王麗，何萍，孫建超，王豫萍，程明亮

(貴州醫(yī)科大學臨床檢驗學院，貴陽 550004)

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藍莓花青素對氧化應激誘導肝星狀細胞活化、增殖和凋亡的影響及機制探討

王麗，何萍，孫建超，王豫萍，程明亮

(貴州醫(yī)科大學臨床檢驗學院，貴陽 550004)

目的觀察藍莓提取物花青素對氧化應激誘導肝星狀細胞HSC-T6活化、增殖的影響，并探討其作用機制。方法取對數(shù)生長期HSC-T6細胞分為觀察組、對照組、空白組，觀察組先加入600 μg/mL藍莓花青素干預24 h后，加葡萄糖氧化酶(GO)100 U/L孵育3 h，對照組加入GO 100 U/L孵育3 h,空白組不做任何處理。干預24 h時采用細胞免疫化學法檢測各組α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，ELISA法檢測胞質(zhì)Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)；采用MTT法觀察各組細胞增殖情況，采用流式細胞儀觀察各組細胞凋亡情況；采用硫代巴比妥酸法檢測各組胞質(zhì)丙二醛(MDA)，黃嘌呤氧化酶法檢測各組胞質(zhì)SOD，微量酶標法測定各組胞質(zhì)谷胱甘肽(GSH)。結(jié)果干預24 h時，各組α-SMA相對表達量為空白組<觀察組<對照組，P均<0.05。干預24 h時，觀察組細胞增殖率低于對照組，P<0.05。干預24 h時，觀察組細胞凋亡率高于其余兩組，P均<0.05。干預24 h時，觀察組胞質(zhì)MDA低于對照組(P<0.05)，SOD、GSH均高于空白組(P均<0.05)。結(jié)論藍莓花青素可抑制氧化應激誘導的肝星狀細胞的活化與增殖,并促進細胞凋亡；其機制可能與抑制胞質(zhì)內(nèi)MDA表達，促進SOD、GSH表達有關。

肝星狀細胞；藍莓；花青素；氧化應激；α-平滑肌肌動蛋白；Ⅰ型膠原；細胞增殖；細胞凋亡

肝纖維化是指肝臟內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)(特別是膠原物質(zhì))過度沉積，是機體對各種病因引起的慢性肝損傷后一種損傷性修復反應[1]。氧化應激是導致肝損害的重要機制之一[2, 3]。肝星狀細胞(HSC)活化和增殖可促進肝纖維化[4]，α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原(ColⅠ)是臨床常用的細胞活化指標。藍莓富含花青素、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化成分。其中花青素具有抗氧化、促進腫瘤細胞凋亡、保護肝臟、降低DNA氧化損傷的功能[5, 6]，是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的最有效的天然水溶性自由基清除劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，藍莓可預防CCl4所致的大鼠急、慢性肝損傷[7～9]，但其具體有效成分目前尚不明確。2015年4～12月，我們觀察了藍莓花青素對氧化應激誘導肝星狀細胞HSC-T6活化、增殖的影響，并探討其可能的機制?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料HSC-T6購自中國科學院上海分院(貨號：BRL3A)；藍莓由貴州省麻江縣藍莓生產(chǎn)基地提供，由中國科學院天然產(chǎn)物重點化學研究實驗室提取藍莓花青素[10]。胎牛血清(杭州四季青公司)，低糖DMEM(Hyclone公司)，葡萄糖氧化酶(GO，美國Sigma公司)，MTT(美國Sigma公司)，α-SMA單克隆抗體(美國Abcam公司)，DAB顯色試劑盒(中杉金橋公司)，辣根過氧化酶標記的二抗(中杉金橋公司)；二甲基亞砜(美國Sigma公司)，蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶公司)，ColⅠ試劑盒(武漢基因美生物公司)，丙二醛(MDA)、SOD、胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成生物公司)，Annexin V、 FITC凋亡試劑盒(日本同仁化學研究所)。二氧化碳培養(yǎng)箱(WJ-3，上海躍進醫(yī)療器械廠)，倒置顯微鏡(CKX41+DP25,日本Olympas公司)，熒光顯微鏡(日本Olympas公司)，超純水儀(英國ELGA公司)，-80 ℃低溫冰箱(日本Sanyo公司)，酶標儀(美國BioTek公司)，超凈工作臺(SW-CJ-1FD，蘇州凈化設備有限公司)，YHF7F-1LCantoTMⅡ流式細胞分析儀(美國BD公司)。

1.2HSC-T6分組及處理取對數(shù)生長期的適量HSC-T6常規(guī)復蘇，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中隔天換液。待細胞長滿80%～90%時，0.25%胰酶消化傳代。以7.5×103/孔接種于96孔板中，將細胞分為觀察組、對照組、空白組，觀察組先加入600 μg/mL藍莓花青素干預24 h后，加GO 100 U/L孵育3 h，對照組加入GO 100 U/L孵育3 h,空白組不做任何處理，三組均置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)備用。

1.3HSC-T6活化情況觀察干預24 h時,采用細胞免疫化學法檢測HSC-T6中α-SMA表達。取對數(shù)生長期各組細胞,4×104/mL接種于96孔板中，每組6個復孔。PBS輕洗，4%多聚甲醛固定，0.1%Triton X-100破膜，羊血清封閉；加入α-SMA一抗(1∶100)4 ℃過夜，Envision二步法顯色。胞質(zhì)染成棕黃色者為陽性細胞，采用Image-pro-plus分析積分光密度(IOD)，以IOD值代表α-SMA的相對表達量。干預24 h時，采用ELISA法檢測HSC-T6胞質(zhì) ColⅠ含量。另取各組細胞12×104/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，PBS沖洗，利用蛋白提取試劑盒提取胞質(zhì)蛋白，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測HSC-T6胞質(zhì)ColⅠ的相對表達量，所有操作嚴格按照使用說明書進行。

1.4HSC-T6增殖情況觀察采用MTT法。干預24 h時，取對數(shù)生長期各組細胞接種于96孔板，7.5×103/孔，每組6個復孔。用PBS輕洗，加入低糖DMEM 180 μL和5 mg/mL MTT 20 μL繼續(xù)孵育4 h。棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。采用酶標儀測量各組在490 nm處的光密度(OD)值，重復3次，取平均值計算各組細胞增殖率。細胞增殖率=(觀察組OD值-陰性對照OD值)/陰性對照OD值×100%。

1.5HSC-T6凋亡情況觀察采用流式細胞儀。干預24 h時，取對數(shù)生長期的各組細胞，調(diào)整細胞密度為1×106/mL。各取100 μL加入 Annexin V FITC結(jié)合物和PI Solution各5 μL，渦旋混勻后避光溫孵育15 min。48 h后采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，采用BD FACSDIVA軟件對結(jié)果進行分析，計算細胞凋亡率。

1.6HSC-T6胞質(zhì)MDA、SOD、GSH蛋白檢測干預24 h時，取對數(shù)生長期各組細胞，采用硫代巴比妥酸法檢測各組胞質(zhì)MDA含量；黃嘌呤氧化酶法檢測各組胞質(zhì)SOD活性；微量酶標法測定各組胞質(zhì)GSH含量，所有操作嚴格按照使用說明書進行。各組均隨機選取30個視野采集圖像，用以上MDA、SOD、GSH的陽性與所占整個圖像的百分比來表示MDA、SOD、GSH的表達量。

2　結(jié)果

2.1 各組α-SMA及胞質(zhì)ColⅠ表達比較干預24 h時，觀察組、對照組、空白組α-SMA相對表達量分別為0.032±0.007、0.053±0.002、0.013±0.005;組間比較，P均<0.05。干預24 h時，觀察組、對照組、空白組胞質(zhì)ColⅠ相對表達量分別為808.47±10.14、1 037.04±106.47、687.47±11.4；對照組高于空白組(P<0.05)，觀察組低于對照組(P<0.05)。

2.2各組細胞增殖率比較干預24 h時，觀察組、對照組、空白組的細胞增殖率分別為0.830%±0.061%、1.050%±0.06%、0.800%±0.015%，觀察組細胞增殖率明顯低于對照組(P<0.05)，觀察組細胞增殖率與空白組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.517)。

2.3各組細胞凋亡率比較干預24 h時，觀察組、對照組、空白組細胞凋亡率分別為64.03%±1.50%、39.03%±1.57%、36.5%±0.70%，觀察組細胞凋亡率高于其余兩組(P均<0.05)，對照組與空白組間差異無統(tǒng)計學意義。

2.4各組胞質(zhì)MDA、SOD、GSH表達比較見表1。

表1　干預24 h時各組胞質(zhì)MDA、SOD、GSH表達量比較

注：與空白組比較，#P<0.05；與對照組比較，△P<0.05。

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激反應是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中造成HSC激活的一個重要因素。受損肝細胞損傷部位聚集的炎性細胞和激活的Kuffer細胞均釋放活性氧簇(ROS)，ROS可通過旁分泌方式激活HSC，并導致HSC進一步釋放ROS，致使HSC細胞增殖、產(chǎn)生大量膠原蛋白、基質(zhì)降解失衡、增強血管收縮性、增加肝內(nèi)血流壓力等，從而加快肝纖維化形成進程。以往研究認為，肝纖維化逆轉(zhuǎn)主要與激活狀態(tài)HSC轉(zhuǎn)為靜止狀態(tài)有關;但Iredale等[11]研究認為，活化HSC數(shù)量減少與凋亡有關。HSC凋亡可使活化HSC數(shù)量減少，膠原蛋白合成減少，使肝纖維化得以逆轉(zhuǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素、草蓯蓉等生物堿和黃酮類化合物可通過減輕細胞過氧化損傷、抑制肝細胞凋亡從而抑制HSC活化或者促進活化型HSC凋亡[12,13]。α-SMA是HSC活化的標志[14]，常作為HSC激活標志物。氧化應激可導致HSC合成以ColⅠ及Col Ⅲ為主的多種細胞外基質(zhì)[15]，是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。氧化應激主要表現(xiàn)為氧化與抗氧化反應失衡，其中MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，是連接氧化應激損傷與肝纖維化之間的橋梁，MDA含量高低間接反映細胞氧化損傷程度[16]。初級抗氧化防御系統(tǒng)主要分為酶類和非酶類抗氧化系統(tǒng)，其代表物質(zhì)分別為SOD、GSH。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。GSH是一種由3個氨基酸組成的小分子肽，是體內(nèi)重要的抗氧化劑和ROS清除劑，可與ROS、重金屬等結(jié)合，把機體內(nèi)有害的毒物轉(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)排泄出體外。

野生藍莓富含花青素，花青素是一種特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，是種天然抗氧化劑。研究發(fā)現(xiàn)，花青素能夠抑制環(huán)磷酰胺誘導的心肌損傷[13]。陳琦等[17]研究發(fā)現(xiàn),花青素對正常細胞也具有抑制增殖和促進凋亡作用。王琴等[18]研究發(fā)現(xiàn)，600 μg/mL紫甘薯花色苷對DPPH自由基清除率達到90.69%。本課題組前期研究表明，藍莓可通過下調(diào)Bcl-2、降低Bcl-2/Bax值誘導HSC凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，干預24 h時各組α-SMA相對表達量為空白組<觀察組<對照組,說明氧化應激模型制作成功；干預24 h時，觀察組細胞增殖率明顯低于對照組,干預24 h時觀察組細胞凋亡率明顯高于其余兩組，干預24 h時，觀察組SOD、GSH均高于空白組，說明花青素可降低MDA,減輕肝細胞線粒體的氧化應激水平，促進SOD與GSH表達，提高細胞抗氧化能力。

綜上所述，藍莓花青素可抑制氧化應激誘導的HSC活化、增殖，促進細胞凋亡；其機制可能與抑制胞質(zhì)MDA表達且促進SOD、GSH表達有關。

[1] Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury [J]. J Biol Chem, 2000,275(4):2247-2250.

[2] Poli G. Pathogenesis of liver fibrosis: role of oxidative stress [J]. Mol Aspects Med, 2000,21 (3):79-98.

[3] Nieto N, Friedman SL, Cederbaum AI. Stimulation and proliferation of primary rat hepatic stellate cells by cytochrome P450 2E1-derived reactive oxygen species [J]. Hepatology, 2002,35(1):62-73.

[4] Gebhardt R. Oxidative stress, plant-derived antioxidants and liver fibrosis [J]. Planta Med, 2002,68(4):289-296.

[5] Del BC, Riso P, Campolo J, et al. A single portion of blueberry (Vaccinium corymbosum L) improves protection against DNA damage but not vascular function in healthy male volunteers [J]. Nutr Res, 2013,33(3):220-227.

[6] Adams LS, Phung S, Yee N, et al. Blueberry phytochemicals inhibit growth and metastatic potential of MDA-MB-231 breast cancer cells through modulation of the phosphatidylinositol 3-kinase pathway [J]. Cancer Res, 2010,70(9):3594-3605.

[7] Wang Y, Cheng M, Zhang B, et al. Dietary supplementation of blueberry juice enhances hepatic expression of metallothionein and attenuates liver fibrosis in rats [J]. PLoS One, 2013,8(3):58659.

[8] Wang YP, Cheng ML, Zhang BF, et al. Effect of blueberry on hepatic and immunological functions in mice [J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2010,9(2):164-168.

[9] Wang YP, Cheng ML, Zhang BF, et al. Effects of blueberry on hepatic fibrosis and transcription factor Nrf2 in rats [J]. World J Gastroenterol, 2010, 16(21):2657-2663.

[10] 劉仁道,張猛. 藍莓果實花青素提取及定量方法的比較[J].園藝學報,2008,35(5):655-660.

[11] Iredale JP, Benyon RC, Pickering J, et al. Mechanisms of spontaneous resolution of rat liver fibrosis. Hepatic stellate cell apoptosis and reduced hepatic expression of metalloproteinase inhibitors [J]. J Clin Invest, 1998,102(3):538-549.

[12] Wang Y, Wang R, Wang Y, et al. Ginkgo biloba extract mitigates liver fibrosis and apoptosis by regulating p38 MAPK, NF-kappaB/IkappaBalpha, and Bcl-2/Bax signaling [J]. Drug Des Devel Ther, 2015(9):6303-6317.

[13] He YJ, Kuchta K, Lv X, et al. Curcumin, the main active constituent of turmeric (Curcuma longa L.), induces apoptosis in hepatic stellate cells by modulating the abundance of apoptosis -related growth factors [J]. Z Naturforsch C, 2015,70(11-12):281-285.

[14] Sato M, Suzuki S, Senoo H. Hepatic stellate cells: unique characteristics in cell biology and phenotype[J]. Cell Struct Funct, 2003,28(2):105-112.

[15] Brown B, Lindberg K, Reing J, et al. The basement membrane component of biologic scaffolds derived from extracellular matrix [J]. Tissue Eng, 2006,12(3):519-526.

[16] Cassiman D, Libbrecht L, Desmet V, et al. Hepatic stellate cell/myofibroblast subpopulations in fibrotic human and rat livers [J]. J Hepatol, 2002, 36(2):200-209.

[17] 陳琦,王利,李少偉,等. 藍莓花青素對腎小球系膜細胞增殖與凋亡作用[J].生物技術(shù),2013，23(5)：38-42.

[18] 王琴,溫其標.紫甘薯花色苷光譜特性及抗氧化性的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(11)：67-72.

[19] 陸爽,程明亮,楊德猛，等.藍莓對大鼠肝星狀細胞T6凋亡及Bcl-2、Bax表達的影響[J].中華醫(yī)學雜志,2015，95(31)：35-38.

Effects of blueberry anthocyanins on activation and proliferation of oxidative stress-induced rat hepatic stellate cells

WANGLi,HEPing,SUNJiangchao,WANGYuping,CHENGMingliang

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

ObjectiveTo investigate the effects of blueberry anthocyanins on the activation, proliferation and apoptosis of oxidative stress-induced rat hepatic stellate cells (HSC-T6) and the correlated mechanisms. MethodsHSC-T6 cells in the logarithmic phase were divided into the observation group, control group and the blank group, respectively. The observation group was incubated with 100 μg/mL U/L GO for 3 hours after blueberry anthocyanin intervention of 24 hours, the control group was incubated with 100 U/L GO for 3 hours, and the blank group without any treatment. After 24-hour intervention, the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) in HSC-T6 cells was measured by immunohistochemistry, the cytosolic collagen I (Col I) level was detected by ELISA, the cell proliferation was detected by MTT, the apoptosis of HSC-T6 was detected by flow cytometry, the level of MDA was measured by thiobarbituric acid method, and the activity of superoxide dismutase (SOD) and the level of GSH were detected by xanthine oxidase and enzyme linked immunosorbent assay, respectively. ResultsAfter intervention of 24 h, the expression level of α-SMA in each group was blank group

hepatic stellate cells; blueberry; anthocyanins; oxidative stress; α-smooth muscle actin; collagen I; cell proliferation; apoptosis

國家自然科學基金資助項目(81460125)；貴州省留學人員科技活動項目(20151010)；貴州省科技廳中藥現(xiàn)代項目(黔科合ZY字-2012-3017)；貴州省省長基金項目(黔省專合字2012-44)。

王麗(1987-)，女，碩士研究生，研究方向為肝纖維化的治療。E-mail： 81393551@qq.com

簡介：程明亮(1957-)，男，博士，博士生導師，教授，研究方向為肝纖維化及病毒性肝炎的治療。E-mail： chengml@21cn.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.003

R575.2

A

1002-266X(2016)18-0008-03

2016-01-06)