韓成云，趙志剛，鄒磊（1.江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西宜春336000；.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春336000；3.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春336000）

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響應(yīng)面法優(yōu)化徽州大黃菊總黃酮提取工藝

韓成云1，2，趙志剛3，*，鄒磊2
（1.江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西宜春336000；2.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春336000；3.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春336000）

利用響應(yīng)面法優(yōu)化徽州大黃菊總黃酮的提取條件，以純水為溶劑，選取料液比、浸提時(shí)間和浸提溫度進(jìn)行三因素多水平分析，用紫外分光光度計(jì)法測(cè)量樣品中總黃酮的含量。結(jié)果顯示，在料液比為1∶68（g/mL），浸提時(shí)間在38min，浸提溫度為87℃時(shí)菊花中總黃酮含量最高，其含量是28.609 mg/g，為徽州大黃菊功能活性成分的提取及綜合利用提供理論參考。

菊花；水提取法；總黃酮；響應(yīng)面分析

菊花是屬于菊科多年生草本植物菊（Chrysanthemum morifolium ramat）的干燥頭狀花序［1］，我國主要栽培的品種有滁菊、杭菊、懷菊、濟(jì)菊、貢菊、黃菊、祁菊、亳菊等八大種類，主產(chǎn)于河南、安徽和浙江等省份［2-3］。本文所研究的徽州大黃菊（黃菊），原產(chǎn)安徽省黃山市歙縣深山，花朵大，顏色黃，既具有觀賞價(jià)值，又具有一定的藥用功能。該品種集色、香、味、型于一體，味道清香甘爽，具有養(yǎng)肝明目、生津止渴、寧心安神、清涼解毒之功能。

利用菊花沖泡中溶解的黃酮類物質(zhì)是一類主要的有效成分，它是包括木犀草素（Luteohn）、刺槐苷（A－caciaglucoside）、矢車薄苷（Chrysan themin glucoside）等的混合物質(zhì)，這些物質(zhì)具有抗氧化、防治心血管疾病以及抗腫瘤等多種藥理功效［4-6］。

一般提取物質(zhì)最佳條件找尋中，常會(huì)用到響應(yīng)面分析（response surface method，RSM）法［7-8］，該方法是在多因素?cái)?shù)量處理試驗(yàn)的分析中，通過分析試驗(yàn)指標(biāo)（因變量）與多個(gè)試驗(yàn)因素（自變量）間的回歸關(guān)系，并采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法［9］。

目前關(guān)于菊花總黃酮提取方法的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，研究多采用乙醇做溶劑浸提［10-13］，依據(jù)阮俊等［14］的研究報(bào)道，采用乙醇提取法的總黃酮含量（3.37%）略優(yōu)于水提法（3.29%）。綜合成本與生產(chǎn)實(shí)踐，及菊花主要作為飲品原料等特質(zhì)因素，采用水提法可以更好地進(jìn)行工藝操作。因此本研究選取徽州大黃菊作為研究對(duì)象，以純水為溶劑，選取料液比、浸提時(shí)間和浸提溫度等因素，利用響應(yīng)面法對(duì)菊花總黃酮含量進(jìn)行分析，分析結(jié)果可為徽州大黃菊功能活性成分的提取及綜合利用提供理論參考。

1　試驗(yàn)材料、試劑及儀器

1.1材料與試劑

徽州大黃菊：由江西隆平有機(jī)農(nóng)業(yè)有限公司提供。

70%C2H5OH：量取無水C2H5OH 70 mL，加30 mL去離子水，搖勻，室溫保存；30%C2H5OH：量取無水C2H5OH 30mL，加70mL去離子水，搖勻，室溫保存；5% NaNO2對(duì)照液：稱取NaNO25.00 g，加95 mL去離子水，溶解，室溫保存；4%NaOH：稱取NaOH 4.00 g，加96 mL去離子水，溶解，室溫保存；10%Al（NO3）3：稱取Al（NO3）310.00 g，加90 mL去離子水，溶解，室溫保存；蘆丁對(duì)照品：用60%C2H5OH配制0.1 mg/mL的對(duì)照液。試劑均為分析純。

1.2主要儀器

表1　主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備Table 1　The main experimental apparatus and equipment

1.3方法

1.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在菊花產(chǎn)品的浸提過程中，料液比、浸提時(shí)間、以及浸提溫度都會(huì)影響浸提溶液中菊花有效物質(zhì)總黃酮含量的提取率。因此，本試驗(yàn)首先選取菊花沖泡過程常見的浸提溫度（70℃～100℃）、浸提時(shí)間（10 min～40 min）和料液比［1∶30（g/mL）～1∶70（g/mL）］3個(gè)因素分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究其對(duì)總黃酮提取率的影響。再根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比（A）、浸提時(shí)間（B）、浸提溫度（C）3個(gè)因素做響應(yīng)面分析試驗(yàn)（表2），找出浸提工藝最佳條件。

表2　響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案Table 2　Response surface experimental design

1.3.2菊花總黃酮含量檢測(cè)方法

1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［3］

用60%C2H5OH配制0.1 mg/mL的蘆丁對(duì)照液。分別精確吸取蘆丁對(duì)照液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于試管中：

1）加入5%NaNO2溶液0.30mL，搖勻，靜置6.0min；

2）加10%Al（NO3）3溶液0.30 mL，搖勻，靜置6.0 min；

3）加入4%NaOH溶液4.00 mL；

4）依次分別加入5.40、4.90、4.40、3.40、2.40、1.40、0.40 mL 60%C2H5OH使反應(yīng)液體積達(dá)到10 mL，搖勻，靜置12.0 min；

5）測(cè)定510 nm處吸光值。

選取對(duì)照樣液濃度做X軸，樣液在510 nm處的吸光度（OD510nm）做Y軸，如圖1所示。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of rutin

由此算出回歸方程，y=10.153x+0.016 6（R2=0.9985）結(jié)果顯示蘆丁在0～0.05 mg/mL范圍內(nèi)與吸光值有比較理想的線性關(guān)系。

1.3.2.2總黃酮含量的測(cè)定［15］

1）準(zhǔn)確稱取菊花樣品1.0 g，加入超純水30 mL，在一定溫度水浴鍋中分別浸提一定時(shí)間后抽濾，用70% C2H5OH溶液洗滌到100 mL的容量瓶中，定容，搖勻震蕩后備用；

2）精確吸取供試樣品溶液3 mL于10 mL容量瓶中，用30%的C2H5OH溶液定容至刻度；

3）分別精確吸取2mL于10mL試管中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，震蕩搖勻放置6 min，加10%Al（NO3）30.3 mL，震蕩搖勻，放置6 min；

4）加4%NaOH溶液4 mL，震蕩搖勻，用30%C2H5OH溶液定容至刻度，震蕩搖勻；

5）放置15 min后置于比色皿中在510 nm處測(cè)定吸光值，以30%C2H5OH溶液做空白對(duì)照，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量。

6）重復(fù)兩次上述試驗(yàn)，控制單因素料液比，改加50、70 mL超純水。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素分析

2.1.1浸提時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

在浸提溫度80℃，料液比1∶30（g/mL）的條件下，將浸提時(shí)間分別設(shè)定為5、10、15、20、25、30、40 min進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2　浸提時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響Fig.2　Effect of extraction time on total flavonoids content

通過圖2可以看出，總黃酮含量隨著時(shí)間的延長呈不斷上升趨勢(shì)，這主要是隨著時(shí)間的增加，浸提液中菊花的總黃酮等物質(zhì)不斷析出，時(shí)間在30 min～40 min時(shí)，趨勢(shì)基本穩(wěn)定，表明在30 min左右總黃酮含量析出達(dá)到最大水平，因此，響應(yīng)面設(shè)計(jì)的浸提時(shí)間初步定在10 min～40 min較為合適。

2.1.2浸提溫度對(duì)總黃酮含量的影響

在浸提時(shí)間25 min，料液比1∶30（g/mL）的條件下，將浸提溫度分別設(shè)定為70、75、80、85、90、100℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

圖3　浸提溫度對(duì)總黃酮含量的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on total flavonoids content

通過圖3可以看出，總黃酮含量隨著溫度的升高先表現(xiàn)不斷升高，在90℃后呈快速下降的趨勢(shì)，這表明在一定溫度下，總黃酮類物質(zhì)隨溫度升高分子運(yùn)動(dòng)加劇，析出的量因此不斷增加，超過一定溫度后，隨溫度升高總黃酮含量降低，可能是由于高溫造成了總黃酮類物質(zhì)某些成分降解，因此，響應(yīng)面設(shè)計(jì)的浸提時(shí)間初步定在70℃～100℃較為合適。

2.1.3料液比對(duì)總黃酮含量的影響

在浸提溫度80℃，浸提時(shí)間25 min的條件下，將料液比分別設(shè)定為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/ mL）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。

圖4　料液比對(duì)總黃酮含量的影響Fig.4　Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids content

通過圖4可以看出，總黃酮含量隨著料液比的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，數(shù)據(jù)顯示，在料液比為1∶60（g/mL）處達(dá)到最高值，這表明在設(shè)定浸提溫度和時(shí)間下，隨著料液比的增加，菊花總黃酮溶出速率增加，溶出的量相應(yīng)增加，在料液比1∶60（g/mL）左右條件下有效成分浸出比較充分，而繼續(xù)增加溶液會(huì)相應(yīng)稀釋總黃酮量，出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，響應(yīng)面設(shè)計(jì)的料液比初步定在1∶30（g/mL）～1∶70（g/mL）較為合適。

2.2響應(yīng)面分析

在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取料液比（A）、浸提時(shí)間（B）和浸提溫度（C）作為自變量，黃菊花總黃酮含量（Y）作為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.5軟件，按照Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3所示。

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3　Response surface experimental design and results

對(duì)表3的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)回歸擬合，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響可用以下公式表示：

Y=24.91+3.54A+2.11B+5.23C+1.35AB-4.03AC+ 0.4BC-0.75A2-2.68B2-8.40C2

并對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4　回歸分析結(jié)果Table 4　Results of regression analysis

根據(jù)回歸分析結(jié)果可以看出，模型回歸R2=0.950 7，表明該模型與實(shí)際擬合較好，自變量（液料比、浸提時(shí)間和浸提溫度）與響應(yīng)值（總黃酮含量）之間線性關(guān)系顯著。同時(shí)結(jié)果還表明，浸提溫度的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和液料比的一次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；浸提時(shí)間的一次項(xiàng)和料液比與浸提溫度的交互作用影響也較為顯著（P＜0.05）；此外，各因素對(duì)總黃酮含量提取的影響次序分別為：浸提溫度二次項(xiàng)＞浸提溫度一次項(xiàng)＞液料比一次項(xiàng)＞料液比與浸提溫度的交互作用＞浸提時(shí)間一次項(xiàng)。

保持試驗(yàn)條件的3個(gè)變量中的1個(gè)變量在0水平不變，另外2個(gè)變量在相應(yīng)范圍內(nèi)變化，作響應(yīng)面圖進(jìn)行分析。

圖5　料液比和浸提時(shí)間交互作用響應(yīng)面Fig.5　Response surface plots of interaction between solid-liquid ratio and extraction time

圖6　料液比和浸提溫度交互作用響應(yīng)面Fig.6　Response surface plots of interaction between solid-liquid ratio and extraction temperature

圖7　浸提時(shí)間和浸提溫度交互作用響應(yīng)面Fig.7　Response surface plots of interaction between extraction time and temperature

由圖5～圖7可以看出，當(dāng)浸提溫度一定時(shí)，總黃酮含量隨料液比和浸提時(shí)間的增大出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)；當(dāng)浸提時(shí)間一定時(shí)，總黃酮含量隨料液比和浸提溫度的增大出現(xiàn)快速上升后略有下降的趨勢(shì)；當(dāng)料液比一定時(shí)，總黃酮含量隨浸提時(shí)間和浸提溫度的增大先升高后緩慢下降。為進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)，再對(duì)回歸模型求一階偏導(dǎo)，解得最優(yōu)參數(shù)為：A=0.92、B= 0.89、C=0.14；帶入之前的變換公式得出：料液比1∶68.4（g/mL）、時(shí)間38.35 min、溫度87.10℃，此時(shí)總黃酮含量為28.609 mg/g。表明該條件下總黃酮含量提取效果最佳?？紤]到實(shí)際操作，將工藝參數(shù)修正為料液比1∶68（g/mL）、時(shí)間38 min、溫度87℃，在此條件下總黃酮含量為28.595 mg/g，與理論值很接近，表明該數(shù)學(xué)模型對(duì)優(yōu)化徽州大黃菊總黃酮含量的提取工藝是可行的。

3　結(jié)論

本研究以徽州大黃菊為原料，以純水作為浸提溶劑提取，采用單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，并借助響應(yīng)面分析法，選取料液比、浸提時(shí)間和浸提溫度進(jìn)行三因素多水平分析，優(yōu)化總黃酮的提取工藝，確定最優(yōu)提取參數(shù)為：料液比1∶68（g/mL）、時(shí)間38 min、溫度87℃，在此條件下總黃酮含量為28.609 mg/g，為大黃菊功能活性成分的提取及綜合利用提供理論參考。

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Optimization of Extraction for Flavonoids from Huizhou Chrysanthemum by Response Surface Method

HAN Cheng-yun1，2，ZHAO Zhi-gang3，*，ZOU Lei2
（1.Key Laboratory of Natural Active Pharmaceutical Constituents of Jiangxi Province，Yichun 336000，Jiangxi，China；2.College of Chenmistry and Biology Engineering，Yichun University，Yichun 336000，Jiangxi，China；3.Life Science and Resources and Environment，Yichun University，Yichun 336000，Jiangxi，China）

Response Surface Method（RSM）was applied to optimize the extraction condition of flavonoids from Chrysanthemum.With pure water as a solvent，the influence factors of ratio of liquid to solid，extraction time，extraction temperature were evaluated.Total flavonoid content of the sample was measured by UV spectrophotometer.The optimum extraction conditions were confirmed as follows：1∶68（g/mL）in solid-liquid ratio，extraction time 38 min，extraction temperature was 87℃.The extraction rate of flavonoids under this condition was the highest.Its content was 28.609 mg/g.The results provide a theoretical basis for the extraction and utilization of the active ingredient of Huizhou Chrysanthemum.

Chrysanthemum；water extracts；flavonoids；response surface analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.009

江西省高校十二五重點(diǎn)學(xué)科基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目（作物遺傳育種學(xué)）；2013國家園藝綜合改革項(xiàng)目（ZG0273）

韓成云（1981—），女（漢），副教授，博士，主要從事植物活性成分提取及開發(fā)等研究工作。

2015-07-04