倪振洪，何鳳田，連繼勤（第三軍醫(yī)大學生物化學與分子生物學教研室，重慶400038）

·專家筆談·

Bcl-2與自噬的研究進展*

倪振洪，何鳳田，連繼勤△（第三軍醫(yī)大學生物化學與分子生物學教研室，重慶400038）

2003年7月獲生物化學與分子生物學博士學位，2008年10月至2010年8月留學于美國密歇根大學醫(yī)學院放射腫瘤學系。主要研究方向為細胞自噬與腫瘤，先后主持國家及省部級科研課題8項，以第一和通訊作者發(fā)表SCI論文12篇，總影響因子56.03分，單篇最高影響因子11.753，被引用次數(shù)263次，以第一發(fā)明人申請獲得國家發(fā)明專利1項。

基因，Bcl-2；基因，p53；自噬；綜述

B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）是一種含有多個BH結(jié)構(gòu)域的抗凋亡蛋白。最近研究表明，Bcl-2蛋白還與細胞的自噬過程密切相關(guān)，與自噬信號途徑中的多個分子進行相互調(diào)節(jié)，發(fā)揮抗自噬的作用。本文綜述了Bcl-2與自噬關(guān)系的相關(guān)研究進展。

圖1　Bcl-2抗凋亡蛋白家族成員［1］

1　Bcl-2及其家族蛋白

Bcl-2家族蛋白是目前研究得最深入、最廣泛的調(diào)控線粒體途徑凋亡的一類分子，在線蟲、病毒和哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)超過20個Bcl-2家族成員，同源性較高。家族成員分為3類：（1）含有BH1、BH2、BH3、BH4 4個高度保守結(jié)構(gòu)域的抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-w 和A1；（2）含有BH1、BH2、BH3、BH4 4個高度保守結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，包括Bak和Bax；（3）只含有BH3結(jié)構(gòu)域的BH3樣蛋白，包括Bim、Bid、Puma、Noxa、Bad、Hrk、Bmf、bik。見圖1。Bcl-2家族抗凋亡蛋白的BH1～BH4結(jié)構(gòu)域在空間上形成1個疏水凹槽，這一結(jié)構(gòu)可以與含BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白及 BH3樣蛋白 Bak、Bax、Bad、Noxa等特異地結(jié)合，通過阻止線粒體外膜通透化（mitochondria outer membrane permeabilization，MOMP）從而使腫瘤細胞逃避凋亡，是造成腫瘤治療抵抗的重要原因［1］。

Bcl-2家族蛋白中最先被發(fā)現(xiàn)的是 Bcl-2。Tsujimoto等［2-3］于1985年在研究克隆濾泡性非何杰金B(yǎng)細胞淋巴瘤最常見的轉(zhuǎn)位t（14；18）過程中發(fā)現(xiàn)。Bcl-2基因通過轉(zhuǎn)移并置于14號染色體長臂的32區(qū)導致轉(zhuǎn)錄增強從而過度表達。Bcl-2的基因結(jié)構(gòu)含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，其編碼蛋白含239個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約為26×103。Bcl-2蛋白在細胞內(nèi)主要分布于線粒體膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。已有研究表明，在人類的多種腫瘤組織和細胞中存在Bcl-2的過表達，這種表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療抵抗密切相關(guān)［4］。Bcl-2是目前研究最為深入的抗凋亡蛋白之一，能通過與促凋亡蛋白的結(jié)合，抑制促凋亡蛋白的寡聚及隨后的MOMP發(fā)生進而阻斷線粒體途徑的凋亡；此外，Bcl-2還能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的鈣離子信號通路和氧化應激水平等發(fā)揮抗凋亡作用［4-5］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2除了調(diào)控凋亡外，還能調(diào)控細胞自噬，為Bcl-2的功能開拓了新的視野。

2　自　噬

細胞自噬（autophagy）是一個高度保守的代謝過程，通過對細胞內(nèi)物質(zhì)（受損細胞器、衰老細胞器、不需要的大分子及入侵病原體）的降解，釋放出供細胞重新合成所需的氨基酸、核苷酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)及能量以維持細胞的穩(wěn)態(tài)。營養(yǎng)不足、缺氧、感染等都可以誘導細胞自噬［6-7］。細胞自噬開始時，由雙層膜包裹著待降解的物質(zhì)形成自噬小泡（autophagosome），隨后與溶酶體融合，形成自噬溶酶體（autolysosome），在溶酶體水解酶的作用下將包裹的物質(zhì)降解（圖2）。根據(jù)底物進入溶酶體的途徑不同可將自噬分為3類：微自噬、巨自噬和分子伴侶介導的自噬。細胞自噬一方面可以通過為營養(yǎng)物質(zhì)的重新合成提供原料和能量來維持細胞穩(wěn)態(tài)，有利于細胞的生存；另一方面，過度的細胞自噬將導致細胞的死亡。在饑餓等多種情況刺激下，細胞的mTOR絲氨酸/蘇氨酸激酶受到抑制，從而使下游的AGT13去磷酸化后與ATG1激酶和ATG17結(jié)合，進而啟動自噬。在自噬成膜的起始階段，由哺乳動物自噬基因Beclin1等自噬相關(guān)的蛋白組成的復合體至關(guān)重要，包括Beclin1（the mammalian orthologue of ATG6），UVRAG（UV irradiation resistance-associated tumour suppressor gene），Vps15（a myristylated kinase）和HMGB1（highmobility group box 1）等。在自噬膜的延伸階段，有2種泛素樣連接系統(tǒng)參與。一種是在E1樣酶ATG7和E2樣酶ATG10的作用下形成的ATG5-ATG12復合體；另一種是ATG4、ATG7和ATG3等作用下LC3前體轉(zhuǎn)化為酯化的LC3Ⅱ進而連接在自噬體膜上。自噬是一個多基因參與的復雜的細胞調(diào)控過程，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙都會影響自噬的功效［6］。目前研究發(fā)現(xiàn)，細胞自噬幾乎參與了心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、炎癥和衰老等多種生理病理過程，深入研究自噬的發(fā)生和調(diào)控機制，有助于為疾病的診斷和治療提供新的思路和方法［7］。

圖2　細胞自噬的過程［6］

3　Bcl-2與自噬

Bcl-2作為經(jīng)典的抗凋亡蛋白，近來研究發(fā)現(xiàn)其在調(diào)控細胞自噬的過程中也有重要作用。其蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)形成的疏水凹槽除了能結(jié)合含有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，也能與自噬相關(guān)蛋白結(jié)合，從而影響細胞自噬。此外，Bcl-2還能通過多種機制調(diào)控氧化應激，而氧化應激在誘導自噬和凋亡中均發(fā)揮了作用。因此，深入研究以Bcl-2為中心的抗凋亡和抗自噬調(diào)控網(wǎng)絡有助于靶向藥物的開發(fā)和臨床用藥選擇。

3.1Bcl-2與Beclin1Beclin1是與酵母Apg6/Vps30基因同源的哺乳動物自噬基因?；駼eclin1位于人染色17q21，編碼相對分子質(zhì)量為60×103的蛋白質(zhì)。Beclin1在自噬的啟動過程中十分重要，Beclin 1缺陷的小鼠中自噬是不能被激活的。采用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)Beclin1的蛋白水平以后，多種處理因素對自噬的誘導作用均被明顯抑制［8-10］。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2及家族成員Bcl-xl能通過疏水凹槽與Beclin1結(jié)合，從而抑制Beclin1及其復合體誘導自噬的功能（圖3）。多種BH3模擬化合物能通過競爭BH3結(jié)構(gòu)域而打斷Bcl-2/xl與Beclin1的相互作用誘導自噬的發(fā)生［10］。在饑餓條件下，c-Jun氨基末端激酶1（JNK1）的激活能造成Bcl-2的磷酸化，導致Bcl-2與Beclin1的分離及自噬的激活［11］。在心肌母細胞，JNK1的激活可以打斷Bcl-2/Beclin1之間的相互作用，從而促進了細胞自噬發(fā)生，抵抗了心肌細胞凋亡［12］。Strappazzon等［13］發(fā)現(xiàn)在正常情況下，一種能與Beclin1結(jié)合正向調(diào)控自噬的蛋白（AMBRA1）與線粒體上的Bcl-2結(jié)合，而不與Beclin1結(jié)合，當受到自噬啟動信號后，AMBRA1與Bcl-2分離并進而與Bcelin1結(jié)合，促進自噬發(fā)生。此外，具有E3泛素蛋白連接酶活性的Parkin蛋白能夠通過其C端與Bcl-2直接結(jié)合，介導Bcl-2的單鏈泛素化，增強Bcl-2的穩(wěn)定性；過表達Parkin蛋白能顯著增強Bcl-2與Beclin1的相互作用進而抑制自噬［14］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在某些細胞系干擾Beclin1后，Bcl-2抑制劑還是能夠誘導自噬，表明Bcl-2介導的自噬抑制可能有非依賴Beclin1的途徑［15-16］。

圖3　Bcl-2通過Beclin1調(diào)控細胞自噬［17］

3.2Bcl-2與ATG5/ATG12自噬相關(guān)基因5（autophagy-related gene 5，ATG5），是自噬小體膜的重要組成部分。通過ATG5-ATG12復合體的形成，自噬小體得以延伸。缺乏ATG5的小鼠或細胞中，自噬很難被誘導。最近研究發(fā)現(xiàn)ATG5除了參與自噬外，還能通過調(diào)控線粒體上的Bcl-2家族成員Bcl-xl誘導細胞凋亡的發(fā)生［18］。有研究發(fā)現(xiàn)過表達ATG5的細胞對多種死亡誘導因素起到了增敏作用，而下調(diào)ATG5的表達則出現(xiàn)了部分藥物抵抗；進一步研究發(fā)現(xiàn)在多種凋亡刺激的情況下，ATG5的氨基酸末端可以被鈣蛋白酶calpain切去一部分變成剪切的ATG5，剪切的ATG5可以與線粒體上的Bcl-xl結(jié)合從而使促凋亡蛋白解離后寡聚，促進細胞凋亡發(fā)生；Bcl-2的表達可以阻止剪切的ATG5的促凋亡作用。在乳腺癌MCF-7細胞系，干擾Bcl-2的表達能誘導ATG5依賴的細胞自噬發(fā)生［19］，Rubinstein等［20］研究發(fā)現(xiàn)自噬小體延伸過程中的另一個重要分子ATG12能通過其BH3樣的結(jié)構(gòu)域與Bcl-2和Mcl-1結(jié)合，抑制其抗凋亡功能從而促進了細胞死亡。

3.3Bcl-2與ROSROS在誘導細胞凋亡過程中的作用已得到普遍認同，近年來研究發(fā)現(xiàn)ROS也能調(diào)控細胞自噬［21］。ATG4B是哺乳動物自噬發(fā)生過程中的關(guān)鍵酶，其酶活性中心含有受ROS調(diào)控的位點，ROS能通過影響ATG4B的活性調(diào)節(jié)細胞自噬［22］。此外，ROS還能通過調(diào)節(jié)多種磷酸激酶的活性來影響自噬的發(fā)生。從點地梅中提取的具有抗瘤特性的Saxifragifolin D能夠通過ROS誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激進而激活JNK，激活的JNK能使Bcl-2磷酸化后與Beclin1解離，導致自噬的發(fā)生［23］。從皮層根提取的二氯甲烷可以激活ROS依賴的保護性細胞自噬［24］。當ROS造成基因組損失的時候，p53作為轉(zhuǎn)錄因子可以促進下游多個靶基因的表達，進而通過Sestrin1 和Sestrin2抑制mTORC1的活性，啟動自噬［25］。Bcl-2家族抗凋亡蛋白在調(diào)控ROS中具有重要作用［26］。研究發(fā)現(xiàn)采用過表達技術(shù)上調(diào)細胞中Bcl-2的蛋白水平模擬了過表達SOD的作用，顯著降低了細胞內(nèi)的ROS水平，阻止了氧化應激對細胞的損傷，發(fā)揮了抗氧化的作用。Bcl-2與線粒體ROS的調(diào)控密切相關(guān)，定位于線粒體的Bcl-2能夠與GSH結(jié)合，清除線粒體氧化呼吸鏈上漏出的超氧陰離子等ROS；也有研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2能夠影響細胞色素C氧化酶Ⅳ（COXⅣ）的活性進而影響電子呼吸鏈的功能及線粒體超氧陰離子的水平［26］。Ranjan等［27］研究發(fā)現(xiàn)在HEK293T細胞使用HA14-1抑制Bcl-2家族抗凋亡蛋白能誘導ROS依賴的細胞自噬發(fā)生。除了BH3結(jié)構(gòu)域外，Bcl-2介導的ROS變化在調(diào)控自噬和凋亡中的雙重作用也是一個有趣的研究點。

3.4Bcl-2與鈣離子細胞內(nèi)的鈣離子作為一種重要的第二信使，在信號傳導中發(fā)揮著重要作用［28-30］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Bcl-2能夠調(diào)控細胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)，其能通過BH4結(jié)構(gòu)域與細胞內(nèi)鈣庫受體三磷酸肌醇受體（inositol 1，4，5-trisphosphate receptor，IP3R）相互作用抑制鈣離子向胞質(zhì)的釋放［31］；靶向BH4結(jié)構(gòu)域的小肽能通過打斷Bcl-2/IP3R之間的相互作用，促進鈣離子的釋放，并進一步誘導凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，壓力應激下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放不僅能誘導細胞凋亡，還能導致細胞自噬。維生素D3、伊屋諾霉素和毒胡蘿卜內(nèi)酯等能夠通過調(diào)控鈣離子的釋放誘導Beclin1和ATG7依賴的細胞自噬發(fā)生，而定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Bcl-2能通過阻斷鈣離子的釋放而抑制自噬［32-33］。

4　小結(jié)與展望

Bcl-2作為一種既能拮抗凋亡又能拮抗自噬的蛋白，其雙重的調(diào)控作用決定了其信號調(diào)節(jié)通路的復雜性。抑制Bcl-2導致的自噬和凋亡變化的先后順序及最終對細胞死亡的影響也成為了近幾年的研究熱點［33-36］。細胞自噬是與細胞死亡密切相關(guān)的應激反應過程，一方面能促進細胞在壓力狀態(tài)下的存活，一方面也能過度吞噬細胞內(nèi)重要的細胞器和蛋白導致細胞死亡。因此，深入研究Bcl-2抑制劑調(diào)控自噬的機制，不僅有助于從理論水平解析Bcl-2與自噬的相互關(guān)系，尋找新的藥物靶點，同時也有助于克服潛在的治療抵抗問題，為臨床中選擇合適的藥物聯(lián)用方案提供參考。目前，以Bcl-2為靶點開發(fā)的抑制劑已有不少進入了臨床前期實驗，包括GX15-070，AT-101，ABT-263等［1］，在不同腫瘤細胞中均呈現(xiàn)了潛在的抗瘤效應，但也出現(xiàn)了一定的藥物不敏感問題。相信隨著對Bcl-2及家族成員的深入研究，以其為基礎(chǔ)的更多藥物或聯(lián)用方案將造福于腫瘤患者。

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連繼勤，男，1974年生，現(xiàn)任第三軍醫(yī)大學生物化學與分子生物學教研室副主任，副教授，碩士研究生導師?，F(xiàn)任中國生物化學與分子生物學會醫(yī)學生物化學與分子生物學分會青年委員，中國生物化學與分子生物學會教學委員分會青年委員，重慶市生物化學與分子生物學會副秘書長，《第三軍醫(yī)大學學報》、《現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生》等雜志編委。

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.03.001

A

1009-5519（2016）03-0321-04

國家自然科學基金（81572375，31501061）；重慶市自然科學基金項目（cstc2014jcyjA10110）。△

，E-mail：lianjiqin@sina.com。

（2015-12-20）