劉學(xué)良，彭建華，周　沖，徐　斌，秦興虎，劉　亮

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，四川瀘州 646000)

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·技術(shù)與方法·

載脂蛋白-J質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs及其在靶細(xì)胞中的表達(dá)*

劉學(xué)良，彭建華，周沖，徐斌，秦興虎，劉亮△

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，四川瀘州 646000)

目的對比pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒在不同DNA濃度條件下轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，并測定載脂蛋白-J的表達(dá)情況。方法0.8、1.2、1.6、2.0 μg pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒分別在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并在熒光顯微鏡下觀察，確定24、48、72 h時轉(zhuǎn)染率,篩選出能獲得最高轉(zhuǎn)染率的質(zhì)粒的量。設(shè)置pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒組、空pEGFP-N1質(zhì)粒組、空白對照組，用蛋白免疫印跡法檢測載脂蛋白-J在24、48、72 h 3個時間點的表達(dá)情況。結(jié)果4個不同質(zhì)粒濃度組轉(zhuǎn)染率分別為：(16.7±1.0)%、(19.7±1.4)%、(30.1±3.6)%、(21.7±5.5)%，比較4個組間轉(zhuǎn)染效率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且1.6 μg pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒組轉(zhuǎn)率最高。通過蛋白免疫印跡法檢測后，3個目的蛋白灰度值與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)灰度值相比較，蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平為：pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒組1.91±0.12，空pEGFP-N1質(zhì)粒組0.56±0.11，空白對照組0.57±0.17，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ可在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染入大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,攜帶載脂蛋白-J基因的靶細(xì)胞可表達(dá)載脂蛋白-J。

載脂蛋白類；間質(zhì)干細(xì)胞；載脂蛋白-J；重組質(zhì)粒；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；轉(zhuǎn)染；蛋白免疫印跡法

載脂蛋白J(ApoJ)是一種新型糖蛋白，它是一種分子量為70×103的二聚體蛋白質(zhì),廣泛分布于人體各種組織,以腦含量最多。相關(guān)研究顯示ApoJ在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有高表達(dá)[1]。ApoJ功能廣泛，在神經(jīng)系統(tǒng)方面對神經(jīng)元有保護(hù)作用，有利于神經(jīng)元的可塑性等生理過程[2]。細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是采用某種方法和途徑將外源分子如DNA、RNA等導(dǎo)入特定的細(xì)胞,并表達(dá)目的基因，產(chǎn)生特定功能的蛋白質(zhì)分子。本實驗在于不同量質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，并檢測ApoJ的表達(dá)情況，以獲得高轉(zhuǎn)染效率，篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1大鼠BMSCs和質(zhì)粒大鼠BMSCs，由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心贈送。含綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ及空質(zhì)粒pEGFP-N1，由吉凱基因有限公司提供。

1.1.2主要試劑脂質(zhì)體LipofectaminTM2000(碧云天) α-MEM培養(yǎng)基,胎牛血清(Gibson公司)；高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(solaria);一抗-兔抗鼠ApoJ抗體-Clustering Antibody(Proteintech)；3-磷酸甘油醛脫氫酶(anti-GAPDH)(Proteintech)；二抗-羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(Proteintech)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒(solaria)；電泳蛋白彩色預(yù)染Marker(thermo);電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液(Millipore)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代及培養(yǎng)細(xì)胞株從液氮中取出后迅速復(fù)蘇，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)[3]。待骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)生長至80%～90%融合度時，按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2脂質(zhì)體介導(dǎo)不同質(zhì)量的質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs細(xì)胞接種到6孔板融合達(dá)90%左右時即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 d換液。 轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞2遍。準(zhǔn)備好滅菌的1.5 mL Eppendorf管，分別將0.8、1.2、1.6、2.0 μg pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒用α-MEM培養(yǎng)基稀釋至200 μL(每管都標(biāo)為①)，混合均勻。方法同上，將3.0 μL LipofectaminTM2000 用α-MEM培養(yǎng)基稀釋至200 μL(每管都標(biāo)為②),室溫條件下孵育5 min。將①號管與②號管中培養(yǎng)基均勻混合，使總體積為400 μL，混合物在室溫條件下孵育20 min。轉(zhuǎn)染分為4組(按前文質(zhì)粒濃度分別為A1、A2、A3、A4組)，每組6孔，將含不同pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒量的轉(zhuǎn)染復(fù)合物分別加入到相對應(yīng)的孔中轉(zhuǎn)染(并在6孔板上做好標(biāo)記)；將轉(zhuǎn)染處理過后的細(xì)胞置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5～6 h后更換無雙抗含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.3測定轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染24、48、72 h后將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察，觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)，在10個細(xì)胞分別均勻分布的視野下用100倍鏡觀察,該孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為10個視野轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞數(shù)之和除以細(xì)胞總數(shù)之和的值。

1.2.4脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs轉(zhuǎn)染分為a組、b組和c組(每組6孔)，a組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ(加入質(zhì)粒的量與1.2.2實驗中轉(zhuǎn)染效率最高組相同)；b組為對照,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1(所用空質(zhì)粒的量與a組所用質(zhì)粒的量相同)；c組為空白對照,加入等量的脂質(zhì)體。余下步驟與1.2.2中均相同。分別在24、48、72 h時間點將各組細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5蛋白質(zhì)的提取及蛋白免疫印跡法檢測ApoJ的表達(dá)分別在轉(zhuǎn)染24、48、72 h 3個時間點,采用標(biāo)準(zhǔn)裂解法[3]提取蛋白。然后，應(yīng)用Western blot對Apo-J進(jìn)行檢測:檢測蛋白濃度，制膠；上樣分別加入：Marker，A組、B組和C組的蛋白提取物，行SDS-PAGE蛋白電泳；室溫封閉1 h；兔抗鼠ApoJ抗體一抗(1:1 000)4 ℃孵育過夜，羊抗兔IgG二抗(1:1 500)室溫孵育2 h，曝光，顯影，拍照。內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。根據(jù)實驗結(jié)果重復(fù)實驗,計算機(jī)Quantity-one軟件分析灰度值，以目的片段的灰度值與相應(yīng)GAPDH灰度值的比作為兩者蛋白質(zhì)的相對水平。

2　結(jié)　　果

2.1大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察將細(xì)胞置于光學(xué)顯微鏡下100倍觀察，大鼠BMSCs貼壁生長，形態(tài)為多角形和扁平形。細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)4～6 d可達(dá)90%左右融合，形態(tài)變?yōu)殚L梭形。第3～4代后細(xì)胞形態(tài)擠壓成束狀，細(xì)胞胞質(zhì)豐富，核大，核仁明顯，細(xì)胞形態(tài)相對穩(wěn)定，見圖1。

A:4～6 d；B：3～4代。

圖1大鼠BMSCs(×50)

A～F、M～R：熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞；G～L、S～X：可見光下觀察轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞。A、G，D、J,M、S，P、V：轉(zhuǎn)染24 h后的觀察結(jié)果；B、H，E、K，N、T，Q、W：轉(zhuǎn)染48 h后的觀察結(jié)果；C、I，F(xiàn)、L，O、U，R、X：轉(zhuǎn)染72 h后的觀察結(jié)果。

圖2綠色熒光蛋白在大鼠BMSCs中的表達(dá)(×100)

2.2轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白的觀察及轉(zhuǎn)染效率的測定在適宜條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并在24、48、72 h 時間點將細(xì)胞置于熒光顯微鏡100倍下觀察各組熒光蛋白的表達(dá)情況，各組間表達(dá)綠色熒光蛋白的陽性細(xì)胞在數(shù)量上存在著差異(圖2)。3.0 L LipofectaminTM2000脂質(zhì)體分別與0.8、1.2和1.6 μg pGFP-N1-apoJ質(zhì)粒混合作用轉(zhuǎn)染后，表達(dá)綠色熒光蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，脂質(zhì)體與1.6 μg pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白表達(dá)最多，分別在3個時間段獲得最高的轉(zhuǎn)染效率27.8%、28.2%、34.3%。當(dāng)參與轉(zhuǎn)染的pGFP-N1-apoJ質(zhì)粒量增加到2.0 μg時，表達(dá)陽性細(xì)胞的數(shù)沒有提高，表現(xiàn)出降低的趨勢(圖3)。不同質(zhì)粒濃度組間的轉(zhuǎn)染效率不全相同，分別為A1組[(16.7±1.0)%]、A2組[(19.7±1.4)%]、A3組[(30.1±3.6)%]、A4組[(21.7±5.5)%]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3最佳濃度重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs后觀察采用3.0 μL脂質(zhì)體與1.6 μg的重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒配制成復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染后分別在24、48、72 h 后在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞熒光的表達(dá)情況，見圖4。

圖3　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs的轉(zhuǎn)染效率

2.4ApoJ表達(dá)情況分析Western blot法檢測到在24、48、72 h 3個時間點，a組在相對分子質(zhì)量70×103處可見大量ApoJ表達(dá)，b組及c組見微量ApoJ表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=215.646，P<0.05)；各組蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平分別為：a組1.91±0.12、b組0.56±0.11、c組0.57±0.17，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5～7。

A～F：熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞；G～L：可見光下觀察轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞；A、G、D、J：轉(zhuǎn)染24 h后的觀察結(jié)果；B、H、E、K：轉(zhuǎn)染48 h后的觀察結(jié)果；C、I、F、L：轉(zhuǎn)染72 h后的觀察結(jié)果。

圖4最佳濃度質(zhì)粒及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，綠色熒光融合蛋白的表達(dá)(×100)

圖5　　Western blot檢測轉(zhuǎn)染24 h后ApoJ表達(dá)

圖6　　Western blot檢測轉(zhuǎn)染48 h后ApoJ表達(dá)

圖7　　Western blot檢測轉(zhuǎn)染72 h后ApoJ表達(dá)

3　討　　論

BMSCs在骨髓組織中含量最為豐富，它作為干細(xì)胞具有多向分化的潛能[4-5]。BMSCs具有易獲得、低免疫原性等特性，在良好的培養(yǎng)條件下可以誘導(dǎo)分化為特定類型和有功能的神經(jīng)元并且通過獨立的調(diào)節(jié)機(jī)制完成向神經(jīng)元分化[6-9]，以及容易被外源基因轉(zhuǎn)染并能相對穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，所以它可以被作為一種良好介質(zhì)應(yīng)用于基因及細(xì)胞治療等方面[10-11]。脂質(zhì)體水相內(nèi)核是由磷脂雙層構(gòu)的[12-13]，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染具有以下優(yōu)點[14]。操作簡單、安全性高，能夠感染分裂細(xì)胞也能感染非分裂細(xì)胞，攜帶外源基因大小不受限制等特點。基于這些優(yōu)勢脂質(zhì)體被選為基因轉(zhuǎn)染的載體。

該實驗證明攜帶相關(guān)基因的質(zhì)粒能夠在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下對大鼠BMSCs能進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過該實驗可以發(fā)現(xiàn)影響脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染因素主要有質(zhì)粒的濃度、脂質(zhì)體濃度、孵育時間等，其中質(zhì)粒濃度尤為關(guān)鍵。探索并優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件后發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒濃度過低時，轉(zhuǎn)染效率低，而濃度過高時，轉(zhuǎn)染效率反而降低。當(dāng)質(zhì)粒濃度低時，脂質(zhì)體不能充分有效的攜帶質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，故轉(zhuǎn)染效率低；當(dāng)質(zhì)粒濃度過高時，容易增加細(xì)胞毒性導(dǎo)致細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)染效率也低[15]。合適的質(zhì)粒和脂質(zhì)體比例下，脂質(zhì)體可高效的介導(dǎo)外源性質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染BMSCs。與此同時本實驗說明BMSCs成功地與攜帶Apo-J外源性基因的質(zhì)粒結(jié)合后能有效的表達(dá)目的蛋白。為進(jìn)一步探索攜載脂蛋白-J基因BMSCs的后續(xù)基因工程相關(guān)實驗奠定了基礎(chǔ)。

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The expression of Apo-J plasmid of target cells in rat bone marrow mesenchymal stem after transfection*

LiuXueliang,PengJianhua,ZhouChong，XuBin,QinXinghu,LiuLiang△

(DepartmentofNeurosurgery,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo compare the transfection efficiency of BMSCs transfected with pEGFP-N1-apoJ plasmid in different DNA concentration,and the expression of Apo-J was determined.MethodsThe pEGFP-N1-apoJ plasmid was transfected into BMSCs by Liposome which the quality respective is 0.8,1.2,1.6,2.0 μg respectively,and we observed by fluorescence microscope,determined the transfection efficiency at 24,48,72 h,and screened out the amount of plasmid that could get the highest transfection efficiency.Then we set pEGFP-N1-apoJ plasmid group,empty pEGFP-N1 plasmid group,blank control group.The expression of Apo-J at 3 time points was detected by Western blot.ResultsThe transfection efficiency of 4 different plasmid concentration groups were:(16.7±1.0)%,(19.7±1.4)%,(30.1±3.6)%,(21.7±5.5)%.There was significant difference in transfection efficiency among 4 groups(P<0.05).And the transfection rate of the 1.6 μg pEGFP-N1-apoJ plasmid group was the highest.After the detection by Western blot,the relative expression level of protein was as follow:PEGFP-N1-apoJ plasmid group 1.91±0.12,empty pEGFP-N1 plasmid group 0.56±0.11,blank control group 0.57±0.17,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionPlasmid pEGFP-N1-apoJ might be transfected into rat BMSCs by liposome.The target cells carrying the Apo-J gene can express Apo -J.

apolipoproteins；mesenchymal stem cells；apolipoprotein-J；recombinant plasmid；BMSCs;transfection；Western blot

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.022

四川省教育廳重點項目課題(12ZA075)；瀘州市科技局課題(2011-I-S45)。 作者簡介：劉學(xué)良(1986-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷與腫瘤研究。△

，E-mail:liust@163.com。

Q782

A

1671-8348(2016)14-1942-03

2015-11-15

2016-01-31)