桂亞利　毛雨　孔秋月　張小進(jìn)　劉莉　丁正年

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HSPA12A高表達(dá)于神經(jīng)組織

桂亞利毛雨孔秋月張小進(jìn)劉莉丁正年

目的研究熱休克蛋白70(HSP70)家族新成員HSPA12A的組織分布和細(xì)胞定位。方法采用免疫印跡和免疫熒光組織化學(xué)方法,分析成年小鼠7種不同組織中HSPA12A的表達(dá)，并探討其是否在成年、胚胎鼠神經(jīng)元中具有表達(dá)。結(jié)果(1) 在成年小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、骨骼肌這7種組織中,腦組織的表達(dá)量是其他組織的至少10倍以上(P<0.01);(2) HSPA12A在胚胎時(shí)期的鼠皮層神經(jīng)元中表達(dá);(3)HSPA12A在成年鼠的皮層神經(jīng)元中持續(xù)表達(dá)。結(jié)論HSPA12A 被首次證實(shí)在神經(jīng)組織中表達(dá)最高,且從胚胎時(shí)期到成年鼠皮層神經(jīng)元中均持續(xù)表達(dá),提示HSPA12A可能在神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持中具有重要作用。

HSPA12A; 腦; 神經(jīng)元

熱休克蛋白(HSP)是一個(gè)進(jìn)化過程中高度保守的多基因超家族,因在熱應(yīng)激的果蠅體內(nèi)首先發(fā)現(xiàn)而得名。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定出數(shù)十種熱休克蛋白,根據(jù)其分子量大小,分為如下幾個(gè)家族[1]:小分子HSP家族(HSPB),HSP70家族(HSPA),大分子HSP家族(HSPH),以及 DNAJ家族。在這些已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HSP中,針對(duì)HSP70家族成員的研究最為廣泛和深入。

研究發(fā)現(xiàn),HSP70家族在體內(nèi)的幾乎所有組織器官都有分布。2003年,Han等在主動(dòng)脈粥樣斑塊中克隆到2個(gè)新型HSP,分別命名為HSPA12A和HSPA12B,因其含有HSP70家族的特定結(jié)構(gòu)域而歸納到HSP70家族。我們前期研究發(fā)現(xiàn),HSPA12B完全不同于HSP70家族的其他成員廣泛表達(dá)的特征,而是特異性地表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并參與血管相關(guān)的病理生理事件[2-5]。然而,對(duì)于HSPA12A的生物學(xué)特性、生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)尚處于空白狀態(tài)。

本研究采用小鼠和體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元模型,用免疫印跡和免疫熒光組織化學(xué)法分析了HSPA12A在小鼠體內(nèi)不同組織和細(xì)胞中的分布狀況和特點(diǎn),以期為進(jìn)一步探索HSPA12A的功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3只8周齡SPF級(jí)近交系C57/BL6小鼠,購(gòu)買自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。

1.2組織收集小鼠戊巴比妥麻醉后,仰臥在手術(shù)臺(tái)上,分別游離和收集心臟、肝、肺、腎、脾、腦、骨骼肌等7種組織,液氮速凍后,-80 ℃保存。

1.3胚胎大鼠皮層神經(jīng)元分離和培養(yǎng)孕18 d鼠麻醉、取胎鼠,分離其皮層組織,剪成1 mm 3小塊,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化15 min后,玻璃滴管吹打、400目濾網(wǎng)過濾、1000 r/min離心4 min,重懸細(xì)胞到培養(yǎng)皿中進(jìn)行神經(jīng)元無血清培養(yǎng)。

1.4免疫印跡方法組織或細(xì)胞在蛋白裂解液中裂解后,10 000 r/min離心20 min,收集上清,BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE蛋白質(zhì)分離,轉(zhuǎn)膜后,5%牛奶封閉1 h, 抗HSPA12A抗體4 ℃孵育過夜,然后HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h, ECL反應(yīng)后,化學(xué)發(fā)光儀發(fā)光顯色。同一批蛋白的抗α-Tubulin免疫印跡作為蛋白質(zhì)上樣的內(nèi)參照。

1.5免疫熒光組織化學(xué)小鼠麻醉,取腦組織,4%多聚甲醛4 ℃固定過夜,30%蔗糖浸泡至組織塊下沉。接著OCT包埋,切成4 μm冰凍切片,2.5%正常羊血清封閉30 min,0.1%Triton×100處理15 min,與兔抗HSPA12A(1∶200)和鼠抗NeuN(1∶200)抗體同時(shí)孵育過夜(4 ℃),徹底清洗后,再將切片與FITC標(biāo)記的抗兔IgG、CY3-標(biāo)記的抗鼠IgG反應(yīng)1 h,熒光油封片,熒光顯微鏡(奧林巴斯,日本)下觀察,放大倍數(shù)為400倍。

2　結(jié)果

2.1HSPA12A蛋白在腦組織表達(dá)最高在所檢測(cè)的7種組織中,HSPA12A在腦組織中表達(dá)最高。腦組織HSPA12A蛋白水平分別是脾的17.8倍,肺的31.2倍,腎的10.1倍 (P<0.01)。見圖1。

圖1　HSPA12A在小鼠不同組織中的差異性表達(dá)(n=3)

2.2HSPA12A蛋白在大腦皮層神經(jīng)元中表達(dá)在成年鼠的腦組織冰凍切片上進(jìn)行抗HSPA12A以及神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN的免疫熒光組織化學(xué)分析后發(fā)現(xiàn),在小鼠大腦皮層中,HSPA12A蛋白出現(xiàn)在NeuN染色陽性的細(xì)胞中,提示HSPA12A表達(dá)于成年鼠大腦皮層的神經(jīng)元中(圖2)。

圖2　HSPA12A在成年小鼠大腦皮層神經(jīng)元中的表達(dá)(n=3)

2.3HSPA12A在胚胎大鼠原代海馬神經(jīng)元中表達(dá)我們進(jìn)一步研究HSPA12A是否在胚胎時(shí)期的大腦皮層神經(jīng)元就有表達(dá)。為此,我們分離并培養(yǎng)了孕18 d大鼠的胎鼠皮層神經(jīng)元,并在培養(yǎng)5 d時(shí)收集細(xì)胞,采用免疫印跡分析其中HSPA12A表達(dá)情況,抗α-Tubulin免疫印跡作為內(nèi)參照。結(jié)果顯示,HSPA12A確實(shí)在胚胎大鼠的皮層神經(jīng)元中即有表達(dá)(圖3)。

圖3　HSPA12A在胚胎鼠大腦皮層神經(jīng)元中的表達(dá)

3　討論

本研究首次證實(shí)HSPA12A在腦組織中表達(dá)最高,在胚胎鼠和成年鼠的大腦神經(jīng)元中均有表達(dá),這種從胚胎時(shí)期就開始的、在神經(jīng)組織偏好性的表達(dá)提示，HSPA12A可能在神經(jīng)元內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持中具有十分重要的意義。

HSPA12A是新發(fā)現(xiàn)的HSP70家族成員。HSP70家族包括[1]:HSPA1A, HSPA1B, HSPA1L,HSPA2,HSPA5,HSPA6,HSPA7,HSPA8,HSPA9,HSPA13,HSPA14,以及2003年克隆到的HSPA12A和HSPA12B。除HSPA12A和HSPA12B以外,其他HSP70成員呈現(xiàn)為廣泛性表達(dá)、無顯著組織偏好性,它們通過抗氧化應(yīng)激、 激活抗凋亡信號(hào)抑制細(xì)胞凋亡,從而對(duì)心、腦等重要臟器的缺血性損傷具有顯著保護(hù)作用。因此,HSP70家族在維持機(jī)體正常生理活動(dòng)中具有重要作用。

2003年Han等首次在人類和小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊中,同時(shí)克隆到HSPA12A和HSPA12B這2個(gè)基因。然而,與此前發(fā)現(xiàn)的HSP70成員不同的是,HSPA12B被首先證實(shí)特異性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,并參與血管相關(guān)的病理生理過程。例如,斑馬魚HSPA12B基因敲除后,其脈管系統(tǒng)數(shù)量減少、直徑變細(xì),從而導(dǎo)致斑馬魚的發(fā)育遲緩和體型縮小。我們課題組的前期研究也顯示,HSPA12B在血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)后,可以通過抑制血腦屏障通透性、激活A(yù)kt等機(jī)制,抑制腦缺血再灌注損傷,并激活eNOS依賴性血管新生信號(hào)、促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立,從而改善心肌梗死后的心功能不全和心肌重塑[2-7]。這些結(jié)果提示,HSPA12B的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)與其生物學(xué)功能是密切聯(lián)系的。

與HSPA12B同時(shí)且在同一組織中發(fā)現(xiàn)的,還有HSPA12A。迄今為止,有關(guān)HSPA12A的唯一報(bào)道,是在精神病患者的大腦皮層中發(fā)現(xiàn)HSPA12A表達(dá)較正常人顯著降低,但關(guān)于HSPA12A的組織分布和生物學(xué)功能幾乎處于空白狀態(tài)。本研究中,我們采用免疫印跡、免疫組織化學(xué)分析手段,首次證實(shí)HSPA12A從胚胎后期至成年階段的大鼠或小鼠的皮層神經(jīng)元中都持續(xù)表達(dá),且在腦組織中的表達(dá)最為豐富,是其他組織表達(dá)量的十倍、甚至幾十倍。這些結(jié)果提示了HSPA12A可能通過維持神經(jīng)元內(nèi)穩(wěn)態(tài),從而在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及出生后神經(jīng)系統(tǒng)的功能中具有非常重要的作用。我們將在后續(xù)研究中探索病理狀態(tài)下(如情緒應(yīng)激、腦缺血等),HSPA12A的表達(dá)變化及其生物學(xué)意義,為相關(guān)疾病的防治新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和鑒定奠定基礎(chǔ)。

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Expression of HSPA12A as a novel member of HSP70 family in brain and neurons

GUIYa-li,KONGQiu-yue,DINGZheng-nian.DepartmentofAnesthesiology;MAOYu,ZAHNGXiao-jin,LIULi.

DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

ObjectiveTo investigate the expression profile of HSPA12A in mammalian.MethodsImmunoblotting and immunofluorescence analysis were used to examine the protein abundance of HSPA12A in 7 types of tissue in murine and to analyze whether HSPA12A was expressed in fetal and adult cortex neurons.Results(1) HSPA12A expression was most abundant in brain, which was more than 10-fold than other tissue (P<0.01); (2) HSPA12A was expressed in fatal cortex neurons; (3) HSPA12A was expressed in adult cortex neurons.ConclusionsHSPA12A is preferably expressed in brain and exists in fetal and adult cortex neurons. The brains-preferred expression pattern suggests that HSPA12A may play an important role in the maintenance of cerebral homeostasis.

HSPA12A; brain; neuron

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81571290)

210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科(桂亞利， 孔秋月，丁正年)；老年醫(yī)學(xué)科(毛雨，張小進(jìn)， 劉莉)

丁正年，Email: zhengnianding@njmu.edu.cn

R 338

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2016.08.015

2016-04-20)