萬 丹，秦寶福，劉迎賓，張明明，董維平，李 強

(1 西北農(nóng)林科技大學, 陜西 西安 712100 2 天方藥業(yè)有限公司 ，河南 駐馬店 463000)

紅霉素高產(chǎn)菌株的推理選育

萬 丹1,2，秦寶福1，劉迎賓1,2，張明明1,2，董維平1,2，李 強1,2

(1 西北農(nóng)林科技大學, 陜西 西安 712100 2 天方藥業(yè)有限公司 ，河南 駐馬店 463000)

推理選育是一種應(yīng)用廣泛的高通量篩選技術(shù)，本文以紅霉素生產(chǎn)菌紅色鏈霉菌HA-13-36為出發(fā)菌株，經(jīng)過氯化鋰、紫外線、DES三重復(fù)合誘變后，定向篩選耐丙酸鹽高產(chǎn)突變株Ⅰ(B-14-30)，耐紅霉素高產(chǎn)突變株Ⅱ(H-14-05)，再利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將Ⅰ和Ⅱ融合后獲得新的高產(chǎn)融合子R-15-26，該重組子搖瓶效價為6532u/mL，比原始菌株提高了36.2%，比誘變菌株提高23.9% ，比高產(chǎn)突變菌株Ⅰ和Ⅱ分別提高了10.3%和16.0%，且經(jīng)過多次傳代表明具有較強的遺傳穩(wěn)定性，小試效價達到10000u/mL以上。

紅霉素 ； 復(fù)合誘變 ； 抗性篩選 ； 原生質(zhì)體融合

紅霉素 (Erythromycin)是由紅色鏈霉菌所產(chǎn)生的14元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它抗菌譜廣，在臨床和日常生活中具有廣泛應(yīng)用價值[1-3]。目前紅霉素品種存在生產(chǎn)菌種效價低，生產(chǎn)成本高等問題，滿足不了當今市場的需求，因此，選育紅霉素高產(chǎn)菌株是紅霉素生產(chǎn)中需要解決的關(guān)鍵問題。紅霉素菌種的誘變選育方法通常采用UV、快中子、離子束、微波、激光等物理誘變和氯化鋰、亞硝基胍、EMS、DES等化學誘變[4]，隨著環(huán)境的變化，紅霉素的抗性能力顯著提高，單一的誘變方法很難較大程度的提高生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力[5-6]。因此，本文采用氯化鋰、紫外線、DES三重復(fù)合誘變和定向篩選耐丙酸鹽及耐紅霉素高產(chǎn)突變株。最后采用原生質(zhì)體融合技術(shù)[7]，可大大提高獲得高產(chǎn)重組子的幾率，為生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種

天方藥業(yè)菌種中心保藏的紅色鏈霉菌HA-13。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

(1)斜面與平板培養(yǎng)基配比(%)：玉米淀粉1.2，硫酸銨0.5，蛋白胨1.0，玉米漿1.0，氯化鈉0.2，碳酸鈣0.3，瓊脂粉18～22；pH值7.0～7.2。培養(yǎng)條件： 36℃，時間6～8 d。

(2)種子培養(yǎng)基配比(%)：玉米淀粉3.5，黃豆餅粉1.5，蛋白胨0.5，糊精2.0，葡萄糖2.0，氯化鈉0.4，碳酸鈣0.75，硫酸鎂0.05，磷酸氫二鉀0.02，硫酸銨0.75；豆油0.2mL/25 mL，pH值 7.0～7.2。培養(yǎng)條件：溫度34℃，相對濕度40%～60%，周期44～48 h，轉(zhuǎn)速220～240r/min。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基配比(%)：黃豆餅粉4.0，淀粉4.5，硫酸銨0.2，碳酸鈣0.6，葡萄糖 2.0，玉米漿0.2，豆油0．2 mL/25 mL，pH值 6.8～7.0。

培養(yǎng)條件：溫度34℃，相對濕度40%～60%，轉(zhuǎn)速220～240 r/min，周期7 d，發(fā)酵0h和48h加正丙醇適量。

(4)菌絲培養(yǎng)基配比(%)；葡萄糖1，蛋白胨0.4，酵母膏0.4，硫酸鎂0.05 ，磷酸二氫鉀0.2，磷酸氫二鉀0.4。

(5)P培養(yǎng)基配比(%)；蔗糖10.3，硫酸鉀0.025，硫酸二氫鉀0.005，氯化鎂0．08，氯化鈣0.28，pH值7.2。

(6)再生培養(yǎng)基配比(%): 淀粉1.0，蛋白胨，1.0，玉米漿1.0，碳酸鈣0.25，硫酸銨0.3，氯化鈉0.3，蔗糖10.3氯化鈣0.28，氯化鎂0.1。

1.3 紅霉素效價測定方法：磷酸法[8]

1.4 紅霉素誘變及篩選方法

1.4.1 菌種復(fù)壯

取成熟的生產(chǎn)斜面一支，用10mL無菌水把斜面孢子洗下來，稀釋涂布平板，36℃，培養(yǎng)7d，挑選單菌落進行搖瓶初篩、復(fù)篩及遺傳穩(wěn)定性試驗，結(jié)果見表1。

表1 原始菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗

1.4.2 紫外誘變處理

取制備好的菌懸液于直徑為90mm的平底平皿中。紫外燈打開預(yù)熱20min，以穩(wěn)定波長。將盛有菌懸液的平皿放到15W，紫外波長253.7nm的紫外燈下300mm處，打開皿蓋，分別照射30s,45s,60s,75s,90s,105s邊攪拌邊照射，使細胞能夠均勻吸收紫外光線。吸取紫外處理過的菌液，作不同稀釋度，涂皿，同等條件下不經(jīng)紫外線照射過的菌懸液作為對照樣，于36℃倒置培養(yǎng)7天。計算致死率和正突變率，選擇合適的照射劑量。結(jié)果見表2

表2 紫外線輻照時間與孢子致死率和菌株正突變率的關(guān)系

1.4.3 紫外、氯化鋰復(fù)合誘變處理

將紫外誘變60S的孢子菌懸液涂布于濃度為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8% Licl平板培養(yǎng)基上，以涂布在原始分離培養(yǎng)基上的孢子懸浮液作對照，于36℃倒置培養(yǎng)7天。計算致死率和正突變率，選擇合適的Licl濃度。

1.4.5 UV-Licl-DES三重復(fù)合誘變

將經(jīng)UV和Licl復(fù)合誘變的高產(chǎn)菌株進行DES處理，分別振蕩10min、20min、30min、40min、50min、60min，稀釋終止反應(yīng)，涂平板培養(yǎng)。計算致死率和正突變率。獲得的高產(chǎn)突變株作為下一步實驗的出發(fā)菌株。

1.4.6 耐丙酸鹽突變株的篩選

將出發(fā)菌株制成孢子菌懸液，然后均勻涂布在丙酸鹽濃度為0.3%、0.5%、0.8%的選擇性培養(yǎng)基上，以原始分離培養(yǎng)基作為對照，篩選出高產(chǎn)菌株Ⅰ。

1.4.7 耐紅霉素突變株的篩選

將出發(fā)菌株制成孢子菌懸液，然后均勻涂布在紅霉素濃度為5000u/mL、6000u/mL、7000u/mL的紅霉素選擇性培養(yǎng)基上，以原始分離培養(yǎng)基作對照，篩選出高產(chǎn)菌株Ⅱ。

1.4.8 原生質(zhì)體融合

將高產(chǎn)菌株Ⅰ，高產(chǎn)菌株Ⅱ，分別制備孢子菌懸液，然后接入菌絲培養(yǎng)基中，再用蔗糖溶液和P培養(yǎng)基洗滌，使細胞壁和原生質(zhì)體分離，將制備的原生質(zhì)體以1：1的比例在聚乙二醇的促融下進行原生質(zhì)體融合，然后用P溶液稀釋涂布在再生培養(yǎng)基上。挑選穩(wěn)定的融合子進行保藏。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始菌株的復(fù)壯

由表1可以看出，紅霉素生產(chǎn)菌經(jīng)搖瓶初篩、復(fù)篩及傳代實驗后，有三個單菌落的效價較高，選取效價最高且穩(wěn)定的HA-13-36作為下一步實驗的出發(fā)菌株。

2.2 紫外線和氯化鋰誘變處理結(jié)果

菌株HA-13-36孢子菌懸液經(jīng)過不同的紫外誘變處理后，結(jié)果見表2，紫外誘變60s時，致死率達到78.5%，據(jù)文獻報道[9]，紫外誘變致死率在70%～80%時，產(chǎn)生正突變的幾率高?？紤]到后續(xù)的誘變處理，最佳誘變時間為60S。復(fù)合誘變結(jié)果見表3。

表3 紅霉素不同誘變處理結(jié)果

由表3可以看出，復(fù)合誘變比單獨紫外誘變正變率要高，經(jīng)紫外60s+Licl0.9%處理后搖瓶效價和正突變率最高。

2.3 UV-Licl-DES三重復(fù)合誘變處理結(jié)果

菌株HA-13-36經(jīng)UV60S+licl0.9%處理后，然后加入0.1%的DES進行處理，DES處理40min的效果最為理想，誘變株U-14-30效價達到5267u/mL,由表4可以看出比出發(fā)菌株提高了9.88%。

2.4 抗性突變株的誘變結(jié)果比較

出發(fā)菌株U-14-30制成的孢子菌懸液，分別涂布于丙酸鹽和紅霉素梯度平板上，經(jīng)過篩選，確定丙酸鹽濃度為0.5%，紅霉素添加濃度為6000u/mL,經(jīng)過搖瓶初篩復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性考察，分別獲得耐丙酸鹽突變株B-14-30，耐紅霉素突變株H-14-05，結(jié)果見表4。

表4 復(fù)合誘變和抗性突變株生產(chǎn)能力比較

2.5 高產(chǎn)融合子的篩選結(jié)果

原生質(zhì)體融合過程中的溶菌酶質(zhì)量濃度為1.2mg/mL,34℃.酶解50min,突變株B-14-30和突變株H-14-05經(jīng)原生質(zhì)體融合再生后，涂布高滲培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，篩選出穩(wěn)定的高產(chǎn)融合子R-15-26，效價達到6532u/mL，比出發(fā)菌株提高了36.2%。結(jié)果見表5。

表5 菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗

2.6 FUS-50L(A)生物反應(yīng)器發(fā)酵結(jié)果

為進一步考察突變菌株R-15-26的生產(chǎn)能力及其遺傳穩(wěn)定性，將其F1-F3各代的菌種經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后接進 FUS-50L(A)生物反應(yīng)器進行發(fā)酵，放罐效價見表6。 從表6可以看出：突變菌株R-15-26 F1-F3代在 FUS-50L(A)生物反應(yīng)器上的發(fā)酵放罐效價與原始出發(fā)菌株HA-13-36相比，均有不同程度的提高，并且各代之間差異較小，說明融合子R-15-26生物學遺傳特性是相對穩(wěn)定的。

表6 FUS-50L(A)生物反應(yīng)器發(fā)酵結(jié)果

3 討論

(1) 三重復(fù)合誘變能使紅霉素生產(chǎn)菌多種基因位發(fā)生變異，多種誘變劑交互作用[10]，能提高篩選紅霉素高產(chǎn)菌株的幾率。

(2) 在紅霉素生物合成過程中，紅霉內(nèi)酯的碳架來源于丙酸鹽和丙酰CoA[11]，添加丙酸鹽對甲基丙二酰-CoA合成途徑有不同的調(diào)控作用，增加丙酸鹽的濃度有可能提高紅霉素的產(chǎn)率?？股貙ψ陨懋a(chǎn)生菌的生長繁殖具有抑制作用，并對終產(chǎn)物具有反饋調(diào)節(jié)作用[12]，篩選紅霉素耐受菌株，會解除終產(chǎn)物的反饋抑制，從而提高紅霉素的產(chǎn)量。

(3)將兩種誘變方法獲得的突變株進行原生質(zhì)體融合，提高了獲得高產(chǎn)融合子的幾率，有效的提高了菌種的代謝能力，豐富了基因庫的內(nèi)容，是一種比較理想的微生物育種方法，在生產(chǎn)上具有一定的推廣應(yīng)用價值。

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(本文文獻格式：萬 丹，秦寶福，劉迎賓.紅霉素高產(chǎn)菌株的推理選育[J].山東化工，2016，45(08)：65-67.)

Rational Selection of Erythromycin High-producing Strains

Wan Dan1,2, Qin Baofu1,2, Liu Yingbin1,2,Zhang Mingming1,2，Dong Weiping1,2,Li Qiang1,2

(1 Northwest A&F University Xi,an 712100，China；2 Henan Topfond Pharmaceutical Company Limited， Zhumadian 463000，China)

Reasoning breeding is a kind of widely used high-throughput screening technology, based on the production of erythromycin bacterium Streptomyces red HA-13-36 for starting strain, after uv and lithium chloride and DES triple compound mutagenesis, directional filter resistance to sodium propionate high yield mutant strainsⅠ(B - 14-30), erythromycin resistance and high yield mutant strainsⅡ(H - 14-05), reuse of protoplast fusion technology of new production after merge theirⅠandⅡR-15 -26, the reorganization of the son shake flask titer of 6532 u/mL, than the original strains increased by 36.2%, 23.9% higher than that of mutation strains, than the high yield mutant strainⅠandⅡincreased by 10.3% and 16.0% respectively, and after many batches showed strong genetic stability, small titer reached more than 10000 u/mL.

erythromycin ；copound mutation ；resistance screening；protoplast fusion

2016-03-09

萬 丹(1981—)，女，河南扶溝人，學士學位，工程師，主要從事微生物遺傳育種及發(fā)酵工藝優(yōu)化研究；通訊作者：秦寶福(1968—)，西北農(nóng)林科技大學生命科學學院副教授，主要從事微生物資源、發(fā)酵工程等領(lǐng)域的研發(fā)工作

Q93

B

1008-021X(2016)08-0065-03