王艷宏, 王　超 , 尚冬雪 , 李　洋 , 趙永偉, 韓鳳娟

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 藥劑學(xué)教研室，哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 婦科一科，哈爾濱 150040)

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理沖生髓飲中多糖及水溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

王艷宏1, 王超1, 尚冬雪1, 李洋1, 趙永偉1, 韓鳳娟2

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 藥劑學(xué)教研室，哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 婦科一科，哈爾濱 150040)

建立理沖生髓飲中多糖及水溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的方法.測(cè)定理沖生髓飲多糖對(duì)葡萄糖的換算因子，利用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；采用考馬斯亮藍(lán)G- 250染色法測(cè)定理沖生髓飲中可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù).多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=12.839C-0.008 5(r=0. 999 3)，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=1.271C-0.033 1(r=0. 999 2)，兩者分別在 0.01～0.1、0.1～1.0 g/L有良好的線性關(guān)系.測(cè)得理沖生髓飲中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.53%，水溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.35%.該兩種方法操作簡(jiǎn)便、靈敏、快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于理沖生髓飲中多糖、水溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定.

理沖生髓飲；多糖；水溶性蛋白質(zhì)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

理沖生髓飲是在國(guó)家老中醫(yī)、黑龍江省名中醫(yī)王秀霞教授在長(zhǎng)期婦科臨床實(shí)踐中總結(jié)而出有效方劑的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代制劑技術(shù)制備得到的現(xiàn)代中藥制劑.其由人參、黃芪、鹿茸、莪術(shù)、三棱、淫羊藿、浙貝母、水蛭八味中藥材組成，具有破血消癥、軟堅(jiān)散結(jié)、補(bǔ)氣養(yǎng)血、填精益髓之功，可用于治療卵巢癌[1-7].理沖生髓飲中所含的成分種類眾多，有揮發(fā)油類、皂苷類、黃酮類、多糖類成分等.其中人參、黃芪等含有的多糖類成分具有提高免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降血脂等活性[8-11].此外，人參水溶性蛋白具有調(diào)血脂、抗疲勞、抗輻射、抗真菌以及抗病毒等作用[12-15]，鹿茸水溶性蛋白質(zhì)具有抗炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合以及抗腫瘤等多種生物活性[16-17].為了有效的控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效，本文采用苯酚-硫酸法，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法分別對(duì)理沖生髓飲中多糖、水溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行了質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定.

1　材料

紫外可見光分光光度計(jì)(WFZ UV-4802H，上海尤尼柯儀器有限公司)，分析天平(AB265-S，瑞士METTLER TOLEDO公司)，真空冷凍干燥機(jī)(BenchTop K，美國(guó)VIRTIS公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N1100-OSB-2100，上海愛朗儀器有限公司)，牛血清白蛋白( AR級(jí)，上海瀝瑞生物科技有限公司，批號(hào)201421)，無水葡萄糖(AR級(jí)，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110833-201205)，考馬斯亮藍(lán)G-250(AR級(jí)，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)201307)，實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水；其余試劑均為分析純.理沖生髓飲方中各藥由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)孫慧峰教授鑒定均符合藥典2010版各項(xiàng)下藥材規(guī)定.

2　方法與結(jié)果

2.1理沖生髓飲的制備

取處方量的藥材，適當(dāng)粉碎，以SCFE法萃取，獲得萃取物；藥渣繼續(xù)以75%乙醇回流提取，提取液回收乙醇后濃縮至150 mL；藥渣揮盡溶劑后，繼續(xù)以水回流提取，水提液濃縮后，與上述濃縮液合并，加入萃取物，攪勻，即得.

2.2多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

2.2.1供試品溶液的制備

精密移取理沖生髓飲減壓濃縮至150 mL，加乙醇至最終體積分?jǐn)?shù)為75%，于4 ℃冰箱中靜置過夜，離心(4 000 r/min,15 min)，將沉淀冷凍干燥，即得理沖生髓飲粗多糖.取粗多糖以水復(fù)溶，Sevag法除蛋白至水層在280 nm處無紫外吸收[18].將水層濃縮后，用過氧化氫脫色，然后將脫色后的溶液裝入透析袋中透析，透析液減壓濃縮后，加乙醇至最終濃度(體積分?jǐn)?shù))為75%，冷藏靜置過夜，離心，將沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗3次，冷凍干燥，即得精制理沖生髓飲多糖[19].

取理沖生髓飲粗多糖10 mg，精密稱定，加水定容至100 mL量瓶中，作為供試品溶液.

2.2.2對(duì)照品溶液的制備

取105 ℃干燥至恒重葡萄糖對(duì)照品適量，精確稱定，加水制成每L含有0.1 g葡萄糖的對(duì)照品貯備液，再分別移取2.5、5、10、15、20 mL的對(duì)照品貯備液置25 mL量瓶中，加水制得相應(yīng)質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02.、0.04、0.06、0.08、0.1 g/L的葡萄糖系列對(duì)照品溶液.

2.2.3苯酚溶液的制備

稱取分析純苯酚200 g，加鋁片0.2 g、碳酸氫鈉0.1 g，常壓油浴蒸餾，收集182 ℃餾份.稱取該餾份80 g，加水溶解并稀釋成80%苯酚液，冷藏備用.臨用前，精密移取 3.125 mL的80% 苯酚溶液，置50 mL 容量瓶中，加水定容，即得 5% 苯酚液.

2.2.4測(cè)定吸收波長(zhǎng)的選擇

精確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液各1.00 mL，以蒸餾水作空白，分別置于20 mL具塞試管中，并依次加入5%苯酚溶液1.0 mL，振搖混勻，迅速滴加5.0 mL濃硫酸，搖勻，室溫下放置30 min，然后采用分光光度計(jì)上，于400～600 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，檢測(cè)到兩種溶液最大吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)均為489 nm，故選擇489 nm作為測(cè)定理沖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)波長(zhǎng).

2.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密移取1.0 mL葡萄糖系列對(duì)照品溶液，以蒸餾水作空白，分別置于20 mL具塞試管中，按照2.2.4項(xiàng)下的方法，于489 nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸收值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=12.839C-0.008 5 (r=0.999 3)，在0.01～0.1 g/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好.

2.2.6換算因子的計(jì)算

精密稱取精制理沖生髓飲多糖10.00 mg，加水定容至100 mL量瓶中，搖勻得多糖的儲(chǔ)備液.吸取多糖儲(chǔ)備液20.0 mL，置于25 mL量瓶中，加水定容.精密移取上述溶液1.0 mL于具塞試管中，按照2.2.4項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中多糖質(zhì)量濃度.按f=W/(C×D)計(jì)算換算因子.其中W為精制多糖的質(zhì)量(mg)，C為精制多糖中葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)，D為稀釋因素，測(cè)得f=1.648 8，RSD為2.17%(n=5).

2.2.7樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

精密移取供試品溶液1.0 mL，按照2.2.4項(xiàng)下的方法測(cè)定其吸光度值，計(jì)算多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù).多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)=(C×D×f/W)×100%，其中：C為供試品溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，D為稀釋因素，f為換算因子，W為供試品質(zhì)量.結(jié)果測(cè)得理沖生髓飲粗多糖部位中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.58%，RSD為 1.52% (n=6).再乘以得率9.74%，得復(fù)方中平均多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.53%.

2.2.8加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密移取9份2.2.1項(xiàng)下已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的粗多糖供試品溶液各 0.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，并分別加入質(zhì)量濃度為0.04、0.06 和 0.08 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各 0.5 mL，加水定容，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3份，按照2.2.4項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度.結(jié)果如表1所示，測(cè)得平均加樣回收率為99.35%，RSD為1.41%，試驗(yàn)結(jié)果表明，平均回收率在 97%～101%之間，上述方法具有良好的回收率.

表1　理沖生髓飲多糖加樣回收率結(jié)果

2.2.9精密度實(shí)驗(yàn)

精密移取理沖生髓飲粗多糖供試液1.0 mL，按照2.2.4項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法測(cè)定吸光度，平行測(cè)定6份，RSD為1.63%，表明此方法精密度良好.

2.2.10穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密移取理沖生髓飲粗多糖供試液1.0 mL，按照2.2.4項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法測(cè)定吸光度，每隔0.5 h測(cè)一次吸光度，連續(xù)11次，結(jié)果表明樣品顯色后在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD為1.25%.

2.3水溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

2.3.1供試品溶液的制備

移取理沖生髓飲濃縮至100 mL，作為供試品溶液.

2.3.2蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取干燥至恒重的牛血清白蛋白10.00 mg，精密稱定后，加水制成每1升含有蛋白質(zhì)1.0 g的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并冷藏保存.

2.3.3考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的制備[20]

精密稱取考馬斯亮藍(lán) G-250 100.00 mg，加50 mL 的95% 乙醇溶解后(顯藍(lán)色)，再加入100 mL的85%(m/V)磷酸(顯血紅色)，最后加蒸餾水制得每1 L含100.00 mg考馬斯亮藍(lán)顯色液.

2.3.4測(cè)定吸收波長(zhǎng)選擇

分別精密移取供試品溶液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.1 mL，置10 mL 具塞試管中，分別加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)顯色液，立即混勻，放置 10 min后，采用分光光度計(jì)，于500～800 nm 區(qū)間掃描，結(jié)果測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品與供試品均在595 nm 處有最大吸收，故選擇 595nm 為測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)的檢測(cè)波長(zhǎng).

2.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[20]

精密量取蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，并編號(hào)為1～7號(hào)，分別加入水至1.0 mL，搖勻，得到相應(yīng)質(zhì)量濃度分別為0.0、0.1.、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液.然后從各管中吸取溶液0.10 mL，按2.3.4項(xiàng)下的方法，于595 nm處測(cè)定吸光度，同時(shí)以1號(hào)管作為空白對(duì)照.以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.標(biāo)準(zhǔn)方程A=1.271C-0.033 1(r=0.999 2)，在0.1～1.0g/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好.

2.3.6水溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

精密移取0.1 mL供試品溶液，置于具塞試管中，按2.3.4項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算水溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù).蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)=(C×D/W)×100%，其中：C為供試液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(g/L)，D為稀釋因素，W樣品的質(zhì)量(g).結(jié)果測(cè)得理沖生髓飲中水溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.35%，RSD2.43%(n=6).

2.3.7加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密移取9份2.3.1項(xiàng)下已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的供試品溶液 0.05 mL( 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3549%) ，分別加入質(zhì)量濃度為0.2、0.4 和 0.6 g/L 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各 0.05 mL，按2.3.4項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，結(jié)果如表2，測(cè)得平均回收率為100.2%，RSD為1.89 %，試驗(yàn)結(jié)果表明，平均回收率在 98%～102%之間，上述方法具有良好的回收率.

表2　理沖生髓飲蛋白質(zhì)加樣回收率結(jié)果

2.3.8精密度實(shí)驗(yàn)

精密移取供試液0.1 mL，按2.3.4項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，平行測(cè)定6份，RSD為 1.37%，表明此方法精密度良好.

2.3.9穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密移取供試液0.1 mL，按2.3.4項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，每隔5 min測(cè)定一次吸光度，連續(xù)10次，結(jié)果表明樣品顯色后在45 min內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD為1.74%.

3　討　論

本文分別采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖和考馬斯亮藍(lán)G- 250染色法測(cè)定水溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù).苯酚-硫酸法是用于測(cè)定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的常用方法，具有操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，其原理是多糖在濃硫酸的作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚縮合成有色物質(zhì)，該有色物質(zhì)有紫外吸收，因此可用比色法測(cè)定其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù).理沖生髓飲中多糖種類較多，成分復(fù)雜，若僅使用葡萄糖一種單糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，會(huì)造成較大的誤差，所以本實(shí)驗(yàn)利用精制多糖測(cè)得多糖對(duì)葡萄糖的換算因子，以減小單純以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)帶來的誤差，使測(cè)得值更接近于真實(shí)值.

蛋白質(zhì)是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是中藥的一類有效成分，而目前有關(guān)中藥材中的蛋白質(zhì)的分析，則僅限于分析其中的水溶性的蛋白質(zhì).考馬斯亮藍(lán)G-250染色法的原理是蛋白質(zhì)分子中的酰胺基團(tuán)與考馬斯亮藍(lán)G-250 在酸性溶液中結(jié)合成藍(lán)色復(fù)合物，在595 nm處有紫外吸收，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可測(cè)定1～200 μg蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù).本法靈敏度高于凱氏定氮法、Lowry法，且操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好[21-22].

理沖生髓飲可抑制卵巢癌組織的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，對(duì)卵巢癌的治療有一定的獨(dú)特的療效.其中，多糖和蛋白質(zhì)均為該復(fù)方中治療卵巢癌的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此本文分別建立了多糖、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的方法，為理沖生髓飲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù).

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Determination of polysaccharide content and protein content in Lichong Shengsui Drink

WANG Yan-hong1, WANG Chao1, SHANG Dong-xue1, LI Yang1, ZHAO Yong-wei1, HAN Feng-juan2

(1. Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China; 2 First Gynecological Department, First Affiliated Hospital,Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

To establish a method for the determination of polysaccharide and water-soluble protein in Lichong Shengsui Drink (LCSSD), the conversion factor of LCSSD polysaccharide to glucose was obtained with refined polysaccharide, and the content of LCSSD polysaccharide was determined by using phenol- sulfuric method. The content of protein was determined by using the dying method with Coomassie brilliant blue G -250. The polysaccharide standard curve equation wasA=12.839C-0. 008 5 (r=0. 999 3) and protein standard curve equation wasA=1.271 0C-0. 033 1 (r=0. 999 2). Respectively the linear range was 0.01～0.1 g/L and 0.1～1.0 g/L. The content of polysaccharide was 8.53%, and the content of protein was 0.35%. The method is simple, fast, accurate and reproducible, and it should be helpful for the determination of polysaccharide and water-soluble proteins in LCSSD.

Lichong ShengSui Drink; polysaccharide; water-soluble protein; content determination

2015-11-26.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273788)

王艷宏(1972-)，女，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥性味理論和中藥制劑現(xiàn)代化.

韓鳳娟(1971-)，女，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士、博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合診治婦科腫瘤

R286

A

1672-0946(2016)04-0399-04