陳祿芝，余霞艷，胡一丞，李色東

(1.湛江恒興南方海洋科技有限公司，廣東 湛江，524073；2.湛江市海洋與漁業(yè)發(fā)展研究中心，廣東 湛江，524039；3.南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州，510275)

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粵西地區(qū)凡納濱對蝦蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒感染情況的初步調(diào)查

陳祿芝1，3，余霞艷1，3，胡一丞1，3，李色東1，2，3*

(1.湛江恒興南方海洋科技有限公司，廣東 湛江，524073；2.湛江市海洋與漁業(yè)發(fā)展研究中心，廣東 湛江，524039；3.南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州，510275)

針對近年來粵西地區(qū)養(yǎng)殖戶普遍反映凡納濱對蝦長不大的情況，本實驗室運用對蝦EHP和IHHNV的熒光定量PCR檢測方法，對該兩種病原進行了流行性調(diào)查。結(jié)果顯示，在87份樣品中，EHP的檢出率為41.38%，IHHNV的檢出率為12.18%。在檢測樣品中，兩份不同海域的海水樣品有檢測到EHP和IHNNV，而經(jīng)處理過的養(yǎng)殖用水和育苗用水中未檢測出上述病原；成蝦的EHP檢出率最高達93.75%，種蝦的IHHNV檢出率最高為38.10%。在本地選育的種蝦和進口種蝦中，均有檢出EHP，檢出率分別為80.00%和33.33%，進口種蝦中未檢測出IHHNV。在不同養(yǎng)殖場樣品的檢測結(jié)果中，EHP載量指數(shù)最高的對蝦平均日增長體重最小，即載量指數(shù)為10的對蝦樣品日增長量為0.039g；而EHP載量指數(shù)最低的日增量大，即載量指數(shù)為2的日增長量為0.90g。對B養(yǎng)殖場不同養(yǎng)殖時長的對蝦進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3份樣品的EHP載量指數(shù)分別為6、7和7；B養(yǎng)殖場20號池不同規(guī)格的對蝦EHP載量指數(shù)均為4。

凡納濱對蝦；蝦肝腸胞蟲(EHP)；傳染性皮下和造血組織壞死病毒(IHHNV)；實時熒光定量PCR

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)原產(chǎn)于太平洋西海岸至墨西哥灣中部，具有生長快、抗逆性強、易養(yǎng)殖等特點，是當(dāng)前世界對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的優(yōu)良品種之一。自2001年以來，凡納濱對蝦養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量占據(jù)我國對蝦養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量的首位。目前凡納濱對蝦在養(yǎng)殖過程中遇到大小不均、長不大等問題，給養(yǎng)殖戶造成了很大的損失。有研究認為，引發(fā)這些問題的病原可能是蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒[1]。蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP或者ECZ)，是一種可感染多種真核生物的專性細胞內(nèi)寄生蟲，2009年在泰國的斑節(jié)對蝦中被首次發(fā)現(xiàn)而命名，另有研究表明EHP病原體來自于澳大利亞，而且蝦與蝦之間的直接傳播方式可能來自于鮮活餌料[2-3]。在國內(nèi)，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所對該寄生蟲研究較多，稱之為腸胞蟲，并且建立了一套快速檢測腸胞蟲的方法[4]。感染EHP的對蝦肌肉發(fā)白、腸道吸收功能下降，嚴重的出現(xiàn)肝胰腺萎縮[5]，俗稱“棉花蝦”[4]。雖然這不會導(dǎo)致對蝦的死亡，但蝦肝腸胞蟲卻是近年來凡納濱對蝦生長緩慢的主要原因之一[6-7]。除蝦肝腸胞蟲外，傳染性皮下和造血組織壞死病毒(infectionshypodermalandhematopoieticnecrosisvirus，IHHNV)也是導(dǎo)致養(yǎng)殖對蝦生長緩慢的主要原因之一，感染IHHNV的凡納濱對蝦生長遲緩，甚至整個養(yǎng)殖期都無法長大[8]。EHP和IHHNV傳播途徑較廣，既可通過受精卵或種苗垂直傳播[9]，也可以通過養(yǎng)殖水體水平傳播[10]。這兩種病害目前已嚴重影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康與持續(xù)發(fā)展。

針對養(yǎng)殖戶反映的凡納濱對蝦生長緩慢的現(xiàn)象，本研究采用EHP和IHHNV實時熒光定量PCR(real-timePCR，RT-PCR)檢測方法，對粵西地區(qū)的凡納濱對蝦親蝦、蝦苗、成蝦、餌料、鮮活餌料和育苗與養(yǎng)殖水體進行檢測，分析這兩種病原在種苗生產(chǎn)與對蝦養(yǎng)殖中的流行情況。

1　材料與方法

1.1實驗材料

采用探針法熒光定量PCR，對EHP和IHHNV進行檢測；EHP實時熒光定量PCR檢測試劑盒、IHHNV實時熒光定量PCR檢測試劑盒均來自國家海洋局第三海洋研究所(廈門)；熒光定量PCR儀(TL988)；解剖剪等。

1.2實驗方法

1.2.1樣品預(yù)處理

蝦苗：用生理鹽水沖洗蝦苗表面3次以上，隨機挑取0.1g，置于玻璃研磨器中充分研磨后，轉(zhuǎn)入1.5mL的EP管中，提取DNA。親蝦、成蝦：分別取鮮活蝦體的肝胰臟0.1g，處理方式同上。種蝦餌料：取種蝦餌料0.1g，處理方式同上。水樣：各取80mL的水樣分裝于50mL離心管，6 000rpm離心8min，棄上層清夜，留少許上清液，懸浮沉淀，轉(zhuǎn)入1.5mL的EP管中，12 000rpm離心5min，棄上層清夜。

1.2.2樣品DNA提取

預(yù)處理的樣品參照試劑盒說明書提取樣品總DNA。

1.2.3Real-timePCR檢測

以上述提取的DNA為模板，進行real-timePCR檢測。20uL反應(yīng)體系，參照試劑盒的說明書進行配制。擴增條件：95℃預(yù)變性2min；94℃變性10s，60℃退火30s(此處采集熒光，設(shè)置為FAM綠色熒光)，共40個循環(huán)。

1.2.4試劑盒特異性檢測

EHP試劑盒特異性檢測：分別選擇傳染性皮下和造血組織壞死病毒(IHHNV)、白斑綜合征病毒(WSSV)的質(zhì)粒標準品和健康的凡納濱對蝦總DNA為陰性對照，水為模板的空白對照，以感染EHP的凡納濱對蝦總DNA為陽性，通過real-timePCR擴增檢測，分析試劑盒特異性。

IHHNV試劑盒特異性檢測：分別選擇蝦肝腸胞蟲(EHP)、白斑綜合征病毒(WSSV)的質(zhì)粒標準品和健康凡納濱對蝦總DNA為陰性對照，水為模板的空白對照，以感染IHHNV的凡納濱對蝦總DNA為陽性，通過real-timePCR擴增檢測，分析試劑盒特異性。

1.2.5Real-timePCR標準曲線以及重復(fù)性試驗

分別對EHP、IHHNV檢測試劑盒的4個陽性標準品(4個梯度)進行real-timePCR，建立質(zhì)粒拷貝數(shù)與循環(huán)數(shù)(Cycleofthreshold，Ct)對應(yīng)的標準曲線，通過分析標準曲線相關(guān)系數(shù)來判斷標準曲線的質(zhì)量，重復(fù)3次。用Excel對重復(fù)性擴增結(jié)果的Ct值進行方差分析。

1.2.6數(shù)據(jù)處理方法

本文采用生物統(tǒng)計學(xué)方法對樣品進行取樣處理，運用Excel對檢測結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

相比啟發(fā)式算法存在精度不高的問題，采用線性數(shù)學(xué)優(yōu)化方法可以尋找到全局最優(yōu)解或近優(yōu)解，以Marco等[9]為代表，將FPGA布局問題轉(zhuǎn)化為MILP求優(yōu)問題，文獻[10]中首先對芯片資源和待布局邏輯功能進行建模，然后設(shè)立芯片和邏輯功能需要滿足的各項約束，最后確定優(yōu)化目標函數(shù).采用該方法可以有效提高布局精度，但是由于求解時間過長，通常在待布局邏輯功能數(shù)量過大時需要設(shè)置求解器的運行時限，同時，隨著FPGA芯片規(guī)模不斷擴大，對其進行準確建模的難度也急劇增加.

2　結(jié)果與分析

2.1試劑盒特異性檢測

EHP試劑盒特異性檢測結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，除了感染EHP的凡納濱對蝦樣品有擴增曲線外，其余樣品均未檢測到熒光信號。

IHHNV試劑盒特異性檢測結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，除了感染IHHNV的凡納濱對蝦樣品有擴增曲線外，其余樣品均未檢測到熒光信號。

2.2Real-timePCR標準曲線以及重復(fù)性實驗

分別對EHP、IHHNV檢測試劑盒的4個陽性標準品(4個梯度)進行real-timePCR，以蒸餾水為空白對照，其擴增曲線呈標準的S曲線(圖3和圖4)。

對EHP、IHHNV檢測試劑盒進行重復(fù)性實驗分析，結(jié)果如表1和表2所示。從表中可知，組內(nèi)3個平行Ct值基本一致，方差小于1，且變異系數(shù)小于15%，結(jié)果表明試劑盒重復(fù)性滿足檢測要求。

表1　EHP實時熒光定量PCR檢測重復(fù)性試驗

表2　IHHNV實時熒光定量PCR檢測重復(fù)性實驗

2.3多種樣品的EHP和IHHNV檢測結(jié)果

用real-timePCR檢測方法對粵西地區(qū)的有關(guān)凡納濱對蝦樣品進行EHP和IHHNV檢測，結(jié)果匯總后如表3所示。從表中可知，共檢測的87份樣品中，EHP的檢出率為41.38%，IHHNV的檢出率為12.18%。成蝦和種蝦樣品的EHP檢出率較高，分別為93.75%和66.67%。同樣，IHHNV檢出率也較高，分別為31.25%和38.10%。其中未經(jīng)處理過的2份海水樣品均有檢出EHP和IHNNV，但經(jīng)過砂濾、臭氧消毒、泡沫分離、紫外消毒等一系列處理后的育苗與養(yǎng)殖用水未檢測到EHP和IHHNV。

表3　粵西地區(qū)凡納濱對蝦有關(guān)樣品EHP和IHHNV的檢測結(jié)果

2.4進口樣品與本地樣品的EHP和IHHNV檢測結(jié)果

分別對進口種蝦、進口一代苗、本地種蝦和本地蝦苗進行檢測，結(jié)果見表4。從表中可知，6份進口種蝦樣品中，EHP檢出率較低，為33.33%，且未檢測到IHHNV。同樣，進口的一代苗中，EHP檢出率為30.00%，IHHNV的檢出率較低，為10%。本地種蝦的EHP和IHHNV檢出率最高，分別為80.00%和53.33%。本地蝦苗的EHP檢出率為21.74%，IHHNV檢出率為34.78%。

表4　進口種蝦與本地種蝦的EHP和IHHNV檢測結(jié)果

2.5不同成蝦樣品的EHP和IHHNV檢測結(jié)果

為探究凡納濱對蝦感染EHP和IHHNV對生長的影響，對不同養(yǎng)殖環(huán)境(不同養(yǎng)殖場)、不同養(yǎng)殖時長和不同規(guī)格的對蝦樣品進行了上述病原的檢測。不同養(yǎng)殖場成蝦檢測結(jié)果如表5所示，A養(yǎng)殖場的腸胞蟲載量最高，對蝦平均日增長體重(以下簡稱“日增長量”)最低，為0.039g。C養(yǎng)殖場的腸胞蟲含量最少，其平均日增長量比其它兩個場的高，為0.090g。3個養(yǎng)殖場的樣品均未檢測出IHHNV。

表5　不同養(yǎng)殖場成蝦樣品的檢測結(jié)果

注：表中“-”代表檢測結(jié)果呈陰性，下同。

Notes：-representedanegativetestresultsinthetable，thesamebelow.

B養(yǎng)殖場不同養(yǎng)殖時長對蝦的檢測結(jié)果如表6所示。3份樣品均有檢出EHP，其日增長量最大的B-24樣品，EHP載量相對最低；而日增長量最小的B-17樣，EHP載量相對較高。另在B-23的樣品中有檢出IHHNV。

表6　B養(yǎng)殖場不同養(yǎng)殖時長成蝦的EHP和IHHNV病原檢測結(jié)果

B養(yǎng)殖場20號池不同規(guī)格對蝦(養(yǎng)殖時間116d)的檢測結(jié)果如表7所示，EHP的載量指數(shù)(ERCEHP)相同；其平均日增長量為0.071g，其成蝦樣品中沒有檢測到IHHNV。

表7　B養(yǎng)殖場20號池不同規(guī)格蝦的EHP和IHHNV檢測結(jié)果

根據(jù)以上檢測對蝦的養(yǎng)殖時長和體重以及對其EHP的檢測結(jié)果，得到日增長量與EHP載量指數(shù)(ERCEHP)的關(guān)系圖(圖5)。從圖中可見對蝦的日增長量與EHP載量指數(shù)呈一定的對數(shù)關(guān)系(R2=0.574 3)。

3　討論

近年來，EHP在全球凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)中流行范圍很廣，先后在泰國、馬來西亞、印度等國檢測出該病原，在我國江蘇沿海和廣東沿海地區(qū)也都有檢出。EHP嚴重威脅著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟損失。2015年浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣站對浙江地區(qū)的134份蝦苗樣品進行檢測，EHP的檢出率高達53.8%[11]，HHNV的檢出率為25.4%[11]；江蘇沿海地區(qū)凡納濱對蝦EHP的發(fā)病率約為25.0%[12]。本研究對粵西區(qū)域的87份樣品進行檢測，EHP的檢出率為41.38%，IHHNV的檢出率為12.18%。另在檢測樣品中，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過處理的海水樣品均有檢測到EHP和IHNNV，而經(jīng)過砂濾、臭氧消毒、精密過濾、紫外消毒等一系列處理過的水體中未檢測出上述病原，可見消毒處理可以預(yù)防感染EHP和IHHNV。

微孢子蟲廣泛的宿主范圍使得國內(nèi)外研究者對其識別和檢測進行了大量探索研究。傳統(tǒng)的染色鏡檢法直觀，但對檢測人員的技術(shù)要求高，而方法靈敏度低；免疫學(xué)檢測技術(shù)主要利用抗體與抗原特異性結(jié)合的原理，結(jié)合免疫放大技術(shù)，其操作簡便，但特異性和靈敏度有待進一步提高。本實驗使用絕對定量PCR方法，不同于一般相對定量法利用內(nèi)參基因得到相對表達量，絕對定量法通過測定已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒標準品，得到Ct值與拷貝數(shù)的標準曲線，然后測定樣品的Ct值，代入標準曲線得出具體的樣品中病毒的拷貝數(shù)，具有靈敏度和特異性高的特點，操作簡便，省時省力，適用于大批量樣品的檢測。

從本文對不同養(yǎng)殖場、不同養(yǎng)殖時長和不同規(guī)格對蝦的檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：3個養(yǎng)殖場的對蝦EHP載量差異大，EHP載量高的對蝦日增長量最小，而日增量大的EHP載量低；在B養(yǎng)殖場不同時長的對蝦檢測結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖時長與EHP載量沒有相關(guān)性，其感染量基本相同；B養(yǎng)殖場20號池不同規(guī)格的對蝦EHP載量指數(shù)一致。綜上所述，對蝦EHP的載量與養(yǎng)殖環(huán)境有緊密聯(lián)系，環(huán)境不同其EHP的載量指數(shù)不同。因此在對蝦養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖水體、飼養(yǎng)餌料以及養(yǎng)殖工具等環(huán)境因素的嚴格把關(guān)，對控制對蝦感染EHP病原極為重要。對蝦日增長量與EHP載量指數(shù)呈一定的對數(shù)關(guān)系(R2=0.574 3)，EHP載量指數(shù)增大，日增長量呈對數(shù)下降。結(jié)果與劉珍[4]的實驗結(jié)果呈負相關(guān)性吻合。但由于實驗局限，R2較低，且樣品的養(yǎng)殖環(huán)境和感染時間有差異，因此EHP載量指數(shù)與對蝦日增長的關(guān)系有待后期實驗進一步的探索，本文結(jié)果可作為一個探討趨勢。

[1]PrasertsriSatit，LimsuwanChalor，ChuchirdNiti.Theeffectsofmicrosporidian(Thelohania)infectiononthegrowthandhistopathologicalchangesinpond-rearedPacificwhiteshrimp(Litopenaeus vannamei)[J].KasetsartJ.Nat.Sci.,2009,43：680-668.

[2]廖國璋.對蝦微袍子蟲病的研究進展[J].江西水產(chǎn)科技，2002，(2)：41-42.

[3]AmomratT，JirapornS，SaisuneeC，etal.ThemicrosporidianEnterocytozoon hepatopenaeiisnotthecauseofwhitefecessyndromeinwhitelegshrimpPenaeus(Litopenaeus)vannamei[J].BmcVeterinaryResearch,2013，9(2)：161-168.

[4]劉珍.蝦肝腸胞蟲實時熒光定量PCR檢測技術(shù)的建立及其與對蝦生長相關(guān)性的研究[D].上海：上海海洋大學(xué)，2015.

[5]雷燕，張會軍，龐河輝.白蝦檢出“腸道上皮細胞微孢子蟲”[J].海洋與漁業(yè)·水產(chǎn)前沿，2015,(8)：82-84.

[6]ChayaburakulK，NashG，PratanpipatP.SriurairatanaS，etal.Multiplepathogensfoundingrowth-retardedblacktigershrimpPenaeus monodoncultivatedinThailand[J].Dis.Aquat.Org.,2004,60(2):89-96.

[7]AnantasomboonG，SriurairatanaS，F(xiàn)legelTW，etal.Uniquelesionsandviral-likeparticelsfoundingrowthretardedblacktigershrimpPenaeus monodonEastAfrica[J].Aquaculture,2006，253(1-4):197-203.

[8]江世貴，翁少萍，呂玲，等.對感染白斑綜合癥病毒的親蝦子代的跟蹤檢測[J].中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2003，42(1)：66-99.

[9]LotzJM.Specialtopicreview：viruses，biosecurityandspecificpathogen-freestocksinshrimpaquaculture[J].WorldJournalofMicrobiol&Biotechnol，1997，13：405-413.

[10]王維娜，王安利，陳麗等.斑節(jié)對蝦體內(nèi)微胞子蟲的超微結(jié)構(gòu)[J].動物學(xué)報，2001，(S1)：78-81.

[11]浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣站.浙江省上半年水產(chǎn)養(yǎng)殖病害形勢分析[N].中國漁業(yè)報，2015-08-17(B02).

[12]萬夕和.江蘇省部分淡化場南美白對蝦蝦苗腸胞蟲檢出率超兩成[J].水產(chǎn)前沿，2016，3：13.

Preliminary investigation of Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV)from Litopenaeus vannamei in west Guangdong Province

CHEN Luzhi1,3，YU Xiayan1,3，HU Yicheng1,3，LI Sedong1,2,3*

(1.ZhangjiangEvergreenSouthOceanTechnologyCo.Ltd.,Zhanjiang524073,China;2.ZhanjiangOceanandFisheryDevelopmentResearchCenter,Zhanjiang524039,China;3.TheBiologicalResourcesDevelopmentandUtilizationofCollaborativeInnovationCenteroftheSouthChinaSea,Guangzhou510275,China)

Inrecentyears,thegrowthretardationofwhiteshrimp(Litopenaeus vannamei)hasbeenacommonphenomenoninwestGuangdongProvince.ThepotentialpathogeniesofthisdiseaseareconsideredEnterocytozoon hepatopenaei (EHP)andinfectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus(IHHNV).Thefluorescentquantitativereal-timePCR(RT-PCR)methodswerefoundedsoastoestimatetheepidemicofthesetwopathogenies.Thesemethodswereusedtodetect87samplesofjuniorshrimps,parentshrimps,adultshrimps,freshfeedandwaterwhichsampledacrossthewestGuangdongProvince.TheresultsshowedthatthepositiverateofEHPwas41.38%,theIHHNVpositiverateof12.18%.Andintestingsamples,EHPandIHNNVhavebeendetectedintwoseawatersamplesindifferentareas,buthavenotbeendetectedincultivationwateraftersterilized.ThehighestEHPpositiverateofadultshrimpswas93.75%andhighestIHHNVpositiverateof38.10%.EHPwasdetectedinbothlocalandimportedparentshrimp,positiverateof80.00%and33.33%,respectively,butIHHNVwasnotdetectedinimportedparentshrimp.Inthetestresultsofsampleswithdifferentfarms,theshrimp,whichloadindexofEHPwasthehighestof10,theaverageweightofdailygrowthwastheminimumof0.039g.AndloadindexofEHPwasthelowestof2,whiletheaverageweightofdailygrowthwasthemaximumof0.090g.ButtheloadindexofEHPwasthesamewiththedifferentsizeshrimpsinthepoolof20.ThenitwasfoundthatthecontentofEHPinsmallerjuniorshrimpsfromdifferentpondswassignificantlyhigherthanlargeones,indicatingthatEHPhadasignificantimpactonthegrowthoftheshrimp.TheyhadasimilarogarithmicrelationshipandthecorrelationcoefficientwasR2= 0.574 6.

Litopenaeus vannamei;EHP;IHHNV;real-timePCR

2016-06-17

國家蝦產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-47)；餌料微藻的濃縮產(chǎn)品開發(fā)及應(yīng)用示范(A201508C05).

陳祿芝(1990-)，女，碩士，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害防治.E-mail：clz4900@163.com

李色東(1963-)，男，教授級高級工程師，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟動物育種.E-mail：lisedong@163.com

S-3

A

1006-5601(2016)04-0273-08

陳祿芝，余霞艷，胡一丞，等.粵西地區(qū)凡納濱對蝦蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒感染情況的初步調(diào)查[J].漁業(yè)研究，2016，38(4)：273-280.