趙炳祥　董　禮［華潤(rùn)三九（雅安）藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000］

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HPLC法快速測(cè)定生脈注射液指紋圖譜*

趙炳祥董禮△
［華潤(rùn)三九（雅安）藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000］

目的采用小粒徑色譜柱和HPLC法，建立生脈注射液指紋圖譜快速測(cè)定方法。方法 色譜柱采用Waters X-BridgeTMBEH Shield RP18（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫；流速為2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為4 μL。檢測(cè)10批生脈注射液，并建立對(duì)照指紋圖譜。以指紋圖譜輪廓計(jì)算快速法對(duì)照指紋圖譜與法定對(duì)照指紋圖譜相似度。結(jié)果 快速法對(duì)照指紋圖譜與法定對(duì)照指紋圖譜相似度為0.944。結(jié)論快速測(cè)定法色譜輪廓與法定標(biāo)準(zhǔn)法一致。該方法檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、可靠，可取代法定標(biāo)準(zhǔn)中指紋圖譜檢測(cè)法。

指紋圖譜生脈注射液快速測(cè)定相似度

【Abstract】Objective：To establish a rapid detection of the fingerprint of Shengmai injection with small diameter column and HPLC method.Method：The analysis was performed on a Waters X-BridgeTMBEH Shield RP18（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）.Mobile phase was acetonitrile-water with gradient elution；flow rate was 2.0mL/min；detection wavelength at 203 nm；column was 30℃，and injection volume was 4 μL.Then it conducted a new standard fingerprint by ten batches of Shengmai injection detection with the new method，and rapid method for calculating contour of fingerprints were compared between new standard fingerprint and legal standard fingerprint with profile data to find out the similarity.Result：The similarity between rapid standard fingerprint and legal standard fingerprint was 0.944.Conclusion：The chromatographic profile of the new method IS consistent with the legal standard chromatographic profile.And it is rapid，accurate and stable，which can replace the detection method of fingerprint in legal standard.

【Key words】Fingerprint；Shengmai injection；Rapid detection；Similarity

生脈注射液為華西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院根據(jù)我國(guó)古驗(yàn)方“生脈散”研制而成的中藥注射劑，由紅參、麥冬、五味子3味藥組成［1］。廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病（如心力衰竭、低血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛、心律失常、心肌梗死、腦梗死等）的治療，并取得了良好的治療效果［2-4］。2011年10月25日，由國(guó)家藥典委員會(huì)審定，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布正式執(zhí)行生脈注射液新質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［5］。該標(biāo)準(zhǔn)在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)，對(duì)生脈注射液的質(zhì)量穩(wěn)定性、有效性控制起著十分重要的作用。近年來(lái)，隨著超高效（快速）液相色譜（UPLC、UHPLC）的應(yīng)用，小粒徑色譜迅速進(jìn)入了色譜分析領(lǐng)域。超高效液相色譜能顯著改善色譜峰的分離度和檢測(cè)靈敏度，同時(shí)大大縮短分析周期，適用于微量復(fù)雜混合物的分離和高通量研究［6］。但是超高效（快速）液相色譜系統(tǒng)的價(jià)格昂貴、市場(chǎng)占有率較低、企業(yè)配置UPLC或UHPLC較少。因此，利用HPLC分析系統(tǒng)，結(jié)合小粒徑色譜柱，建立快速、準(zhǔn)確的生脈注射液指紋圖譜分析方法，是本文研究的主要目的。

1　材料與方法

1.1儀器與材料Agilent 1260高效液相色譜儀 （安捷倫科技有限公司，泵模塊型號(hào)：G1311B），METTLER TOLEDO XA205DU型電子天平 （梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）。乙腈（色譜純，Merk）；超純水；人參皂苷Rg1（批號(hào) 110703-200726）、Re（批號(hào)110754-200822）、Rb1（批號(hào)110704-200420）、五味子醇甲（批號(hào)110857-201010）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。生脈注射液由雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2色譜條件采用Waters X-BridgeTMBEH ShieldRP18（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）色譜柱；乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～6min，0%A→10%A；6～8 min，10%A→23%A；8～10 min，23%A→23%A；10～17 min，23%A→60%A；17～19 min，60%A→100%A）；流速2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量4 μL［7］。

1.3參照物溶液的制備取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、五味子醇甲適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含0.10 mg、0.08 mg、0.20 mg和0.02 mg的混合溶液，即得［5］。

1.4供試品溶液的制備取生脈注射液適量，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

1.5精密度試驗(yàn)取同1份供試品溶液，按“1.2”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定特征峰（17個(gè)）相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明精密度良好。

1.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品6份，按“1.2”項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣，測(cè)得其特征峰（17個(gè)）峰面積相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD均小于3.5%，表明重復(fù)性良好。

1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液，按“1.2”項(xiàng)下條件分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，其特征峰（17個(gè)）峰面積相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD均小于3.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.8耐用性試驗(yàn)取同一份供試品溶液，按“1.2”項(xiàng)下條件在另外2臺(tái)Agilent 1260高效液相色譜儀中進(jìn)樣，記錄色譜圖，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2.0版）”軟件計(jì)算相似度，3個(gè)色譜圖相似度（17個(gè)特征峰匹配）為1.00，表明該方法儀器間使用耐用性良好。

2　結(jié)　果

2.1對(duì)照指紋圖譜的建立見(jiàn)圖2。按“1.2”項(xiàng)色譜方法，檢測(cè)10批生脈注射液供試品，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1；選擇穩(wěn)定性好、吸收強(qiáng)、特征明顯的色譜峰為共有峰，共選定17個(gè)峰。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2.0版）”軟件，以特征峰匹配，建立對(duì)照指紋圖譜。

圖1　快速法生脈注射液指紋圖譜

圖2　快速法生脈注射液　對(duì)照指紋圖譜

2.2相似度評(píng)價(jià)對(duì)比新建對(duì)照指紋圖譜和法定對(duì)照指紋圖譜（圖3），兩者色譜圖出峰相似；但二者色譜圖相似度具體多少，需要進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究以標(biāo)準(zhǔn)圖譜輪廓數(shù)據(jù)點(diǎn)相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.3指紋圖譜輪廓預(yù)處理將新建對(duì)照指紋圖譜輪廓所有數(shù)據(jù)點(diǎn)乘以5，保存輪廓數(shù)據(jù)。導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2.0版）”軟件，與法定對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行特征峰匹配（17特征峰），見(jiàn)圖4。將匹配后的新建對(duì)照?qǐng)D譜和法定對(duì)照?qǐng)D譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出，得到匹配后的數(shù)據(jù)點(diǎn)。進(jìn)一步刪除多余數(shù)據(jù)點(diǎn)，最終得到5200組信號(hào)數(shù)據(jù)。

圖3　　生脈注射液法定對(duì)照指紋圖譜

圖4　　數(shù)據(jù)點(diǎn)匹配后的　對(duì)照指紋圖譜

2.4對(duì)照?qǐng)D譜相似度計(jì)算對(duì)2.3處理后的圖譜數(shù)據(jù)，利用夾角余弦法［8］計(jì)算新對(duì)照指紋圖譜和法定對(duì)照指紋圖譜的相似度，結(jié)果相似度為0.944，說(shuō)明快速指紋圖譜法所測(cè)指紋圖譜與法定標(biāo)準(zhǔn)法所測(cè)指紋圖譜相似度高，可以取代法定標(biāo)準(zhǔn)法。

3　討　論

利用HPLC研究生脈注射液指紋圖譜，分析時(shí)間較長(zhǎng)，大約100 min［9-10］；而利用超高效液相色譜（UPLC）建立生脈注射液指紋圖譜，分析時(shí)間約25～40 min［11-12］；本研究建立的指紋圖譜分析方法為19 min，大大提高了分析效率。已報(bào)道采用 Waters X-BridgeTMBEH Shield RP18（4.6×100 mm，2.5 μm）色譜柱，建立了參麥注射液指紋圖譜快速測(cè)定法，利用峰面積相似度評(píng)價(jià)快速指紋圖譜法與法定方法檢測(cè)結(jié)果的一致性［7］。本研究以生脈注射液為研究對(duì)象，建立生脈注射液的快速測(cè)定法，并利用輪廓相似度評(píng)價(jià)色譜圖的一致性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)快速指紋圖譜法所測(cè)指紋圖譜輪廓與法定標(biāo)準(zhǔn)法輪廓基本一致。生脈注射液指紋圖譜色譜圖輪廓，能全面反映色譜圖的所有信息，保持了中藥多成分信息的完整性［13-15］；以色譜圖輪廓信息進(jìn)行相似度計(jì)算，相對(duì)于特征峰面積相似度計(jì)算，更能反應(yīng)快速分析方法與法定分析方法的一致性。

生脈注射液指紋圖譜快速分析法，分析速度快、結(jié)果穩(wěn)定、與法定方法結(jié)果一致，可取代法定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜檢測(cè)方法。

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Rapid Detection of Fingerprint of Shengmai Injection by HPLC

ZHAO Bingxiang，DONG Li.China Re-sources Sanjiu（Ya′an）Pharmaceutical Co.，Ltd.，Sichuan，Ya′an 625000，China.

R91文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）06-0965-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.007

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)（2009ZX09502-030）

△（電子郵箱：dongli@ya999.com）

（2015-12-20）