湯海峰, 姜　丹, 孟令軍, 王　迪, 王彥峰, 劉　艷

(吉林大學 生命科學學院, 吉林 長春　130012)

?

熒光定量法分析液體發(fā)酵中雜菌污染的實驗設計

湯海峰, 姜丹, 孟令軍, 王迪, 王彥峰, 劉艷

(吉林大學 生命科學學院, 吉林 長春130012)

設計了利用熒光定量PCR法檢測基因工程菌液體發(fā)酵過程中雜菌污染的實 驗方法。實驗結果表明,與純培養(yǎng)相比,在由重組大腸桿菌JM109、枯草芽孢桿菌和少量未知雜菌組成的多元共培養(yǎng)體系中,重組大腸桿菌JM109的生長和枯草芽孢桿菌的生長均被抑制。在發(fā)酵終點兩種菌體在發(fā)酵液中的總量與大腸桿菌的初始接種量具有顯著的相關性。通過將核酸快速提取、熒光定量PCR和微生物生長特性分析等多項實驗技術有機結合,形成一個綜合性實驗項目并應用于本科生實驗教學,提高了本科生生物學綜合實驗技能。

染菌檢測; 熒光定量; 液體發(fā)酵

人們對生物活性物質(zhì)的需求不斷提高,通過天然成分的分離提取已經(jīng)難以滿足巨大的市場需求?；蚬こ叹l(fā)酵技術通過定向改造微生物或動植物細胞并進行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng),實現(xiàn)了生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)以滿足市場需求。目前,基因工程菌發(fā)酵技術已經(jīng)被用來生產(chǎn)人胰島素、人細胞白介素、人干擾素、人溶菌酶以及各種人用或動植物用疫苗[1-6]。

在生物活性物質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn)過程中防范和控制雜菌污染是重要環(huán)節(jié)之一。發(fā)酵過程中雜菌會抑制目標細胞的生長從而降低活性物質(zhì)的產(chǎn)量、增加生產(chǎn)成本。目前,在發(fā)酵過程中檢測雜菌污染的手段主要有鏡檢、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、異常觀察等[7],但這些方法只能進行定性分析,而不能進行定量檢測。

熒光定量PCR技術是由美國Applied Biosystems 公司推出的一種定量檢測技術。該技術由于反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰而被廣泛應用于疾病診斷和食品安全檢測等領域[8]。該技術在基因的差異表達研究中也具有明顯優(yōu)勢。但由于操作復雜、實驗周期長、對操作人員和實驗室環(huán)境要求較高等因素,該技術很難進行本科生課內(nèi)實驗教學。為了使學生能夠掌握先進的分析手段,加強學生實踐能力和對知識的綜合應用能力的培養(yǎng),本研究設計了一個利用相對定量法分析基因工程菌發(fā)酵過程中雜菌污染后目標菌體和雜菌生長特性的實驗方法。

1　實驗材料與試劑

1.1菌株

測試菌:大腸桿菌JM109,已導入含有白介素-18基因的重組PUC-18質(zhì)粒。

背景菌:枯草芽孢桿菌。

以上菌株由本實驗室保藏。

1.2引物

實驗所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并給出Tm(溶解溫度)值。

表1　引物序列與Tm值

1.3其他試劑

iTag University SYBR Green Supermix購自美國Biorad公司；氯化鈉購自北京化工廠；蛋白胨和酵母浸粉購自英國OXOID公司；晶芯?通用型細菌DNA快速提取試劑盒購自北京博奧生物集團有限公司。

2　實驗儀器

熒光定量PCR儀(美國Biorad公司)；核酸快速提取儀(北京博奧生物集團有限公司)；迷你高速離心機(美國Eppendorf公司)；迷你離心機(美國Wealtec公司)；微量移液器(美國Eppendorf公司)；恒溫搖床(美國NBS公司)；恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；752N型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)

3　實驗方法

3.1大腸桿菌液體培養(yǎng)

配制液體LB培養(yǎng)基(10 g/L 蛋白胨,5 g/L 酵母浸粉,10 g/L 氯化鈉),精確分裝于100 mL三角瓶中,每瓶40 mL；將過夜培養(yǎng)的背景菌種子液按體積分數(shù)2%接種量接種于液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min培養(yǎng)50～60 min,至菌液稍有渾濁；按表2 的梯度接種過夜培養(yǎng)的測試菌種子液,37 ℃、150 r/min培養(yǎng)4～5 h,至樣品A在波長600 nm處的光吸收處于0.6～0.8之間(對數(shù)生長期)。

表2　背景菌與測試菌的接種量

3.2基因組DNA提取

培養(yǎng)完畢后,分別于各樣品中取0.5 mL培養(yǎng)液,12 000 r/min離心5 min,棄上清，利用細菌DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA。具體步驟:(1) 加50 μL提取液懸浮菌體后轉入提取管中；(2)將提取管放入核酸快速提取儀中,最大轉速震蕩5 min；(3)將提取管放入95 ℃水浴中保溫5 min；(4)12 000r/min離心5 min,取上清稀釋,備用。

3.3熒光定量分析

分別利用引物對IL-B/IL-P擴增測試菌中白介素-18基因[9],利用引物對ITS3/ITS4擴增各菌體成分的rDNA-ITS2區(qū)[10](見表1)。按比例配制反應體系(見表3),離心后進行熒光定量擴增。熒光定量擴增反應程序:(1) 95 ℃ 預變性5 min；(2)95 ℃變性10 s；(3)60 ℃擴增60 s；(4)讀板；(2)～(4)進行40個循環(huán)。

表3　熒光定量PCR反應體系

4　結果與分析

4.1共培養(yǎng)體系中大腸桿菌生長特性分析

大腸桿菌因其遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉化和轉導效率高、生長繁殖快、培養(yǎng)成本低廉而被廣泛應用于構建重組蛋白表達系統(tǒng)[11]。本研究中使用含有重組PUC-18/白介素-18質(zhì)粒的大腸桿菌JM109作為測試菌株,接種量設置了不同的梯度(見表2)。發(fā)酵結束時白介素-18基因的拷貝數(shù)與測試菌菌體總量具有線性相關性。因此通過定量白介素-18基因可以確定各樣品中測試菌的菌體總量。利用引物對IL-B/IL-P對白介素-18 基因進行熒光定量擴增時所得到的Ct值(循環(huán)閾值)隨測試菌初始接種量的梯度增加呈梯度下降趨勢(見表4)。將各樣品Ct值與測試菌初始接種量的常用對數(shù)進行線性擬合得到了很好的線性關系(R2=0.924,見圖1)。結果表明:培養(yǎng)結束后各樣品中菌體總量與接種量呈線性相關。由此可見,熒光定量PCR技術可以用于對液體發(fā)酵中微生物生長情況進行定量分析。本實驗采用了相對定量法,即對不同初始接種量的各樣品在發(fā)酵終點時測試菌的相對數(shù)量進行了比較分析。如果在實驗過程中制作“Ct值-菌體濃度”標準曲線,則可以進行絕對定量分析。

表4　利用引物對IL-B/IL-P和ITS3/ITS4進行熒光定量擴增后的Ct值

圖1　利用引物對IL-B/IL-P擴增后各樣品的Ct值與測試菌初始接種量對數(shù)值的線性關系

樣品A與樣品K同為40 μL的接種量,但是樣品A預先接種背景菌而樣品K作為對照沒有預先接入背景菌。二者的Ct值分別為22.12和17.68?？梢?樣品A中白介素-18基因拷貝數(shù)要明顯少于樣品K。這是由于樣品A中的背景菌抑制了測試菌的生長,導致培養(yǎng)結束后菌液中測試菌總量低于樣品K。本研究選取自然界中普遍存在且易與其他微生物共存的枯草芽孢桿菌作為背景菌,其在生長過程中會產(chǎn)生多種抗生素而抑制其他微生物的生長[12-13]。因此各樣品中的測試菌由于受到了背景菌的抑制而生長緩慢。但是由于背景菌的濃度相同,各樣品所受的抑制程度相同,因此各樣品中測試菌的總量依然與初始接種量具有正向線性關系。樣品K的Ct值與樣品H近似相等(分別為17.68和17.86),而樣品H接種量為800 μL,可見在有背景菌的情況下800 μL的接種量相當于沒有或有較少雜菌時40 μL的接種量在發(fā)酵終點所產(chǎn)生的測試菌總量。因此可以初步推測本實驗體系中背景菌對目標菌的抑制率約為95%。

樣品L為陰性對照,但熒光定量擴增結果顯示其含有測試菌。這是由于培養(yǎng)基未進行滅菌處理,相關操作也沒有在無菌室中進行,而本實驗長期培養(yǎng)該重組菌,致使該菌通過實驗器材等進入到了陰性對照培養(yǎng)基中。其Ct值為26.24,低于其他各樣品,可見其含量較低。

4.2共培養(yǎng)體系中背景菌的生長特性分析

由于ITS區(qū)在微生物中廣泛存在并具有一定的保守性,因此可以通過利用通用引物對擴增ITS區(qū)來檢測微生物的存在。引物對ITS3/ITS4擴增的是微生物的rDNA-ITS2區(qū)[10](見圖2)。因為重組大腸桿菌JM109沒有該引物對的擴增位點,所以該引物對可以用來檢測該菌發(fā)酵時的雜菌污染。

圖2　引物對ITS3/ITS4擴增位點示意圖

利用引物對ITS3/ITS4對各樣品進行熒光定量PCR擴增后所得到的Ct值與大腸桿菌的接種量具有正向相關(見表4)?？梢婋S著測試菌接種量的提高背景菌的Ct值亦升高,即背景菌的總量降低。由此可見,測試菌對背景菌具有一定的抑制作用,而且抑制強度隨測試菌初始接種量的增加而加強。將Ct值與測試菌初始接種量的常用對數(shù)進行線性擬合可以得到明顯的正向相關趨勢(見圖3)。

圖3　利用引物對ITS3/ITS4擴增后各樣品的Ct值與測試菌初始接種量對數(shù)值的線性關系

樣品L作為陰性對照只接種了背景菌,沒有接種測試菌,其Ct值明顯低于其他樣品的Ct值?？梢姌悠稬中背景菌的總量要高于其他樣品,進一步證明了測試菌對雜菌的抑制作用。由于共培養(yǎng)時,培養(yǎng)基中的成分消耗速度較純培養(yǎng)快,導致培養(yǎng)基迅速達到寡營養(yǎng)狀態(tài),從而抑制了共培養(yǎng)體系中各菌體組分的生長[13]。

4.3測試菌中白介素-18基因與背景菌rDNA-ITS2區(qū)的拷貝數(shù)

利用引物對IL-B/IL-P擴增白介素-18基因時,各樣品的Ct值處于17.68與22.12之間，而利用引物對ITS3/ITS4擴增rDNA-ITS2區(qū)時,各樣品的Ct值處于28.19至35.18之間。兩組Ct值相差10個循環(huán)左右。若每個目的DNA片段都是單拷貝,兩組Ct值的差異顯示發(fā)酵終點時各樣品中測試菌的數(shù)量要明顯多于背景菌的數(shù)量。但在該實驗體系下背景菌對測試菌具很強的抑制作用,顯然在任一樣品中(樣品K除外)測試菌的數(shù)量不可能多于背景菌。因此可以判斷白介素-18基因在測試菌中一定是多拷貝的。本實驗所用的克隆載體為PUC-18質(zhì)粒,屬松弛型質(zhì)粒,每個菌體中至少含有10～15個拷貝。所以在各樣品中雖然目標菌的數(shù)量較少,但由于菌體中多拷貝的白介素-18基因?qū)е缕銫t值遠低于背景菌。

導致白介素-18基因的Ct值降低的另一個原因是擴增效率。引物對IL-B/IL-P的Tm值分別為65.9 ℃和69.7 ℃,而引物對ITS3/ITS4的Tm值分別為59.8 ℃和55.8 ℃。最佳的退火溫度一般比Tm值低5 ℃左右。而本實驗采用兩步法進行熒光定量擴增,退火溫度和擴增溫度同為60 ℃。所以引物對IL-B/IL-P有更高的擴增效率。

5　教學實踐

本實驗項目是吉林大學國家級生物實驗教學示范中心為本科生設計的實驗項目之一。項目承接分子生物學實驗和生物科學(技術)專業(yè)實驗兩門課程,是其內(nèi)容的延伸。在前兩門實驗課程中,本科生分別構建了重組人白介素-18克隆載體和表達載體并轉化到了受體菌中,通過PCR、誘導表達和免疫印跡進行了鑒定。本實驗項目是利用以上實驗成果繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)及雜菌污染檢測分析,使學生了解并掌握基因工程的中下游實驗技術,完善了學生的知識體系。該實驗項目在教學過程中可以按照8個學時來組織教學(見表5)。

表5　本項目的學時分配與教學安排

測試菌和背景菌種子液制備時需要過夜培養(yǎng),由教師完成。學生從配制培養(yǎng)基開始,培養(yǎng)基不需要滅菌,實驗全程也無需無菌操作。接種背景菌的目的是人為產(chǎn)生發(fā)酵前期染菌的狀態(tài)。由于培養(yǎng)基沒有滅菌,所以也可以不接種背景菌,但需要較長的預培養(yǎng)時間,否則大腸桿菌由于生長迅速會在短時間內(nèi)占據(jù)優(yōu)勢,并抑制背景菌生長。本實驗背景菌選用枯草芽孢桿菌,其生長速度雖然較測試菌慢,但能明顯抑制測試菌生長,其與測試菌組成的共培養(yǎng)體系很好地反應了發(fā)酵染菌后的各菌體成分的生長特性。

為了節(jié)省實驗學時,實驗原理講授安排在預培養(yǎng)等待期間進行。測試菌的接種量梯度要合理設置,以保證熒光定量分析時Ct值具有明顯的梯度差,利于數(shù)據(jù)分析。在DNA提取時,本實驗采用高通量核酸快速提取儀,每個樣本只需15～20 min,一次可以同時提取36個樣本,既節(jié)省了實驗時間，又使學生掌握了核酸快速提取方法。

6　結論

(1) 本研究建立了利用熒光定量PCR法檢測基因工程菌液體發(fā)酵過程中雜菌污染的實驗方法。該方法的關鍵是合理確定兩個參比DNA片段。在測試菌中兩條參比DNA片段的拷貝數(shù)要具有一定的穩(wěn)定性。利用熒光定量法確定兩條參比DNA片段在測試菌中拷貝數(shù),并將其比值作為基數(shù)。染菌后發(fā)酵液菌體中提取的DNA按相同的方法進行定量分析后,若兩條參比DNA片拷貝數(shù)比值偏離基數(shù)一定值則可判斷染菌。兩條參比DNA片段在測試菌中拷貝數(shù)的比值與在雜菌中拷貝數(shù)的比值差異越大,檢測的靈敏度越高。本實驗選擇了重組DNA片段和rDNA-ITS2區(qū)作為兩條參比DNA片段。重組DNA片段擴增時背景菌顯示為陰性,利用引物對ITS3/ITS4擴增rDNA-ITS2區(qū)時測試菌顯示為陰性。選擇的兩條DNA片段的拷貝數(shù)不但穩(wěn)定而且分別在測試菌和背景菌中具有唯一性。

(2) 本項目通過人為接種枯草芽孢桿菌的方法制造了發(fā)酵過程中雜菌污染的狀態(tài)。通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn):在利用大腸桿菌作為載體進行基因工程菌發(fā)酵時以枯草芽孢桿菌為主的雜菌污染會明顯抑制大腸桿菌的生長。但是由于大腸桿菌的代時短、競爭力強,其生長并不能被完全抑制。同時大腸桿菌的生長也對雜菌表現(xiàn)出了一定的抑制作用。

(3) 該實驗融合了核酸快速提取技術、熒光定量分析技術、共培養(yǎng)技術和微生物生長特性分析等方面的技能點,培養(yǎng)了學生對多學科知識的綜合運用能力,加強了學生的實踐技能和創(chuàng)新能力。

(4) 本研究利用微生物繁殖速度快的優(yōu)勢設計了簡化的相對定量模型,簡化了實驗流程,縮短了實驗周期,降低了實驗成本,使其適合本科生實驗教學，使本科生有機會在實驗課堂上學習熒光定量操作技術,開闊了學生的視野,激發(fā)了學生參與實驗、參加科研的積極性和主動性。

References)

[1] 黃秀梅,葉子堅,李鶴賓,等.重組人胰島素原基因高效表達和純化的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報,2014,36(2):418-421.

[2] 李民,楊立宏,任紅玉,等.高密度培養(yǎng)大腸桿菌YK537/pSBHL-11生產(chǎn)重組人細胞白介素-3[J].生物工程學報,1999,15(4):470-476.

[3] 王曉沁,閆玉清,趙濱強,等.人γ-干擾素生產(chǎn)工藝研究[J].生物工程學報,1998,14(2):203-207.

[4] 陳晶晶,陳勁春.巴斯德畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)重組人溶菌酶[J].北京化工大學學報,2006,33(6):34-37.

[5] 王寧,劉穎,李媛媛,等.復制型重組豆苗活載體疫苗生產(chǎn)工藝研究[J].中國生物制品學雜志,2008,21(2):131-132,138.

[6] 唐雨德,顧志香,劉玉,等.豬囊蟲病基因工程苗的生產(chǎn)工藝研究[J]. 中國獸醫(yī)科技,2000,30(10):8-11.

[7] 郝常明,趙建鋒,黃雪菊.生物發(fā)酵染菌問題的探討[J].醫(yī)藥工程設計,2007,28(2):11-15.

[8] 任廣睦,劉季,王英元.實時熒光定量PCR技術應用于核酸定量檢測的研究進展及展望[J].山西醫(yī)科大學學報,2006,37(9):973-976.

[9] 趙向陽.人白介素-18的基因合成、原核表達與生物學活性初步研究[D].長春:吉林大學,2009.

[10] White T J, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RAN genes for phylogenetics[M]//PCR-protocols and applications-A Laboratory manual.New York: Academic Press,1990:315-322.

[11] Nuc P,Nuc K.Recombinant protein production in Escherichia coli[J].Postepy Biochem,2006,52(4):448-456.

[12] 李春鳳,林顯華,谷巍.枯草芽孢桿菌在飼料生產(chǎn)及環(huán)境防治中的應用[J].中國飼料,2013(1):10-12,17.

[13] 黃兵,劉寧,黃英,等.放線菌與枯草芽孢桿菌的共培養(yǎng)及其對活性次生代謝產(chǎn)物的影響[J].生物工程學報,2009,25(6):932-940.

Design of experiment to analyze characteristics of microorganism growing in contaminated environment using Q-PCR technique

Tang Haifeng, Jiang Dan, Meng Lingjun, Wang Di, Wang Yanfeng, Liu Yan

(School of Life Sciences,Jilin University,Changchun 130012, China)

This work designed an experimental work flow detecting the contamination using Q-PCR technique during fermenting genetically engineered bacterium. By analyzing the better fitting between Ct value and initial inoculum dosage of Escherichia coli JM109,the conclusion could be drawn that microorganism will inhibit each others in co-culture system. By performing this work flow in teaching,the practical ability of undergraduates will be improved,because this work flow can integrate the fast extracting nucleic acid technique,Q-PCR technique and analyze characteristics of microorganism growing in contaminated environment.

detecting contamination; Q-PCR; liquid fermentation

DOI:10.16791/j.cnki.sjg.2016.06.014

2015-10-02修改日期:2016-02-17

吉林大學實驗技術項目資助“Q-PCR實時檢測液體發(fā)酵雜菌污染功能的開發(fā)”

湯海峰(1980—)，男，吉林長春，在讀博士研究生，工程師，主要從事分子生物學實驗課程的教學研究

E-mail:tanghf@jlu.edu.cn

劉艷(1975—)，女，吉林長春，博士，高級工程師，主要從事實踐教學研究.

TQ920.1;G642.0

A

1002-4956(2016)6-0050-05