姜志艷，于肖夏，于卓*，張志成，石悅，姜超

(1.內蒙古農業(yè)大學農學院，內蒙古 呼和浩特 010019；2.內蒙古科技大學數理與生物工程學院，內蒙古 包頭 014010)

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利用SSR分子標記構建四倍體雜交冰草的遺傳連鎖圖譜

姜志艷1，2，于肖夏1，于卓1*，張志成1，石悅1，姜超1

(1.內蒙古農業(yè)大學農學院，內蒙古 呼和浩特 010019；2.內蒙古科技大學數理與生物工程學院，內蒙古 包頭 014010)

為構建四倍體雜交冰草分子遺傳連鎖圖譜，對深入開展冰草產量、抗性等重要性狀的QTL定位及分子標記輔助育種提供依據，以四倍體雜種F2分離群體的347個單株及親本蒙古冰草和航道冰草為材料，采用SSR分子標記技術和Joinmap 4.0軟件進行了遺傳作圖研究。試驗從256對SSR引物中篩選出條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的適宜引物30對，PCR擴增得到224個SSR標記位點，平均每對引物擴增出7.47個位點，其中多態(tài)性標記位點185個，占82.6%。偏分離分析顯示，在185個SSR多態(tài)性標記位點中有24個標記產生偏分離，占13.0%，符合植物遺傳作圖時通常偏分離標記比率<30%的要求，可用于遺傳作圖。構建了1張四倍體雜交冰草的分子遺傳連鎖框架圖譜，該圖譜包含14個連鎖群、185個標記，其長度范圍在123.0～202.6 cM之間，連鎖群LG4最長、LG12最短，各連鎖群的平均長度167.32 cM，覆蓋基因組總長度2342.5 cM，標記間的平均距離12.66 cM。

雜交冰草；四倍體；SSR標記；遺傳連鎖圖譜

冰草為多年生草本植物，隸屬于禾本科小麥族(Triticeae)。其抗逆性強、適應性廣，飼用和生態(tài)價值高，可用于退化的天然草地改良、人工草地建植及公路和鐵路護坡等水土保持[1-2]。四倍體雜交冰草(Agropyronmongolicum×A.cristatumcv. Fairway，2n=4x=28)是課題組利用國產蒙古冰草(A.mongolicum，2n=2x=14)與產自美國的航道冰草(A.cristatumcv. Fairway，2n=2x=14)相組配，人工去雄授粉雜交獲得的二倍體雜種F1，經秋水仙堿溶液加倍染色體而育成的優(yōu)良牧草，其既有母本蒙古冰草耐寒抗旱、適應性強等優(yōu)良特性，又有父本航道冰草再生性和分蘗性強、耐倒伏、葉量大、營養(yǎng)價值和產量高的特點[3-5]。

簡單序列重復SSR(simple sequence repeat)是一項成熟的DNA標記技術，因其具有重復性好、多態(tài)性豐富、標記呈共顯性等優(yōu)點，在作物品種和雜種真實性鑒定、種質資源遺傳差異分析、輔助選擇育種、分子遺傳連鎖圖譜建立等方面已得到應用[6-9]。由于大多數多年生禾本科或豆科牧草都具有多倍性和異花授粉等生物學特性[10]，其復雜的遺傳背景使得牧草的遺傳作圖、重要性狀QTL定位及分子標記輔助育種研究工作相比作物進展較慢。1993年Brummer等[11]最早利用RFLP分子標記構建了四倍體紫花苜蓿(Medicagosativa)的遺傳連鎖圖，之后在二倍體的羊茅(Festucaspp.)、黑麥草(Loliumspp.)、高丹草(Sorghum-Sudangrass)及二倍體雜交冰草等牧草上構建了分子遺傳連鎖圖譜[12-15]，而有關四倍體雜交冰草的遺傳作圖至今未見有研究報道。本試驗以四倍體雜交冰草F2群體為作圖材料，擬利用SSR分子標記技術構建四倍體雜交冰草分子遺傳連鎖圖譜，為深入開展四倍體冰草重要農藝性狀的QTL定位、分子標記輔助育種及基因圖位克隆等奠定基礎。

1　材料與方法

1.1供試材料

材料為四倍體雜交冰草F2群體的單株及其親本蒙古冰草和航道冰草，種植于呼和浩特市賽罕區(qū)內蒙古農業(yè)大學農場的飼草材料圃內。試驗于2014年5月—2015年5月在田間和室內進行。

1.2DNA的提取與純度檢測

從四倍體雜交冰草F2群體內隨機取347個單株及其父母本各10個單株的嫩葉，用北京天根公司生產的植物基因組試劑盒提取DNA，1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測其DNA純度后稀釋至50 ng/μL，置于-20℃冰箱中備用[16]。

1.3SSR-PCR擴增反應體系和程序

SSR-PCR擴增體系：反應液總體積為20 μL，其中含50 μmol/L 的10×Buffer 2.0 μL、2.5 mmol/L的 dNTP 2.0 μL、25 mmol/L的MgCl21.8 μL、50 μmol/L的Forward primer和 Reverse primer各 1.0 μL、5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.1 μL、模板DNA 1.0 μL、ddH2O 11.1 μL。SSR-PCR擴增程序：94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min[17]。

1.4PCR擴增產物檢測及SSR引物來源

PCR反應結束后，加入6.0 μL變性劑，于PCR儀上95℃變性5 min，用7%的變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，功率70 W，預電泳30 min，電泳時間2 h。電泳膠板在乙醇-冰乙酸溶液中固定，AgNO3溶液中染色，NaOH-甲醛溶液中顯影，風干后照相[18]。

試驗所用的256對SSR引物，是從NCBI網站公布的禾本科作物小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)和高粱(Sorghumbicolor)上開發(fā)的部分SSR引物中選取，送至上海生物工程有限公司進行合成。

1.5SSR多態(tài)性位點統(tǒng)計

按膠板點樣順序對每個位點上的多態(tài)性位點條帶進行記錄，有帶記為“1”，無帶記為“0”，帶型模糊不清或缺失的記為“—”，生成“0”和“1”組成的原始矩陣進行統(tǒng)計分析。多態(tài)性標記位點百分率計算公式：P(%)=(K/N)×100，式中,K為多態(tài)性位點數目、N為觀測位點總數[19]。同一SSR引物PCR擴增2～3次，統(tǒng)計電泳膠板條帶清晰穩(wěn)定后的多態(tài)性位點。

1.6SSR標記偏分離統(tǒng)計

依據孟德爾分離規(guī)律，四倍體雜交冰草F2群體基因型理論分離比為3∶1，將每個SSR標記的基因型數目進行卡方檢驗(χ2測驗)，凡P<0.05的SSR標記均列入偏分離標記之內。

1.7SSR分子遺傳連鎖圖譜構建

將統(tǒng)計的SSR標記數據中的“0”和“1”原始矩陣分別轉換成F2群體所要求的數據格式，應用計算機作圖軟件Joinmap 4.0，構建以SSR分子標記為基礎的四倍體雜交冰草的分子遺傳連鎖圖譜。具體步驟：開New project命令創(chuàng)建一個新的文件夾；選擇Options，設置參數即選擇作圖群體模式、群體數量和標記位點數；導入數據，選擇LOD Groupings (tree) 窗口，用Calculate命令進行標記連鎖分組(LOD=3.0～10.0)，選用LOD≥3.0標記連鎖組群，運行Create Groups for Mapping命令得到用于作圖的連鎖群；選擇Calculate map命令構建連鎖圖譜；用Map chart完成圖譜的繪制。

2　結果與分析

2.1各材料基因組DNA的純度檢測

用DNA試劑盒提取的四倍體雜交冰草F2群體347個單株及其親本的基因組DNA，其電泳條帶清晰穩(wěn)定、無降解、無蛋白和RNA污染(圖1)，表明各材料的DNA純度高，符合SSR分子標記試驗的要求。

圖1　F2群體部分單株基因組DNA電泳純度檢測Fig.1　Genomic DNA electrophoresis purity test of partial plants of the F2 population 　P1：蒙古冰草；P2：航道冰草；1-31：F2群體部分單株。M：Marker DL 2000.P1：A. mongolicum； P2：A. cristatum cv. Fariway；1-31：Partial plants of the F2 population.

2.2SSR引物篩選及多態(tài)性分析

用親本蒙古冰草和航道冰草及其四倍體雜種F2群體1個單株的基因組DNA為模板進行適宜引物篩選，從256對SSR引物中選出條帶清晰、重復性和多態(tài)性好的SSR適宜引物30對(表1，圖2)。

利用這30對引物對F2作圖群體347個單株及親本的DNA進行PCR擴增，共獲得224個位點，平均每對引物擴增出7.47個位點，其中多態(tài)性標記位點185個，平均多態(tài)性標記位點百分率為82.6%，表明該四倍體雜交冰草F2群體的SSR多態(tài)性豐富(圖3，表1)。

2.3SSR作圖標記的分離及遺傳連鎖圖譜特征分析

SSR標記分離及連鎖圖譜的基本特征如表2和圖4所示。經卡方檢驗表明，當P<0.05時，在已獲得的185個SSR多態(tài)性標記位點中，有161個標記符合孟德爾分離比例，其占標記總數的87.0%。另有24個SSR標記產生偏分離，偏分離比例僅為13.0%，符合植物遺傳作圖時通常偏分離標記比率<30%的要求[20]，這185個SSR分子標記均可用于遺傳作圖。

利用Joinmap 4.0軟件對185個SSR標記進行連鎖分析，構建出1張四倍體雜交冰草的SSR分子遺傳連鎖框架圖譜，該圖譜包含14個連鎖群、185個標記，14個連鎖群的長度范圍在123.0～202.6 cM之間，連鎖群LG12最短、LG4最長，各連鎖群的平均長度為167.32 cM，總長度為2342.5 cM，標記間的平均距離為12.66 cM。

表1　適宜SSR引物堿基序列及其多態(tài)性標記位點Table 1　Nucleotide sequence of SSR primers and polymorphic markers loci

圖2　用F2的1個單株及雙親的DNA對部分SSR引物篩選結果Fig.2　SSR primer screening result with one plant in F2 population and parents　F2：F2 的1個單株；P1：蒙古冰草；P2：航道冰草。 F2：One plant of hybrid F2；P1：A. mongolicum；P2：A. cristatum cv. Fariway.

圖3　引物D965(A)和F3974(B)對F2分離群體部分單株及其親本DNA的擴增結果Fig.3　DNA amplified results of partial plants of F2 segregating population in hybrid wheatgrass and their parents using the primer D965(A)and F3974(B)　P1：蒙古冰草；P2：航道冰草；1-55：F2群體部分單株。M：Marker DL 1000.P1：A. mongolicum；P2：A. cristatum cv. Fariway；1-55：F2 partial plants.

連鎖群Linkagegroups連鎖群長度Maplength(cM)連鎖標記數No.oflinkedmarkers偏分離標記數(P<0.05)No.ofbiasedmarkers偏分離標記比率Ratioofdistortedmarkers(%)標記間平均距離Averagedistance(cM)LG1174.95120.034.98LG2175.410220.017.54LG3180.850036.16LG4202.629413.86.99LG5195.31827.111.49LG6147.541611.83.60LG7150.512216.712.54LG8141.430047.13LG9151.230050.40LG10178.014321.412.71LG11161.32328.77.01LG12123.07114.317.57LG13178.41010.117.84LG14182.250036.44合計Total2342.51852413.012.66

圖4　四倍體雜交冰草SSR分子遺傳連鎖框架圖譜Fig.4　SSR genetic linkage map of tetraploid hybrid wheatgrass

3　討論

高密度的分子遺傳連鎖圖譜是深入開展植物重要性狀QTL定位及分子標記輔助育種等研究的基礎[21-22]。與小麥、玉米、水稻(Oryzasativa)等農作物構建的遺傳連鎖圖相比，目前國內外已構建的牧草遺傳連鎖圖譜的圖幅均偏小，且標記間空隙較大，使得遺傳圖譜在牧草分子標記輔助育種及重要性狀QTL定位等研究方面較薄弱。本課題組曾利用蒙古冰草×航道冰草雜種F2分離群體構建了含7個連鎖群、175個分子標記(AFLP標記152個、RAPD標記23個)的二倍體雜交冰草分子遺傳圖譜，其全長為416 cM，平均標記間密度為2.47 cM[15]；本試驗構建了含14個連鎖群、185個SSR標記的四倍體雜交冰草分子遺傳連鎖圖譜，其全長為2342.5 cM，遠超過二倍體雜交冰草圖譜的長度，表明四倍體的基因組明顯大于二倍體；但標記間的密度(12.66 cM)小于二倍體，而且在各連鎖群上標記的分布密度不均勻，如連鎖群LG6上的標記數較多，密集了40個SSR標記，而連鎖群LG8和LG9上SSR標記數均只有3個，這說明該圖譜是一張SSR框架圖譜，還有待于進一步擴大SSR標記數量或與其他分子標記如AFLP及SRAP等進行整合，來增加圖譜中的分子標記數目、加大圖譜密度，目前課題組正在開展四倍體雜交冰草遺傳連鎖圖譜的加密研究。

遺傳圖譜精確度的高低很大程度取決于構建群體的大小，理論上作圖群體越大，作圖精度就越高，但若作圖群體過大，就會使實驗工作量和費用相應增加，故選擇合適的群體數目很重要[23-24]。從作圖效率看，作圖群體的大小主要決定于3個方面：一是參照隨機分離的結果計算出最大圖距，二是兩個標記間能夠測算出重組的最小圖距，三是所選用作圖群體的類型。為了能夠提高作圖精度，在構建植物分子標記連鎖圖時需考慮作圖群體的類型，一般認為作圖所需的群體大小的順序為F2>Rl>BC和DH[25]。目前在牧草上遺傳圖譜構建所用的作圖群體在100～200個之間，本試驗選用四倍體雜交冰草F2分離群體的347個單株進行遺傳作圖研究，主要考慮多年生牧草的多倍性，其數量性狀分離復雜且表型受環(huán)境影響較大，因此控制試驗誤差顯得尤為重要。

4　結論

試驗篩選出條帶清晰、重復性和多態(tài)性好的SSR適宜引物30對。對四倍體雜交冰草F2群體347個單株及親本的基因組DNA進行PCR擴增得到185個SSR標記。構建了1張四倍體雜交冰草SSR分子遺傳連鎖框架圖譜，其14個連鎖群的長度變幅123.0～202.6 cM，覆蓋基因組總長度2342.5 cM，標記間的平均距離12.66 cM。

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*Construction of a genetic linkage map for tetraploid hybrid wheatgrass using a SSR molecular marker

JIANG Zhi-Yan1,2，YU Xiao-Xia1，YU Zhuo1*，ZHANG Zhi-Cheng1，SHI Yue1，JIANG Chao1

1.AgronomyCollege，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Huhhot010019，China；2.SchoolofMathematics,PhysicsandBiologicalEngineering，InnerMongoliaUniversityofScience&Technology，Baotou014010，China

To establish a genetic linkage map in tetraploid hybrid wheatgrass genetic mapping was conducted using a simple sequence repeats (SSR) molecular marker technique with ‘Joinmap’ 4.0 software. 347 individuals from the F2segregating population and their parents were utilized, this helped lay the foundation for further study of marker-assisted breeding, and quantitative trait locus (QTL) location of important traits in wheatgrass, such as disease resistance and yield. Thirty optimal primers with clear, stable and high polymorphic bands were screened from 256 tested SSR primers. A total of 224 SSR loci were obtained from polymerase chain reaction (PCR) amplification with an average of 7.47 loci per primer, of which 185 were polymorphic loci, accounting for 82.6% of all loci. Segregation distortion analysis showed that a total of 24 loci were distorted, accounted for 13.0% of all (185) polymorphic loci, which met the requirement of <30% segregation distortion for plant genetic mapping. These polymorphic loci would be useful for genetic mapping. In this study, a molecular genetic linkage map of tetraploid hybrid wheatgrass was constructed which contained 185 loci and 14 linkage groups with length ranging from 123.0 to 202.6 cM. The longest and the shortest linkage group were LG4 and LG12, respectively. The average length of each linkage group was 167.32 cM, total length of the genome was 2342.5 cM and the average marker distance was 12.66 cM.

hybrid wheatgrass; tetraploid; SSR marker; genetic linkage map

10.11686/cyxb2015410

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-09-06；改回日期：2015-10-21

國家自然科學基金面上項目(31172254)資助。作者簡介：姜志艷(1976-)，女，內蒙古包頭人，講師，博士。E-mail: L2359916@sina.com

Corresponding author. E-mail：yuzhuo58@sina.com

姜志艷，于肖夏，于卓，張志成，石悅，姜超. 利用SSR分子標記構建四倍體雜交冰草的遺傳連鎖圖譜. 草業(yè)學報, 2016, 25(6): 94-101.

JIANG Zhi-Yan，YU Xiao-Xia，YU Zhuo，ZHANG Zhi-Cheng，SHI Yue，JIANG Chao. Construction of a genetic linkage map for tetraploid hybrid wheatgrass using a SSR molecular marker. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(6): 94-101.