BL/6小鼠胰腺星狀細(xì)胞

趙朕華王錄美劉牧云朱曙光于金趙安靜胡良皞滿曉華金晶吳洪玉 高軍劉善榮李兆申廖專

目的通過改良傳統(tǒng)組織塊法培養(yǎng)C57BL/6小鼠胰腺星狀細(xì)胞(PSCs)，建立一種簡(jiǎn)便易行、快速獲得大量小鼠PSCs的培養(yǎng)方法。方法分離C57BL/6小鼠胰腺組織，經(jīng)胎牛血清清洗后剪切成0.5～1 mm3組織塊，經(jīng)貼壁培養(yǎng)4 d取原代PSCs，并傳代。采用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴變化，采用細(xì)胞免疫法及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞α-SMA、Desmin表達(dá)。結(jié)果貼壁4 d的原代PSCs多呈橢圓形或星形，胞質(zhì)內(nèi)大量脂滴，表達(dá)α-SMA及Desmin蛋白的細(xì)胞少；傳代后細(xì)胞變大、偽足豐富，脂滴減少或消失，原代、傳代PSCs的α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.653±0.071、2.290±0.055，傳代細(xì)胞的表達(dá)顯著高于原代細(xì)胞(P<0.05)，表達(dá)Desmin蛋白的細(xì)胞數(shù)量顯著增加。結(jié)論改良組織塊法可高產(chǎn)和高純度地獲得小鼠靜息態(tài)和激活態(tài)兩種狀態(tài)的PSCs，可以滿足體外研究的需要。

組織培養(yǎng)技術(shù)；胰腺星形細(xì)胞；細(xì)胞分離；體外研究

胰腺的進(jìn)行性纖維化是慢性胰腺炎(CP)的典型病理特征，胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cell，PSCs)是胰腺纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，在CP的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要，成功分離和培養(yǎng)PSCs是體外研究CP的重要前提。目前，分離和培養(yǎng)PSCs的經(jīng)典方法是酶消化聯(lián)合梯度離心法，但該操作繁瑣、不易掌握、耗時(shí)耗力、細(xì)胞得率低，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。1998年Bachem等[1]首次提出采用組織塊法分選PSCs，但僅成功分離人源性和鼠源性CP組織中的PSCs，且以活化細(xì)胞為主，而正常大鼠PSCs分離失敗。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道了組織塊法培養(yǎng)靜息態(tài)PSCs的研究，但需借助外源性胰酶抑制劑、梯度離心分選或酶消化法[2-4]。本研究改進(jìn)了已報(bào)道的組織塊法，建立一種簡(jiǎn)單易行、利用率高、能分離正常小鼠靜止態(tài)和活化態(tài)兩種PSCs的培養(yǎng)方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體重20 g左右，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。胰酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，油紅O染料購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)有限公司，兔抗小鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、兔抗小鼠結(jié)蛋白(Desmin)、兔抗小鼠CK19均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自臺(tái)灣Arigo公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG及DNA Marker購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司，BCA Protein Assay Kit購(gòu)自美國(guó)Pierce公司， PVDF膜購(gòu)自上海賽戈生物科技有限公司，超敏ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自上海賽戈生物科技有限公司。

二、方法

1．PSCs分離：用乙醚麻醉小鼠后，75%乙醇浸泡小鼠腹部消毒5 min，剖腹取出胰腺，在含有青、鏈霉素的胎牛血清中清潔后，反復(fù)剪切組織至0.5～1 mm3，然后將組織塊均勻鋪在培養(yǎng)皿中，每個(gè)組織塊間距為0.2～0.5 cm，倒置于孵育箱15～30 min。待組織塊貼壁后，沿培養(yǎng)皿邊緣緩慢加入適量含15%胎牛血清和青、鏈霉素的DMEM，置37℃、5% CO2的孵育箱培養(yǎng)，3 d換液一次。

2．PSCs傳代培養(yǎng)：組織塊培養(yǎng)4 d后，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞密度達(dá)40%～60%，此為原代PSCs。用一次性巴氏滴管輕柔吹打組織塊，待組織塊離壁后，和培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移至15 ml離心管，1 500 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液，加入適量胎牛血清，1 500 r/min離心5 min，棄血清，將組織塊置新培養(yǎng)皿重新貼壁培養(yǎng)。已有原代PSCs貼壁的原培養(yǎng)皿加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至第7～8天，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)棄培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2次，將500 μl PBS和500 μl胰酶混合均勻后加入培養(yǎng)皿，輕輕搖動(dòng)15～20 s后吸除胰酶溶液，置入37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)消化2 min，顯微鏡下觀察到星形貼壁細(xì)胞變圓后立即加適量培養(yǎng)液終止消化，用1 ml移液槍輕柔吹打，使細(xì)胞脫壁并分散成單個(gè)細(xì)胞，按2∶3比例傳代，傳代第2天換液，之后每2～3 d換液。

3．PSCs鑒定：倒置顯微鏡觀察PSCs的形態(tài)結(jié)構(gòu)，主要包括細(xì)胞形狀、胞內(nèi)脂滴、細(xì)胞核等。

脂滴觀察采用油紅O染色。應(yīng)用4%多聚甲醛固定原代或傳代PSCs 30 min，PBS漂洗3遍后加入油紅O染液常溫染色20 min，PBS漂洗3遍，60%乙醇分化，顯微鏡下觀察背景清晰后，PBS漂洗3遍，封片，鏡下觀察并攝片。

α-SMA檢測(cè)采用細(xì)胞免疫化學(xué)法。應(yīng)用4%多聚甲醛固定原代或傳代PSCs 30 min，PBS漂洗3遍后加入0.5% Triton X-100 37℃孵育30 min，5% BSA室溫封閉30 min，加α-SMA一抗4℃孵育過夜，PBS漂洗后加HRP標(biāo)記IgG室溫孵育80 min，DAB顯色，梯度乙醇脫水后封片，鏡下觀察并攝片。同時(shí)采用蛋白質(zhì)印跡法常規(guī)檢測(cè)原代或傳代PSCs的α-SMA蛋白表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。應(yīng)用Amersham imager 600軟件獲取條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

Desmin檢測(cè)采用細(xì)胞免疫熒光法。方法基本同上，二抗為FITC標(biāo)記IgG，最后加DAPI避光孵育5 min，核復(fù)染，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下避光攝片。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一、PSCs形態(tài)學(xué)觀察

組織塊貼壁第4天，原代PSCs細(xì)胞呈放射狀爬出，在組織塊周圍形成“生長(zhǎng)暈”，組織塊近側(cè)細(xì)胞多呈圓形、橢圓形，遠(yuǎn)側(cè)細(xì)胞呈三角、四角、五角等多種星形，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見高亮環(huán)形脂滴，越靠近胞核處脂滴越多；傳代后的細(xì)胞體積增大，扁平，立體感消失，偽足豐富，呈“星芒狀”，脂滴減少或消失，胞核較大，核仁明顯，呈“魚眼樣”(圖1)。油紅O染色見貼壁第4天原代細(xì)胞內(nèi)脂肪滴呈紅染顆粒狀，簇集成團(tuán)，環(huán)繞于胞核周圍；傳代細(xì)胞未見明顯著色(圖1)。

圖1　組織塊法分離的原代、傳代PSCs(1A、1B)及其脂滴變化(1C、1D，油紅O染色；1A、1C　100 μm，1B、1D　50 μm)

二、PSCs的α-SMA、Desmin蛋白表達(dá)

細(xì)胞免疫化學(xué)染色法見少數(shù)原代細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)陽(yáng)性，傳代細(xì)胞中絕大多數(shù)胞質(zhì)染成棕褐色，α-SMA蛋白表達(dá)陽(yáng)性，高倍鏡下見排列整齊的棕褐色肌絲(圖2)。蛋白質(zhì)印跡法顯示原代、傳代PSCs的α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.653±0.071、2.290±0.055，傳代細(xì)胞的表達(dá)量顯著高于原代細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=31.498，P<0.05，圖3)。

細(xì)胞免疫熒光染色法見貼壁第4天的原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞均有部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)紅色熒光，傳代細(xì)胞核外紅色熒光面積大于原代細(xì)胞，并可見清晰的紅色肌絲(圖4)。

圖2　傳代PSCs α-SMA表達(dá)(細(xì)胞免疫化學(xué)染色，50 μm) 圖3　原代(1)及傳代PSCs(2)α-SMA蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

圖4　原代(4A)、傳代(4B)PSCs Desmin表達(dá)(細(xì)胞免疫熒光染色　50 μm)

PSCs在CP、胰腺癌以及CP癌變等疾病的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[5-9]。最初PSCs是在小鼠胰腺中被發(fā)現(xiàn)，以富含維生素A為特點(diǎn)[10]，后相繼在大鼠和人胰腺中分離獲得[11-12]，為胰腺相關(guān)疾病的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

目前，靜息態(tài)PSCs分選主要采用酶消化聯(lián)合梯度離心法[1,12-16]，而組織塊法提取的PSCs多為激活狀態(tài)[12,17]。組織塊法分離靜息態(tài)PSCs仍需借助外源性胰酶抑制劑、梯度離心分選純化或酶消化法等，不僅成本高，而且操作繁瑣[2-4]。本研究采用改良的組織塊法分離正常小鼠PSCs，與已報(bào)道的研究相比，改用了胎牛血清清洗新鮮分離的胰腺組織，抑制胰酶消化，并及時(shí)補(bǔ)給組織、細(xì)胞離體后所需的營(yíng)養(yǎng)，提高了細(xì)胞的存活率。此外，在組織塊貼壁后第2天就換液也是為了減少胰酶對(duì)組織細(xì)胞的損傷。

PSCs對(duì)胰酶的作用十分敏感，故傳代時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制細(xì)胞與胰酶的接觸量和接觸時(shí)間。本研究在細(xì)胞傳代時(shí)將胰酶按1∶1稀釋，降低胰酶的作用濃度，并縮短細(xì)胞和胰酶的接觸時(shí)間為15～20 s，置入37℃孵育箱2 min，憑借培養(yǎng)皿中殘留的胰酶繼續(xù)消化細(xì)胞，成功地分離了活性好、傳代成活率高的PSCs。本方法簡(jiǎn)便易行、細(xì)胞得率高且組織塊重復(fù)使用率高。

靜息狀態(tài)的PSCs胞質(zhì)內(nèi)富含脂肪滴，在活化過程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈成纖維細(xì)胞樣，脂肪滴逐漸減少、消失，α-SMA表達(dá)增加[18]，而Desmin在靜息和活化狀態(tài)下均有表達(dá)，因此，脂肪滴、α-SMA和Desmin可作為鑒定PSCs的指標(biāo)。脂肪滴主要用于靜息態(tài)細(xì)胞的鑒定，α-SMA用于活化細(xì)胞的鑒定[1,12,15,17-18]。本研究結(jié)果顯示，組織塊貼壁第4天在高倍顯微鏡下觀察到貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，其胞核周圍可見大量環(huán)狀高亮脂滴，油紅O染色呈現(xiàn)為紅染顆粒，而α-SMA低表達(dá)；細(xì)胞傳代后，脂滴消失，油紅O染色陰性，α-SMA高表達(dá)。表明組織塊法從胰腺組織中分離獲得的是靜息態(tài)PSCs，經(jīng)過傳代后幾乎全部激活。

從組織塊“爬出”的早期細(xì)胞表達(dá)Desmin，傳代后同時(shí)表達(dá)Desmin和α-SMA兩種骨架蛋白，證明了改良的組織塊法可一次性分離獲得PSCs，無需梯度離心純化細(xì)胞。貼壁第4天的原代細(xì)胞有些已表達(dá)α-SMA，但傳代后表達(dá)量明顯增多，推測(cè)組織塊法培養(yǎng)的原代細(xì)胞中可能有小部分細(xì)胞受到胰酶消化刺激已經(jīng)活化。

總之，改良的組織塊法成功分離獲得正常小鼠靜息狀態(tài)PSCs，并經(jīng)傳代后活化，獲得的靜息態(tài)和激活態(tài)PSCs符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求，可以滿足體外研究的需要。相比酶消化法和已報(bào)道的組織塊法，本法分選PSCs操作簡(jiǎn)單、流程少，污染概率低，無需細(xì)胞純化及外源胰酶抑制劑干擾，且組織塊可反復(fù)貼壁分離PSC，組織利用率高。

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(本文編輯：呂芳萍)

Modified tissue culture for C57BL/6 mouse pancreatic stellate cells

ZhaoZhenhua,WangLumei,LiuMuyun,ZhuShuguang,YuJin,ZhaoAnjing,HuLianghao,ManXiaohua,JinJing,WuHongyu,GaoJun,LiuShanrong,LiZhaoshen,LiaoZhuan.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:LiaoZhuan,Email:liaozhuan@smmu.edu.cn

ObjectiveTo culture C57BL/6 mouse pancreatic stellate cells (PSCs) with a modified method, and to establish a simple cultivation method with a high yield of PSCs. MethodsPancreatic tissues in C57BL/6 mice were collected, washed by fetal bovine serum, minced into 0.5～1 mm3, and cultured in sterile culture flasks. After 4days, primary PSCs were collected and passed on. The changes in intracellular lipid droplets were identified by oil red O staining; α-SMA,desmin expression was detected by immunocytochemical or immunocytofluorescent staining, and Western blot. ResultsOutgrowth cells in the fourth day were oval or star with abundant lipid droplets and fewer cells expressed α-SMA and desmin protein. PSCs turned into bigger, more pseudopodial ones with decreasing lipid droplets and significantly increasing expression of α-SMA and desmin protein after the passage. Protein expression of α-SMA in primary and passage PSCs were 0.653±0.071, 2.290±0.055, respectively; and the expression in passage PSCs was significantly higher than that in primary PSCs (P<0.05), and the number of cells expressing desmin protein was significantly increased. ConclusionsModified tissue culture is a high yield and high purity method for both quiescent and activated PSCs, which can meet the need of in-vitro studies.

Tissue cutture techniques;Pancreatic stellate cells;Cell separation;In vitro Fund program： National Natural Science Foundation of China(81270541)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.01.010

200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科(趙朕華、劉牧云、朱曙光、于金、趙安靜、胡良皞、滿曉華、金晶、吳洪玉、高軍、李兆申、廖專)，中心實(shí)驗(yàn)室(王錄美、劉善榮)

廖專，Email：liaozhuan@smmu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(81270541)

2015-09-20)