■ 田海軍李世偉2（ 信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 464000；2 廈門利洋水產(chǎn)科技有限公司 350200）

一例氣單胞菌引起池塘草魚死亡案例

■ 田海軍1李世偉12（1 信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 464000；2 廈門利洋水產(chǎn)科技有限公司 350200）

圖1 發(fā)病草魚

圖2 病原菌分離與純化培養(yǎng)

圖3 分離菌革蘭氏染色

草魚，屬于鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬，俗稱鯇魚。因其生長迅速、餌料來源廣泛，并且生長迅速、產(chǎn)量高，成為中國淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一。草魚是我國特有魚類，但以其獨特的食性和覓食手段從而被當(dāng)做拓荒者移植到世界各地。草魚養(yǎng)殖過程中容易患上爛腮、腸炎、赤皮、病毒性出血病等多種疾病，細(xì)菌性病原致病的情況很嚴(yán)重，因此，通過對草魚細(xì)菌性疾病的病原菌分離與鑒定對草魚病害的防治具有較大意義。

1 材料和方法

1.1 發(fā)病草魚

今年3月，廣東珠海一草魚養(yǎng)殖池塘開始出現(xiàn)草魚死亡，池塘面積8畝，3臺葉輪式增氧機(jī)，水深1.8 m，7,500 kg魚，養(yǎng)殖前沒有清塘，從3月中期開始，每天死亡十幾條，觀察發(fā)病草魚，魚體表發(fā)紅，尾鰭發(fā)白，鰓蓋、鰭條充血，剪開肚子有腹水，肝臟發(fā)黑，腸空、發(fā)紅（如圖1）。

1.2 實驗材料

LB固體培養(yǎng)基、70%酒精、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、壓蒸汽滅菌鍋、顯微鏡、培養(yǎng)皿、燒杯、研缽、試管、接種環(huán)、酒精燈等。

1.3 病原菌的分離與純化培養(yǎng)

在無菌條件下，先用70%酒精對魚體表面消毒，然后分別取草魚的肝臟、腎臟、脾臟于無菌研缽中搗碎。

分別加少量無菌水后分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

選取平板上的優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，最終培養(yǎng)至3～5代后獲得形態(tài)一致的純菌落。

選取單個菌落經(jīng)過涂片、HE染色、鏡檢，確認(rèn)為純培養(yǎng)物。

選取一個優(yōu)勢菌落，在LB固體培養(yǎng)基斜面上-80℃冰箱保存（通過抑制酶的活性來抑制細(xì)胞的生命活動的方式延長細(xì)胞存活時間），備用。

1.4 分離菌菌落觀察

將純培養(yǎng)物接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察并記錄培養(yǎng)出的細(xì)菌菌落特征。將獲得的純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色：在載玻片上加1滴無菌水，用接種環(huán)挑取少許菌落與無菌水混合并進(jìn)行均勻涂布；經(jīng)自然干燥、火焰固定后，用草酸銨結(jié)晶紫染液染色1～2min，加水沖洗；再加革蘭氏碘液后1～2min，加水沖洗，再加復(fù)紅酒精染液等50～60s后加水沖洗；等待干燥后鏡檢。菌體被染成紫藍(lán)色為陽性，被染成紅色則為陰性。

1.5 病原菌的鑒定

采用API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)，這是同時能測定20項以上生化指標(biāo)，可用做快速鑒定細(xì)菌的長形卡片（21cm×4.5cm，法國生產(chǎn)），上面排列著20個塑料管，管內(nèi)加有適量糖類等生化反應(yīng)的干粉（有標(biāo)簽表明）以及反應(yīng)產(chǎn)物的顯色劑。每份產(chǎn)品都有薄膜覆蓋，這樣保證無雜菌污染。

使用時，首先打開內(nèi)部附有的一瓶無菌基本培養(yǎng)基（液體），用來稀釋待鑒定的純菌落；

把配制成的濃度適中的細(xì)菌懸液用無菌滴管逐個以0.1ml的量加入到每個小管中；

在經(jīng)過24～28h保溫后，觀看每個小管是否發(fā)生了顯色反應(yīng)；

將結(jié)果記錄在相應(yīng)表格中，然后按照規(guī)定對結(jié)果進(jìn)行編碼、查檢索表，就可以獲得該菌種的鑒定結(jié)果。

1.6 藥敏試驗

藥敏試驗采用的是紙片法（購自杭州某微生物試劑公司），選用在生產(chǎn)上常用的藥物進(jìn)行試驗研究。

首先進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，用無菌生理鹽水洗后吸取0.2mL菌液在LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行均勻涂布。

貼上藥敏紙片，設(shè)4個平行實驗組。

放置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

觀察有無抑菌圈產(chǎn)生，同時記錄抑菌圈直徑，計算其平均值；然后再重復(fù)做1次實驗；最后依據(jù)抑菌圈直徑比值照判斷標(biāo)準(zhǔn)得到藥敏實驗結(jié)果。

1.7 臨床用藥

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果和池塘情況使用藥物治療

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離與純化培養(yǎng)結(jié)果

在LB固體培養(yǎng)基上形成菌落為其菌落形態(tài)：圓形、圓滑、濕潤邊緣整齊、微凸、半透明、灰白色至淡黃色中等大小的菌落，易挑?。ㄒ妶D2）。

2.2 分離菌鏡檢結(jié)果

革蘭染色陰性，短桿菌，懸滴標(biāo)本觀察動力，運動活潑（見圖3）。

2.3 分離菌生理生化試驗結(jié)果(見表1)

表1 細(xì)菌生理生化試驗結(jié)果

2.4 藥敏試驗結(jié)果

分離菌藥敏試驗結(jié)果（見表2）。

表2 藥敏試驗結(jié)果

2.5 臨床治療結(jié)果

用藥：第1d， 陰雨天，死亡15條左右，上午10點，使用諾氟沙星、鹽酸小檗堿混合制劑（1包）拌兩包料。

第2d，陰雨天，死亡6條，下午17點，諾氟沙星、鹽酸小檗堿混合制劑（1包）拌1包料。

第3d，陰天，死亡6、7條，上午10點喂諾氟沙星、鹽酸小檗堿混合制（劑1包）拌2包料。

草魚死亡量明顯減少得到控制。

3 討論

根據(jù)分離菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生化特性等試驗結(jié)果確定該分離病原菌為氣單胞菌。氣單胞菌，廣泛分布于自然界中，能從表層和地下來源的飲用水中分離出該菌，氣單胞菌屬已經(jīng)被國際上列為腸道致病菌之一，是危害草魚的主要病原菌之一，感染后可發(fā)生胃腸炎、外傷感染和敗血癥并具有高死亡率。試驗從草魚的肝脾腎等組織中分離出了氣單胞菌，為臨床治療提供了理論依據(jù)。但由于時間等多種條件限制，不能做回歸實驗。

由藥敏試驗結(jié)果可知病原菌對諾氟沙星、鹽酸小檗堿、氟甲喹、恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感。臨床上選用這些高敏藥物進(jìn)行治療，根據(jù)藥物特性采用了拌料口服的方式。諾氟沙星（Norfloxacin）化學(xué)名為1-乙基-6-氟-1，4-二氫-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸，作用原理為通過作用于細(xì)菌DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，是氟喹諾酮類抗菌藥，對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高。鹽酸小柴堿是小檗堿（Berberine）的鹽酸鹽（俗稱鹽酸黃連素），小檗堿分子式[C20H18NO4]+，是一種異喹啉生物堿，又稱黃連素，存在于小檗科等4科10屬的許多植物中，抗菌譜廣，體外對多種革蘭陽性及陰性菌均具抑菌作用，臨床主要用于腸道感染及菌痢等。

具體治療：因前期沒有清塘，草魚出現(xiàn)死亡后用了絮凝的凈水產(chǎn)品，使塘底滋生了更多的有害細(xì)菌。后來又用了很多殺蟲的藥物，破壞了水體的生態(tài)平衡，加上一直陰雨天氣，池塘自凈能力差，溶氧一直不高，建議首先控制好死亡量，然后改善好池塘環(huán)境，最后再根治魚病。在注意增氧的前提下連續(xù)3d每天1包鰓皮腸利康拌料，草魚食欲恢復(fù)，死亡數(shù)量明顯減少。

氣單胞菌致病是由多種致病因子協(xié)同作用的結(jié)果，指導(dǎo)臨床用藥時為防止濫用抗生素而引起的病原菌抗藥性問題，對分離的病原菌用藥敏試驗測定后再合理選用藥物治療才能達(dá)到最好的效果。該菌以往被認(rèn)為是低毒力條件性病原菌，但近年來該菌引起感染性疾病的報道日益增多，并對多種抗生素產(chǎn)生不同程度的耐藥性，需要加以重視，注意衛(wèi)生等各方面管理。臨床上，早發(fā)現(xiàn)，早治療，防止多種病原交叉感染，提高機(jī)體抵抗力，科學(xué)養(yǎng)殖。（參考文獻(xiàn)略）