龐　坤

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000)

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磷脂酶A2改性蛋黃磷脂的研究

龐坤

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000)

天然磷脂的親水性差，采用磷脂酶對(duì)其進(jìn)行酶法改性可提高乳化性和穩(wěn)定性，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。本研究利用自制的磷脂酶A2發(fā)酵蛋黃磷脂，通過(guò)反應(yīng)時(shí)間、酶濃度、底物濃度、鈣離子濃度、起始pH值、溫度等單因素實(shí)驗(yàn)和多因素正交實(shí)驗(yàn)，確定最適的反應(yīng)條件，為實(shí)際生產(chǎn)利用提供參考。結(jié)果表明， 20g蛋黃底物，反應(yīng)時(shí)間4h，磷脂酶A2水解蛋黃磷脂條件的最佳配比為：起始溫度40℃、pH值8.0、酶濃度0.15IU/mL、鈣濃度30mmol/L，此條件下生成的溶血磷脂轉(zhuǎn)化率為80%左右。

蛋黃磷脂；磷脂酶A2；酶改性

磷脂為含有磷酸的類(lèi)脂化合物，是生物細(xì)胞膜的主要構(gòu)成成分，具有維持生物膜的活性、參與神經(jīng)細(xì)胞間的信息傳遞、調(diào)節(jié)機(jī)體的新陳代謝等功能[1]。它以乳化劑、抗氧化劑、營(yíng)養(yǎng)保健品等廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。但是天然磷脂的親水性較差，現(xiàn)在常采用酶法改性的方法，即利用磷脂酶水解磷脂，使之轉(zhuǎn)化成溶血磷脂，從而提高其穩(wěn)定性和乳化性。因此，自20世紀(jì)90年代磷脂的改性成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。但是這些研究大多集中在大豆磷脂上，對(duì)蛋黃磷脂的改性研究很少。

本實(shí)驗(yàn)以蛋黃為對(duì)象，利用重組變鉛青鏈霉菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)出的PLA2進(jìn)行水解反應(yīng)，通過(guò)底物、酶、CaCl2、pH、溫度、時(shí)間等單因素實(shí)驗(yàn)和多因素正交實(shí)驗(yàn)研究蛋黃磷脂改性的最佳反應(yīng)條件，為生產(chǎn)實(shí)踐提供數(shù)據(jù)參考。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

試劑：卵磷脂(上海伯奧生物科技有限公司)；磷脂酶A2(實(shí)驗(yàn)室自制，源自含高拷貝PLA2基因質(zhì)粒的重組變鉛青鏈霉菌)；NaOH、CaCl2等，市售分析純。

儀器：奧豪斯電子精密天平，85-2型上海司樂(lè)恒溫磁力攪拌器，北京長(zhǎng)風(fēng)電熱恒溫水浴鍋，上海百典大振幅恒溫冷凍搖床，日立 CR-21G 高速冷凍離心機(jī)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1磷脂酶A2發(fā)酵液的制備重組變鉛青鏈霉菌孢子按照0.05%接種于2%黃豆餅粉培養(yǎng)基，28℃搖床，180r/min，培養(yǎng)48h形成種子液。在同樣的條件下，種子液按照5%的接種量再連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，制備的培養(yǎng)液8000 r/min離心，上清液即含有磷脂酶A2的發(fā)酵液。

1.2.2發(fā)酵液磷脂酶A2活力的測(cè)定3mL發(fā)酵液和27mL 0.35%卵磷脂懸液在冰浴中混合均勻，平均分裝到6支試管中。3支試管(反應(yīng)管)放在50℃水浴中，另外3支試管(對(duì)照管)放在冰浴中。15min后將3支反應(yīng)管迅速放入冰浴中。分別向?qū)φ展芎头磻?yīng)管中加50μl 1%酚酞指示劑，再用已標(biāo)定的4mmol/L NaOH溶液去滴定反應(yīng)管，直至反應(yīng)管與對(duì)照管的顏色相同，根據(jù)滴定所消耗NaOH的體積V(mL)計(jì)算發(fā)酵液的酶活力。酶活力(IU)為每分鐘水解1微摩爾卵磷脂所需的酶量。

酶活力(IU)=4×V/(15×3/6)

1.2.3蛋黃的酶解實(shí)驗(yàn)為了使磷脂水解為溶血磷脂，實(shí)驗(yàn)利用磷脂酶A2發(fā)酵液處理蛋黃。試驗(yàn)分為六組單因素實(shí)驗(yàn)和1組正交實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)一定的時(shí)間后，用已標(biāo)定的4mmol/L NaOH滴定反應(yīng)中生成的游離脂肪酸量，進(jìn)而計(jì)算溶血磷脂(LPC)的轉(zhuǎn)化率。

1.2.3.1時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響在250mL的三角瓶中，配制20g蛋黃、30mmol/L CaCl2、0.10IU/mL酶濃度，pH值=6.0，總體積為100mL的反應(yīng)體系，180r/min，40℃振蕩培養(yǎng)6h。每隔1h取200μL反應(yīng)液稀釋至5mL，放在冰浴中，加1%酚酞指示劑50μl，4mmol/L NaOH滴定至微紅色。NaOH消耗的體積V(mL)(V =各時(shí)間段滴定消耗的NaOH體積-0h滴定消耗的NaOH的體積)。

1.2.3.2酶濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響配制100mL反應(yīng)體系，其中底物20g蛋黃，CaCl2濃度30mmol/L，pH=6.0，酶濃度設(shè)5個(gè)梯度，分別為0.05IU/mL、0.10IU/mL、0.15IU/mL、0.20IU/mL、0.25IU/mL。40℃條件下，180r/min振蕩培養(yǎng)4h。在0h和4h時(shí)間段分別取200μL反應(yīng)液稀釋后滴定(試驗(yàn)操作同1.2.3.1)。NaOH消耗的體積V(mL)(V =4h滴定消耗的NaOH體積-0h滴定消耗的NaOH的體積)。

1.2.3.3底物濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響底物蛋黃分別以10g、15g、20g、25g、30g，30mmol/LCaCl2，0.10 IU/mL酶濃度，pH值=6.0的100mL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件、操作方法和計(jì)算同1.2.3.2。

1.2.3.4鈣離子濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響100mL反應(yīng)體系中底物蛋黃20g，酶濃度0.10IU/mL，pH=6.0 ，CaCl2濃度分別加入0、10、20、30、40、50mmol/L，反應(yīng)條件、操作方法和計(jì)算同1.2.3.2。

1.2.3.5起始pH值對(duì)酶解反應(yīng)的影響20g蛋黃，30mmol/L CaCl2，0.10IU/mL酶濃度的100mL反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)起始pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。反應(yīng)條件、操作方法和計(jì)算同1.2.3.2。

1.2.3.6溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響100mL反應(yīng)體系中，20g蛋黃，酶濃度0.10IU/mL，CaCl2濃度30mmol/L，pH值=6.0，設(shè)定溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃，反應(yīng)條件、操作方法和計(jì)算同1.2.3.2。

1.2.3.74因素3水平正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在底物蛋黃20g的100mL反應(yīng)體系中，選擇酶濃度、鈣離子濃度、起始pH、溫度為影響因素，180r/min振蕩培養(yǎng)4h，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，從而確定含有磷脂酶A2的發(fā)酵液水解蛋黃磷脂的最優(yōu)反應(yīng)條件。

表1　L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.3.8 數(shù)據(jù)計(jì)算游離脂肪酸(FFA)的生成量(μmol)=NaOH的摩爾濃度×(4h時(shí)NaOH滴定體積—0h時(shí)NaOH滴定體積)×100×25/(蛋黃的質(zhì)量×5)

LPC轉(zhuǎn)化率(%)=蛋黃水解后生成的FFA量×100%/(蛋黃完全水解后生成的FFA量×蛋黃中PC的含量)

為了計(jì)算LPC轉(zhuǎn)化率，實(shí)驗(yàn)中采用蛋黃含10%的PC，1g PC完全水解釋放1200μmol FFA 。即 LPC轉(zhuǎn)化率(%)= 蛋黃水解后生成的FFA量×100%/(1200×10%)。

2　結(jié)果與分析

2.1底物濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

圖1底物濃度對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響圖2酶濃度對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響

由圖1可以看出，隨著底物濃度的增加，NaOH消耗量逐漸增加，LPC的轉(zhuǎn)化率逐漸降低。磷脂酶A2水解磷脂的反應(yīng)為一界面反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，易在反應(yīng)體系均勻分散，反應(yīng)界面較大，反應(yīng)程度高。但是隨著底物濃度的增加，底物之間相互包埋，不易分散，因此造成反應(yīng)難度增大，反應(yīng)程度降低[2]。

2.2酶濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)速度隨著磷脂酶A2濃度的增加而增加，LPC的轉(zhuǎn)化率也逐漸升高。但酶濃度達(dá)到0.10IU/mL時(shí)，反應(yīng)基本平衡，LPC轉(zhuǎn)化率已接近最大值。由于反應(yīng)界面面積一定，部分酶分子飽和反應(yīng)的油水界面，阻止其它的酶分子達(dá)到反應(yīng)界面，導(dǎo)致反應(yīng)出現(xiàn)飽和現(xiàn)象[3]，F(xiàn)ujita S在研究動(dòng)物磷脂酶的試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的情況[4]。

2.3CaCl2濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響Ca2+濃度與LPC轉(zhuǎn)化率關(guān)系的曲線呈拋物線形式，當(dāng)Ca2+濃度為30mmol/L時(shí)，LPC的轉(zhuǎn)化率最大。Ca2+結(jié)合在磷脂酶A2的活性中心上，是酶必需的輔助因子，不能由其它離子代替[5]。一些學(xué)者認(rèn)為Ca2+對(duì)維持酶高級(jí)結(jié)構(gòu)具有非常重要的作用，在反應(yīng)過(guò)程中，它還可以幫助磷脂酶A2從產(chǎn)物中分離出來(lái)，再重新催化化學(xué)反應(yīng)[6]。Ca2+濃度的大小對(duì)磷脂酶A2催化的反應(yīng)有兩種不同的影響。低濃度時(shí)，Ca2+濃度增加反應(yīng)速度加快；但Ca2+濃度過(guò)高，磷脂酶A2因鹽析作用活性下降，從而反應(yīng)速度降低。此外，大量的Ca2+也影響產(chǎn)品的品質(zhì)[7]。

圖3CaCl2濃度對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響圖4起始pH對(duì)酶解反應(yīng)的影響

2.4起始pH對(duì)酶解反應(yīng)的影響

pH=7.0時(shí)，磷脂酶A2活性最好，LPC的轉(zhuǎn)化率最大。pH的作用機(jī)制很復(fù)雜，對(duì)酶和底物都有影響，pH過(guò)高或過(guò)低都將降低反應(yīng)速度[8]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)室自制的磷脂酶A2有較寬的適用范圍，在pH5.0～9.0區(qū)間都有很強(qiáng)的酶活性，與Yoshinori M的研究結(jié)果類(lèi)似[9]。

2.5反應(yīng)溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

溫度升高LPC轉(zhuǎn)化率也隨之升高，當(dāng)溫度大于50℃時(shí)，LPC轉(zhuǎn)化率開(kāi)始降低。這是因?yàn)闇囟壬?，反?yīng)體系的粘度降低，擴(kuò)散系數(shù)增大，促進(jìn)反應(yīng)體系的分散，有利于反應(yīng)的進(jìn)行[10]。但是反應(yīng)溫度過(guò)高，磷脂酶A2變性失活，導(dǎo)致反應(yīng)速度降低。另外，高溫容易使磷脂氧化變質(zhì)，影響其品質(zhì)。

圖5反應(yīng)溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響圖6反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響

2.6反應(yīng)時(shí)間對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響

磷脂酶A2水解蛋黃磷脂的反應(yīng)速度較快，在4h內(nèi)反應(yīng)基本結(jié)束。實(shí)驗(yàn)室制備的磷脂酶A2在較短的時(shí)間內(nèi)可以迅速完成反應(yīng)，防止了蛋黃的腐敗變質(zhì)，適用于工業(yè)生產(chǎn)。

2.7正交試驗(yàn)結(jié)果

使用軟件SPSS13.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)正交分析設(shè)計(jì)和方差分析，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示酶濃度達(dá)到了顯著水平(P<0.05)，對(duì)酶解反應(yīng)的影響最大；其它影響因素(起始pH、溫度、鈣濃度)都沒(méi)有達(dá)到顯著水平。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，最終確定磷脂酶A2水解蛋黃磷脂的最佳配比為A3B3C2D2，即0.15IU/mL酶濃度、起始pH8.0，40℃溫度，30mmol/L鈣濃度。在這種優(yōu)化的條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn)，LPC轉(zhuǎn)化率在80%左右。

表2　正交試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3　討論

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要關(guān)注大豆磷脂的研究，而雞蛋磷脂因成本較高很少涉及。中國(guó)的雞蛋產(chǎn)量居世界首位，資源豐富，具有巨大的特色開(kāi)發(fā)潛力。我們可以利用磷脂酶A2對(duì)蛋黃進(jìn)行處理，制備酶改性蛋黃磷脂，從而提高雞蛋的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

實(shí)驗(yàn)中的磷脂酶A2來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室自制的重組變鉛青鏈霉菌。該菌株發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，可以通過(guò)大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)大量的磷脂酶A2。因此，以蛋黃為底物進(jìn)行磷脂酶A2水解反應(yīng)，不僅發(fā)酵工藝簡(jiǎn)化，生產(chǎn)成本大大降低，而且磷脂也有較高的轉(zhuǎn)化率，為實(shí)際生產(chǎn)利用創(chuàng)造了條件。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)證明，與普通的磷脂相比較，酶改性蛋黃磷脂在乳化性、抗溫性、抗pH性等方面均有明顯的優(yōu)勢(shì)。

[1]楊望生.磷脂的界面和膠體性質(zhì)及生物學(xué)意義[J].表面活性劑工業(yè)，1991,5(1)：1-3.

[2]梁岐，王利，陶紅.大豆磷脂酶水解技術(shù)研究[J].中國(guó)油脂，2003,28(7)：58-60.

[3]Morgado M ,Cabarl J M S，Prazeres D M F.Hydrolysis by phospholipase A2 in mixed micelles of Licithin and sodium dioctyl sulphosuccinate[J].Chem Tech Biotechnol，1995，63(3)：181-189.

[4]Fujita S.Surface activity of the lipid prodcts hydrolyzed with lipase and phospholipase A2[J].JAOCS，1990，67(12)：1008-1014.

[5] Masanori S，Kazuhiro O，Miho I.A novel prokaruotic phospholipase A2 characterization gene cloning and solution struct ure [J].The Joumal of Biological Chemistry，2002，277(22) ： 20051-20058.

[6]Rafael A C, Mahendra K J, Gerard H D.Origin of the latency phase during the action of phospholipase A2 on unmodified phosphatidylcholine vesicle[J].Biochimica et Biophysica Acta, 1982，688(2)：349-356.

[7]汪勇，王興國(guó).濃縮磷脂的酶法改性研究[J].中國(guó)油脂，2002，27(2)：83-86.

[8]Christian E，Dutilh，Walter Groger.Improvement of product attributes of mayonnaise by enzymic hydrolysis of egg yoik with phospholipase A2[J].Sci Food Agric，1981(8)，32：451-458.

[9]Yoshinori M.Structural and functional changes of hen's egg yolk low density lipoproteins with phospholipase A2[J].Agric Food Chem，1997，45(5)：4558-4563.

[10]Ohshima A，Narita H，Kato M.Phopholipid reverse micelles as milieu of an enzyme reaction in apolar system[J].Biochem，1983，93(5)：1421-1425.

(編輯：嚴(yán)佩峰)

The Study On Enzymic Modification of Egg Yolk Phospholipids With Phopholipase A2

PANG Kun

(College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Xinyang Agriculture and Forestry University，Xinyang 464000,China)

The hydrophilic property of natural phospholipids is poor, and it can be improved by using phospholipase to improve the emulsifying property and stability, and expand the application range. In this study, phospholipase A2 homemade fermented egg yolk phospholipids, by reaction time, enzyme concentration, substrate concentration, calcium ion concentration, initial pH, temperature and other single factor and multi-factor orthogonal experiment to determine the optimal reaction conditions and provide a reference for the actual production use. The results showed that, 20g egg yolk substrate, the reaction time 4h, the best ratio of phospholipase A2 yolk phospholipids conditions as follows: starting temperature 40 ℃, pH value 8.0, the enzyme concentration 0.15IU / mL, calcium concentration 30mmol / L, this lysophospholipid produced under the conditions of conversion was about 80%.

egg yolk phospholipids；phospholipase A2 ；an enzyme modified

2016-01-20

龐坤 (1977—)，女，河南永城市人，碩士，講師，研究方向：動(dòng)物生理生化.

TQ645.96

A

2095-8978(2016)02-0098-04