安徽 吳志強

微生物實驗室培養(yǎng)的知識要點解讀

安徽 吳志強

根據(jù)近年高考全國卷命題特點和規(guī)律，微生物的實驗室培養(yǎng)有關(guān)知識的考查更加注重與之相關(guān)的基礎(chǔ)知識，并突出重點，主要涉及培養(yǎng)基、無菌技術(shù)、微生物的純化培養(yǎng)以及實驗注意事項等方面。因此在復(fù)習(xí)中，要將這幾點的基礎(chǔ)知識梳理清晰，不需要對知識點挖掘得很深，但需要適當(dāng)拓展視野。同時側(cè)重于實驗的回顧與溫習(xí)，特別注意各個實驗的設(shè)計流程、操作要領(lǐng)、結(jié)果分析和方法改進等方面的內(nèi)容。

一、微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)基

微生物培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。值得提出的是，在固體培養(yǎng)基上，微生物可以形成肉眼可見的菌落。比如肺炎雙球菌中的S型菌和R型菌。無論是哪種類型的培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽四種營養(yǎng)物質(zhì)。為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)就是碳源，可以是無機碳源，如CO2、NaHCO3等，也可以是有機碳源，如糖類、蛋白質(zhì)或脂肪等。具體碳源的選擇是需要根據(jù)培養(yǎng)的微生物來決定的，如異養(yǎng)微生物只能利用有機碳源。為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)就是氮源，如N2（固氮微生物）、氨基酸、蛋白質(zhì)和各種含氮的無機鹽等。除了這四種營養(yǎng)物質(zhì)外，培養(yǎng)基還需要考慮酸堿度、氣體的含量以及特殊營養(yǎng)物質(zhì)等。

【例1】甲、乙、丙是三種微生物，下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用來培養(yǎng)微生物的三種培養(yǎng)基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生長繁殖；甲能在Ⅰ中正常生長繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生長繁殖，甲、丙都不能。下列說法正確的是（ ）

粉狀硫__ _10 g __ CaCl20.5 gⅠ+ + + + - + + +Ⅱ+ + + - + + + +Ⅲ__+ ___+ __+ + ____+ __+ __+ __+ K2HPO44 g__ _ FeSO40.5 g_蔗糖10 g ___（NH4）2SO40.4 g___ H2O 100 mL MgSO49.25 g

A. 甲、乙、丙都是異養(yǎng)微生物

B. 甲、乙都是自養(yǎng)微生物、丙是異養(yǎng)微生物

C. 甲是固氮微生物、乙是自養(yǎng)微生物、丙是異養(yǎng)微生物

D. 甲是異養(yǎng)微生物、乙是固氮微生物、丙是自養(yǎng)微生物

【解析】本題考查微生物的營養(yǎng)，屬于對識記層次的考查。甲能在Ⅰ和Ⅲ培養(yǎng)基中生長繁殖，不能在Ⅱ培養(yǎng)基中生長繁殖，說明甲是固氮微生物；乙能在Ⅱ和Ⅲ培養(yǎng)基中生長繁殖，不能在Ⅰ培養(yǎng)基中生長繁殖，說明乙是自養(yǎng)微生物；丙能在Ⅲ培養(yǎng)基中生長繁殖，而不能在Ⅰ和Ⅱ培養(yǎng)基中生長繁殖，說明丙是異養(yǎng)微生物。

【答案】C

二、微生物培養(yǎng)的無菌技術(shù)

在微生物培養(yǎng)過程中，最為關(guān)鍵的就是防止外來雜菌的入侵，最常用的方法就是消毒與滅菌。消毒是一種較為溫和的方法，一般采用物理或化學(xué)方法，如煮沸消毒法、紅外線消毒、化學(xué)藥劑（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒，這種方法僅僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分雜菌微生物，但是雜菌微生物的芽孢和孢子不能被殺死。滅菌的效果要強烈得多，一般使用強烈的理化方法，如灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌等方法，殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

【例2】在對微生物接種時，若不進行嚴(yán)格無菌操作，對實驗結(jié)果影響最大的一項是 （ ）

A. 將少許干酵母加入到新鮮的葡萄汁中

B. 將毛霉菌液接種在切成小塊的鮮豆腐上

C. 將轉(zhuǎn)基因植物葉片接種到無菌培養(yǎng)基上

D. 將土壤浸出液涂布在無菌的選擇培養(yǎng)基上

【解析】本題考查無菌操作的相關(guān)知識，屬于對識記、理解層次的考查。作為植物組織培養(yǎng)，要求非常嚴(yán)格的無菌環(huán)境，如果滅菌不徹底，培養(yǎng)過程中存在污染，會造成培養(yǎng)的幼苗生長緩慢甚至培育失敗。首先，污染的雜菌與幼苗競爭培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，同時細(xì)菌和真菌生殖比植物快得多，這會導(dǎo)致幼苗死亡。其次，雜菌可能寄生于植物體內(nèi)，利用植物細(xì)胞的營養(yǎng)合成雜菌自身物質(zhì)，導(dǎo)致幼苗死亡。此外，污染菌的基因可通過某種暫時未知細(xì)節(jié)的機制裝入植物細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)，從而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。不進行嚴(yán)格滅菌對葡萄酒的制作和臭豆腐的制作影響都不是很大，因為一般的雜菌在這些環(huán)境中很難生存。

【答案】C

三、微生物培養(yǎng)的純化

在實際生產(chǎn)過程中，很多時候都是需要對微生物進行純化。微生物在純化時，常用的方法是平板劃線法和稀釋涂布平板法。這兩種方法都使聚集在一起的多種微生物分散成單個個體，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種。平板劃線法是用接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)，分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。

【例3】要想檢測并純化土壤中細(xì)菌，下列實驗操作的敘述錯誤的是 （ ）

A. 用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板

B. 取104、105、106倍的土壤稀釋液和無菌水各0.1 mL，分別涂布于各組平板上

C. 將實驗組和對照組平板倒置，37℃恒溫培養(yǎng)24～48小時

D. 確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的實驗

組平板進行計數(shù)

【解析】檢測并純化土壤中的細(xì)菌，首先用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板，取104、105、106倍的土壤稀釋液和無菌水各0.1 mL，分別涂布于各組平板上，將實驗組和對照組平板倒置，37℃恒溫培養(yǎng)24～48小時，在確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在30～300的一組平板為代表進行計數(shù)。所以D的表述錯誤。

【答案】D

四、微生物培養(yǎng)實驗的注意事項

微生物培養(yǎng)實驗中，有很多事項需要注意。比如菌種的臨時保存方法，將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在適宜的溫度下培養(yǎng)成菌落后，再將菌種放入低溫（4℃）中保存。這種方法的缺點是保存的時間不長，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。一般在低溫保存半年后，需要將菌種重新接種保存。因此，對需要長期保存的菌種，最好采用甘油管藏的方法（菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶，－20℃的冷凍箱中保存）。再比如，滅菌后培養(yǎng)基冷卻到55℃后應(yīng)及時進行倒平板操作。如果不能及時操作，需要將培養(yǎng)基放到55℃左右的電熱箱中保溫，以防止瓊脂凝固。還有實驗結(jié)束后，所有用過的培養(yǎng)基、培養(yǎng)液等需要統(tǒng)一進行高壓蒸汽滅菌后再丟棄，以免造成環(huán)境污染等。

【例4】利用微生物分解玉米淀粉生產(chǎn)糖漿，具有廣闊的應(yīng)用前景。但現(xiàn)在野生菌株對淀粉的轉(zhuǎn)化效率低，某同學(xué)嘗試對其進行改造，以獲得高效菌株，其設(shè)計實驗步驟如下。

（1）配置________（填“固體”“半固體”或“液體”）培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的碳源應(yīng)為_______。

（2）將________接入已滅菌的培養(yǎng)基平板上。如果在實驗中需要檢測培養(yǎng)基是否被污染，對固體培養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測方法是________。

（3）立即用適當(dāng)劑量的紫外線照射，其目的是_______ _______________。

（4）通常，對獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小等菌落特征對細(xì)菌進行初步的________。

（5）菌落形成后，加入碘液，觀察菌落周圍培養(yǎng)基的顏色變化和變化范圍的大小。周圍出現(xiàn)_______現(xiàn)象的菌落即為初選菌落。經(jīng)分離、純化后即可達(dá)到實驗?zāi)康摹?/p>

（6）實驗最后，使用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過_______處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴散。

【解析】利用微生物分解玉米淀粉生產(chǎn)糖漿，第一步應(yīng)是配制固體培養(yǎng)基，其碳源是玉米淀粉；其次要將野生菌株接種到培養(yǎng)基上；用紫外線照射的目的是對野生菌株進行誘變處理；加碘液是為了檢驗淀粉有沒有被分解，如果顏色變淺，說明淀粉被分解了，這種菌落即為初選菌落。對獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小等菌落特征對細(xì)菌進行初步的鑒定。培養(yǎng)大腸桿菌時，在接種前需要檢測培養(yǎng)基是否被污染。對固體培養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測方法是將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適宜的時間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生。因為有的微生物會釋放一種強烈的毒素或者對環(huán)境造成影響，因此，使用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過滅菌處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴散。

【答案】（1）固體 玉米淀粉 （2）野生菌株 將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適宜的時間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生 （3）對野生菌株進行誘變 （4）鑒定（或分類） （5）淺色范圍大 （6）滅菌

對微生物的培養(yǎng)的相關(guān)知識，除了上述幾點外，有時也會以果酒、果醋或腐乳的制作作為試題考查背景材料，結(jié)合微生物的培養(yǎng)應(yīng)用進行綜合考查。這就需要廣大師生，在平時的復(fù)習(xí)中，要特別留意相關(guān)知識間的聯(lián)系，如，微生物的營養(yǎng)與代謝聯(lián)系、微生物發(fā)酵條件的控制等。

（作者單位：安徽省蕪湖市第十二中學(xué)）