徐　暘，許樹軍，張　蕾，于　芳，鄒淑君

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040；2.黒龍江迪龍制藥有限公司研發(fā)部，安達151400）

鋁離子存在下槲皮素與牛血清白蛋白的相互作用

徐暘1，許樹軍1，張蕾1，于芳2，鄒淑君1

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040；2.黒龍江迪龍制藥有限公司研發(fā)部，安達151400）

采用熒光光譜和同步熒光光譜研究Al3+存在時，槲皮素（Qct）與牛血清白蛋白（BSA）之間的相互作用.實驗結(jié)果表明，Al3+存在，能夠增強槲皮素對BSA的熒光猝滅程度、使槲皮素與BSA的結(jié)合常數(shù)增大、影響了槲皮素對BSA的熒光猝滅類型、沒有改變槲皮素與BSA的作用力類型.Al3+的引入使蛋白質(zhì)分子肽鏈更加緊縮，疏水性增加.

槲皮素；牛血清白蛋白；鋁離子；熒光法

血清白蛋白是生物體中重要的載體蛋白，能與小分子藥物可逆結(jié)合，然后將小分子藥物輸送到機體的各個部位.在小分子藥物與血清白蛋白相互結(jié)合并被轉(zhuǎn)運的過程中，外源或內(nèi)源金屬離子可能會對藥物分子-血清白蛋白的相互作用過程產(chǎn)生影響［1］.金屬離子的存在，對藥物小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合有減弱或增強作用.一般認為，減弱作用主要是由于金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用使其變成受制狀態(tài)下的剛性肽鏈，改變了結(jié)合位點處的構(gòu)象，從而削弱了藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合［2］.增強作用則主要是由于金屬離子同時與藥物和蛋白質(zhì)結(jié)合，在藥物和蛋白質(zhì)分子間形成“離子架橋”，從而起到增強作用［3］.研究金屬離子存在下藥物分子與血清白蛋白的相互作用，有助于確切地了解藥物在體內(nèi)的貯運、吸收及釋放受金屬離子的影響情況.

槲皮素存在于許多植物的花、葉、果實中，具有廣泛的生物學(xué)作用，是自然界中最強的抗氧化劑之一［4］.槲皮素進入血液后有99.4%的比例與血清白蛋白結(jié)合［5］.Al3+是生物體常見的外源性金屬離子，在生命活動中具有一定的毒副作用，本研究就是通過熒光法考察Al3+存在下，槲皮素與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，以了解如果血液中有Al3+存在，將會對槲皮素在血液中的分布、吸收、藥效等產(chǎn)生哪些影響.

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

XS10fDU型電子分析天平：瑞士梅特勒公司；PB-20型pH計：德國賽多利斯儀器有限公司；SK250LH型超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；CU600型溫水浴鍋，上海益恒實驗儀器有限公司；RF-5301PC型熒光光度計：日本島津公司.

槲皮素（98%）：中國藥品生物制品檢定所；三羥甲基氨基甲烷（Tris 99.8%）：上海博宏生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA 99.8%）：美國Sigma公司；實驗用水均為二次蒸餾水；其他試劑未經(jīng)說明均為國產(chǎn)分析純.

1.2溶液的配制

以Tris-HCl緩沖溶液（0.05 mol/L，pH=7. 4，含0.01 mol/L NaCl以維持溶液離子強度）為溶劑配制1×10-5mol/L的BSA溶液，置于4℃的冰箱中保存.槲皮素首先用少量甲醇溶解，再用二次蒸餾水定容配制成1×10-4mol/L的溶液.另用二次蒸餾水配制5×10-3mol/L的AlCl3溶液.

1.3實驗方法

1）在8支都盛有1.00 mLBSA（1.0×10-5mol/L）溶液的10 mL容量瓶中，分別加入0，100～800μL的槲皮素溶液（1.0×10-4mol/L），用Tris -HCl（pH=7.40）溶液定容，分別于290、300、310 K水浴20 min.

2）另在8支都盛有1.00 mLBSA（1.0×10-5mol/L）溶液的10 mL容量瓶中，分別加入0，100～800μL的AlCl3溶液（5×10-3mol/L），用Tris-HCl（pH=7.40）溶液定容，分別于290、300、310 K水浴20 min.樣品溶液的熒光光譜.3）另在9個10 mL容量瓶中均加入BSA（1×10-5mol/L）溶液1 mL，從第2號容量瓶開始加入AlCl3（5×10-3mol/ L）溶液1 mL，第3～9號容量瓶再依次加入100～800μL的槲皮素溶液（1.0×10-4mol/L），Tris-HCl緩沖溶液定容.每組都在固定激發(fā)波長為280 nm，290～450 nm范圍內(nèi)掃描熒光光譜.第2）、3）組同時固定Δλ=15 nm及Δλ=60 nm，掃描同步熒光光譜.熒光光譜和同步熒光光譜的激發(fā)狹縫均為5 nm，發(fā)射狹縫均為3 nm.

1.4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理均參考文獻［6］的方法.

2　結(jié)果與討論

2.1鋁離子對槲皮素猝滅BSA的熒光光譜的影響

圖1是300K時，BSA溶液的熒光發(fā)射光譜.其中圖（A）是不同濃度的Al3+存在下BSA溶液的發(fā)射光譜，圖（B）是不同濃度的槲皮素存在下BSA溶液的發(fā)射光譜，圖（C）是Al3+、槲皮素同時存在下BSA溶液的發(fā)射光譜.由圖1可見，Al3+溶液對BSA的熒光猝滅作用很弱.槲皮素對BSA有很強的、規(guī)律性的熒光猝滅作用；且隨著槲皮素濃度的增加，BSA的熒光峰呈現(xiàn)規(guī)律性的下降；當Al3+存在時，不同濃度的槲皮素仍能使BSA熒光發(fā)生規(guī)律性的猝滅，且猝滅程度比沒有Al3+時增大.表明Al3+的加入，使槲皮素對BSA內(nèi)源熒光的猝滅程度加強.

圖1　Al3+、槲皮素及二者共同存在下BSA的熒光猝滅光譜

2.2鋁離子對槲皮素猝滅BSA熒光機理的影響

對猝滅機理、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)的分析均參照文獻［6］的方法和原理進行處理.根據(jù)sternvolumn方程做圖計算得到的相關(guān)熒光猝滅常數(shù)Ksv及碰撞猝滅速率常數(shù)Kq的相關(guān)數(shù)值見表1.結(jié)果表明槲皮素對BSA的熒光猝滅常數(shù)Ksv隨溫度的升高呈現(xiàn)規(guī)律性降低，且碰撞猝滅速率常數(shù)Kq遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞常數(shù)，所以槲皮素對BSA的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅.而Al3+存在下，槲皮素對BSA猝滅常數(shù)Ksv隨溫度的升高不能呈現(xiàn)規(guī)律性降低，但碰撞猝滅常數(shù)Kq仍遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞常數(shù)，因此推測Al3+存在下，槲皮素對BSA是靜態(tài)猝滅、動態(tài)猝滅同時存在的混合猝滅作用.

表1　槲皮素-M-BSA相互作用的結(jié)合參數(shù)

2.3鋁離子對槲皮素與BSA結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)的影響

根據(jù)雙對數(shù)方程推導(dǎo)計算沒有Al3+存在及有Al3+存在下槲皮素與BSA的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點數(shù)n，相關(guān)數(shù)值見表1.不論Al3+存在與否，槲皮素與BSA的結(jié)合常數(shù)KA均隨溫度升高呈穩(wěn)定下降趨勢，且與BSA結(jié)合常數(shù)處于105數(shù)量級，屬于強結(jié)合作用.從表中數(shù)據(jù)的平均效果看，Al3+存在下槲皮素與BSA的結(jié)合常數(shù)KA大于單獨槲皮素對BSA的結(jié)合常數(shù)，該結(jié)果表明Al3+存在時，槲皮素與BSA的結(jié)合穩(wěn)定性增大.從結(jié)合位點數(shù)n來看，Al3+存在使槲皮素與BSA結(jié)合位點數(shù)略有減小.結(jié)合前面的熒光光譜判斷，應(yīng)該是Al3+同時與槲皮素和蛋白質(zhì)發(fā)生了配位作用［7］.

2.4鋁離子對槲皮素與BSA相互作用力類型的影響

表2是Al3+不存在和存在時，槲皮素與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù).參照文獻［6］，根據(jù)Ross等人的分析方法，結(jié)合表2中的數(shù)據(jù)可知，兩個反應(yīng)體系ΔG均為負值，表明兩種情況下反應(yīng)都是自由能降低的過程，并且反應(yīng)能夠自發(fā)進行.反應(yīng)體系的熱力學(xué)參數(shù)均符合ΔH＜0、ΔS＜0，表明不論有無Al3+存在，槲皮素與BSA之間主要作用力類型都是氫鍵和范德華力.說明Al3+的加入不改變槲皮素與BSA的作用力類型.

表2　槲皮素-M-BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.5鋁離子對槲皮素與BSA相互作用同步熒光光譜的影響

熒光發(fā)射基團附近微環(huán)境的結(jié)構(gòu)變化信息都能被同步熒光技術(shù)所探知.同步熒光一般是利用發(fā)射單色器、固定激發(fā)與發(fā)射之間的波長差來獲得固定的Δλ.對于BSA，當Δλ=15 nm時，只顯示酪氨酸殘基的熒光特征光譜，當Δλ=60 nm時，只顯示色氨酸殘基的熒光特征光譜.所以從BSA最大發(fā)射波長的變化趨勢，可以得到蛋白質(zhì)分子中色氨酸殘基微環(huán)境以及酪氨酸殘基微環(huán)境的極性變化情況［6］.圖2中（A）、（B）是Δλ=15 nm時沒有Al3+和有Al3+存在時槲皮素對BSA同步熒光光譜的影響，（C）、（D）是Δλ=60 nm時沒有Al3+和有Al3+存在時槲皮素對BSA同步熒光光譜的影響.兩種同步熒光光譜都可獲悉，Al3+存在時，槲皮素對BSA酪氨酸和色氨酸殘基的熒光猝滅作用都比沒有Al3+存在時強.不論有沒有Al3+存在，槲皮素均能使BSA的同步熒光藍移，但有Al3+存在時，藍移程度略有增加，可見，Al3+的引入使蛋白質(zhì)分子肽鏈更加緊縮，疏水性增加.

圖2　Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時Al3+存在下槲皮素對BSA同步熒光光譜

3　結(jié)語

通過比較熒光猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、作用力類型及同步熒光光譜，推知Al3+存在下，可能同時與槲皮素和蛋白質(zhì)發(fā)生絡(luò)合作用，絡(luò)合后使槲皮素與BSA的結(jié)合程度增大.Al3+加入后，改變了槲皮素對BSA的熒光猝滅類型，可能變成靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅同時存在的混合猝滅.Al3+加入后，不改變槲皮素與BSA的作用力類型，仍以氫鍵和范德華力為主.Al3+能夠改變槲皮素對BSA空間構(gòu)象的影響，使蛋白分子肽鏈緊縮，疏水性增加.因此在考慮應(yīng)用槲皮素以及含有以槲皮素為主成分的食品或藥物，外源性Al3+的引入可能會降低槲皮素在體內(nèi)的游離濃度，從而降低藥效.

［1］蔣新宇，李文秀，陳景文.鋅離子存在下槲皮素、楊梅素與牛血清蛋白的結(jié)合［J］.無機化學(xué)學(xué)報，2008，28（10）：1588-1595.

［2］王旭，吳淑春，王家學(xué)，等.水楊酸和牛血清白蛋白的相互作用研究及共存銅離子的影響［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013，30（10）：1066-1070.

［3］邵爽，邱瑾.金屬離子對齊多夫定與牛血清白蛋白結(jié)合作用的影響［J］.物理化學(xué)學(xué)報，2009，25（7）：1342-1346.

［4］孫涓，余世春.槲皮素的研究進展［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2011，25（3）：85-88.

［5］謝孟峽，徐曉云，王英典，等.4'-5'-7-三羥基二氫黃酮與人血清白蛋白相互作用的光譜學(xué)研究［J］.化學(xué)學(xué)報，2005，63（22）：2055-2062.

［6］鄒淑君，許樹軍，董黎明，等.光譜法比較木犀草素及槲皮素與牛血清白蛋白相互作用［J］.光譜實驗室，2013，30 （6）：2870-2877.

［7］李麗，陳鳳浩，趙玉華，8周有氧運動對不同月齡SD大鼠清中CK活性變化的影響［J］.哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2015，31（6）：119-121.

Influence of Al3+on interaction between quercetin and bovine serum album in

XU Yang1，XU Shu-jun1，ZHANG Lei1，YU Fang2，ZOU Shu-jun1
（1.School of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.Research and Development Department，Di Long Pharmaceutical companies，Harbin 151400，China）

The interaction between quercetin and bovine serum albumin（BSA）was studied in the presence of Al3+by using fluorescence spectroscopy and synchronous fluorescence. Results indicated that quercetin could enhance the fluorescence quenching degree of BSA，and increase the binding constant of quercetin on BSA in the presence of Al3+.And Al3+influences the quercetin fluorescence quenchingmechanism to BSA.Al3+could make the peptide chain of BSA intomore austerity state and increased hydrophobicity.But themain binding force of quercetin on BSA did not change in the presence of Al3+.

quercetin；bovine serum albumin；Al3+；fluorescence spectrometry

R285

A

1672-0946（2016）02-0150-04

2015-04-14.

黑龍江省教育廳資助項目（No.12531648）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研課題（201103）.

徐暘（1977-），女，博士，副教授，研究方向：藥物分析研究.

鄒淑君（1974-），女，博士，副教授，研究方向：藥物分析研究.