魯赤姣，王文淵

(1 湖南永州市產(chǎn)商品檢驗(yàn)所，湖南　永州　425100；2 湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南　永州　425100)

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六味補(bǔ)血顆粒中芍藥苷和阿魏酸含量的測(cè)定

魯赤姣1，王文淵2

(1 湖南永州市產(chǎn)商品檢驗(yàn)所，湖南永州425100；2 湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南永州425100)

建立了HPLC梯度洗脫法測(cè)定六味補(bǔ)血顆粒中芍藥苷和阿魏酸的含量。方法 采用Platisil ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm；柱溫：25 ℃。結(jié)果表明：芍藥苷在8.512～212.8 μg·mL-1的范圍內(nèi)峰面積積分值與濃度呈良好的線性關(guān)系(r=0.9998)，平均回收率為99.71%，RSD=1.08%(n=6)；阿魏酸在0.908～22.7 μg·mL-1的范圍內(nèi)峰面積積分值與濃度呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999)，平均回收率為99.02%，RSD=1.57% (n=6)。該法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，可作為六味補(bǔ)血顆粒制劑質(zhì)量控制的有效方法。

六味補(bǔ)血顆粒；芍藥苷；阿魏酸；含量測(cè)定

具有養(yǎng)氣補(bǔ)血功效的六味補(bǔ)血顆粒，臨床用于治療氣血兩虛、神疲乏力、頭昏眼花等癥狀。六味補(bǔ)血顆粒是以當(dāng)歸、白芍、川芎、黃芪、熟地黃、紫草六味中藥為原料提取制成的復(fù)方制劑，其中白芍、當(dāng)歸、川芎為方中主藥。白芍中的主要活性成分芍藥苷具補(bǔ)血助氣、調(diào)經(jīng)、平肝止痛之功效[1-2]，當(dāng)歸、川芎中的主要活性成份阿魏酸具有活血行氣、祛風(fēng)止痛、改善血液微循環(huán)、抑制血小板聚集、抗氧化和清除自由基作用[3-4]?，F(xiàn)行使用的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅以測(cè)定芍藥苷的含量來控制制劑的質(zhì)量[5-6]，本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定芍藥苷和阿魏酸兩種主要活性成分的含量，以便控制產(chǎn)品中白芍、當(dāng)歸、川芎3味主藥材的質(zhì)量，進(jìn)一步提高與完善該制劑的質(zhì)量控制方法。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1儀器

Waters 2489高效液相色譜儀(廣州逸?？萍加邢薰?；Empower Waters工作站；Waters 2489 UV檢測(cè)器；Platisil ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；FA-2004電子天平，常州科源電子有限公司；PL-J40D超聲波清洗器，東莞康士潔超聲波科技有限公司。

1.2試藥

芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)110736-201427)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)07773-201415)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；六味補(bǔ)血顆粒樣品(批號(hào)20150706，20150707，20150709，20150710)與陰性樣品均由湖南敬和堂藥業(yè)有限公司提供；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜條件

Platisil ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液，洗脫方式：梯度洗脫，程序見表1。

表1　梯度洗脫程序表

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備

用電子天平準(zhǔn)確稱量21.28 mg干燥的芍藥苷對(duì)照品，以60%甲醇為溶劑溶解并定容于50 mL容量瓶中，得濃度為425.6 μg·mL-1的芍藥苷對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確稱量9.08 mg阿魏酸對(duì)照品，加入1 mL鹽酸，以60%甲醇為溶劑溶解并定容于200 mL棕色容量瓶中，得濃度為45.4 μg·mL-1的阿魏酸對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備

避光操作，取本品研細(xì)(過四號(hào)篩)，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取50 mL60%甲醇加入，密塞，稱定重量，超聲40 min，放冷，再稱定重量，補(bǔ)足溶劑揮發(fā)減失的重量，濾過，棄去初濾液，準(zhǔn)確移取續(xù)濾液25 mL，水浴蒸干，用甲醇-0.1%磷酸溶液(40:60)溶解并定容于10 mL棕色容量瓶中，用0.45 μm濾膜濾過，制得供試品溶液。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備

取陰性供試制劑(缺白芍、當(dāng)歸、川芎藥材的陰性制劑)，照供試品溶液項(xiàng)下的方法制備陰性對(duì)照溶液。

圖1　高效液相色譜圖

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品色譜圖中，在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上有相同的色譜峰，主峰與其它色譜峰達(dá)到基線分離，陰性對(duì)照無此峰且無干擾，見圖1。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察

避光操作，精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液(425.6 μg·mL-1)和阿魏酸對(duì)照品溶液(45.4 μg·mL-1)各0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇-0.1%磷酸溶液(40:60)稀釋至刻度，混勻。分別吸取20 μL，依次注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測(cè)定。以芍藥苷、阿魏酸濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程分別為：

芍藥苷: Y=2584.047X+184.283，r=0.9998

阿魏酸: Y=5937.543X-381.574，r=0.9999

結(jié)果表明，芍藥苷在8.512～212.8 μg·mL-1、阿魏酸在0.908～22.7 μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2精密度試驗(yàn)

分別吸取同一對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定芍藥苷、阿魏酸峰面積積分值，并計(jì)算各自的RSD，見表2，結(jié)果表明該方法精密度良好。

表2　精密度試驗(yàn)

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

避光操作，分別精密吸取供試品(批號(hào)20150709)溶液20 μL，于0、3、6、9、12、15 h按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算芍藥苷與阿魏酸峰面積的RSD，見表3，結(jié)果表明在15 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表3　穩(wěn)定性試驗(yàn)(n=7)

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品(批號(hào)20150709)粉末6份，每份約1.0 g，精密稱定，按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，各精密吸取20 μL進(jìn)樣，測(cè)定芍藥苷和阿魏酸的含量，并計(jì)算芍藥苷和阿魏酸含量測(cè)定值的RSD，見表4，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

表4　重復(fù)性試驗(yàn)(n=6)

續(xù)表4

61.490.040平均值1.470.035RSD/%0.921.13

2.3.5回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量(每克含芍藥苷1.47 mg、阿魏酸0.035 mg)的本品(批號(hào)20150709)細(xì)粉6份，每份約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分成三組，每組分別精密加入芍藥苷對(duì)照品溶液1.5、2.0、2.5 mL，阿魏酸對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5 mL，按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，各精密吸取20 μL進(jìn)樣，測(cè)定芍藥苷和阿魏酸的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表5。

表5　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3.6樣品測(cè)定

取5批六味補(bǔ)血顆粒，按供試品溶液制備法依法制備樣品溶液。分別精密量取樣品溶液和芍藥苷與阿魏酸的混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，測(cè)定結(jié)果見表6。

表6　樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3　討　論

(1) 超聲時(shí)間的考察 用該法對(duì)六味補(bǔ)血顆粒中芍藥苷和阿魏酸的含量進(jìn)行測(cè)定的過程中，比較了超聲提取時(shí)間對(duì)芍藥苷和阿魏酸含量測(cè)定的影響，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，超聲提取40 min后，芍藥苷和阿魏酸的含量基本不變，可認(rèn)為提取完全。故將超聲提取時(shí)間確定為40 min。

(2)保護(hù)措施的確定 阿魏酸是丙烯酸衍生物，性質(zhì)不穩(wěn)定，見光極易分解，但在酸性溶液中穩(wěn)定性增強(qiáng)，故在對(duì)照品和樣品溶液的制備過程中，采用酸化及避光操作等保護(hù)性措施。

(3) 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用紫外分光光度計(jì)對(duì)芍藥苷與阿魏酸對(duì)照品溶液進(jìn)行吸收掃描，發(fā)現(xiàn)芍藥苷與阿魏酸的最大吸收分別在232 nm、320 nm，但二者在284 nm波長(zhǎng)處均有較大吸收，因此，選擇284 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

使用梯度洗脫法同時(shí)測(cè)量六味補(bǔ)血顆粒中芍藥苷和阿魏酸的含量，可監(jiān)控產(chǎn)品中3味主藥材的質(zhì)量。同時(shí)，該方法的準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)單，適用于六味補(bǔ)血顆粒的質(zhì)量控制。

[1]利創(chuàng)華,林艷菲,丘思蘭,等. 歸芍調(diào)經(jīng)口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,15(3):43-46.

[2]張傳平,呂紫璇,李洪斌. 反相高效液相色譜法測(cè)定冠心生脈丸中芍藥苷含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2015,24(2):50-51.

[3]趙東平,楊文鈺,陳興福. 阿魏酸的研究進(jìn)展[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2008,19(8):1839-1841.

[4]胡益勇,徐曉玉. 阿魏酸的化學(xué)和藥理研究進(jìn)展[J].中成藥,2006,28(2):253-255.

[5]周祖坤,孫代華,凌颯. 高效液相色譜法測(cè)定當(dāng)歸芍藥顆粒劑中芍藥苷的含量[J].藥物分析雜志,2006,26(7):1001-1003.

[6]王文淵,龍紅萍,卜生高. HPLC同時(shí)測(cè)定六昧補(bǔ)血顆粒中芍藥苷和阿魏酸的含量[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,5(1):58-60.

Determination of Paeoniflorin and Ferulic Acid in Liuweibuxue Granules

LUChi-jiao1，WANGWen-yuan2

(1 Hunan Yongzhou Products Inspection Institute，Hunan Yongzhou 425100;2 Hunan Yongzhou Vocational Technical college，Hunan Yongzhou 425100, China)

An HPLC method for determination of Paeoniflorin and ferulic acid in Liuweibuxue granules was established. The analytical column was Platisil ODS (150 mm×4.6 mm) filled with at 5 μm stationary phase, using methanol-0.1%phosphoric acid gradient elution as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1, the detection wavelength was 284 nm，and the column temperature was 25 ℃. Results showed that the linear range for Paeoniflorin and ferulic acid were 8.512～212.8 μg·mL-1(r=0.9998) and 0.908～22.7 μg·mL-1(r=0.9999), the average recovery was 99.71% (RSD=1.08%) for Paeoniflorin and 99.02% (RSD=1.57%) for ferulic acid. The method is simple, accurate and reproducible, and suitable to be used in quality control of liuweibuxue granules.

Lliuweibuxue granules; ferulic acid; Paeoniflorin; determination

魯赤姣(1972-)，女，工程師，從事產(chǎn)品質(zhì)量分析檢測(cè)。

R917

A

1001-9677(2016)010-0156-03