沈雷，沙峰，孫權(quán)，張鵬，孫石柱，張曉東，姚立杰，李靜平

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 解剖教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

?

白細(xì)胞介素8對(duì)高糖誘導(dǎo)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*

沈雷，沙峰，孫權(quán)，張鵬，孫石柱，張曉東，姚立杰，李靜平

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 解剖教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

目的探討白細(xì)胞介素8（IL-8）對(duì)高糖誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（hAdMSC）損傷的保護(hù)作用。方法含250 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基建立細(xì)胞高糖模型；P65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人IL-8基因到hAdMSC為IL-8轉(zhuǎn)染組，僅轉(zhuǎn)染P65質(zhì)粒者為P65對(duì)照組，在IL-8轉(zhuǎn)染組中添加PD98059為Erk抑制劑組。利用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、ELISA或流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組hAdMSC增殖的光密度值（OD值）、Caspase-3、Erk或VEGF等蛋白的表達(dá)。結(jié)果與P65對(duì)照組比較，IL-8轉(zhuǎn)染組hAdMSC增殖OD值明顯升高，Caspase-3蛋白表達(dá)下降（P＜0.01）；IL-8轉(zhuǎn)染組Erk蛋白活性和VEGF蛋白含量明顯高于P65對(duì)照組（P＜0.01）；但與IL-8轉(zhuǎn)染組比較，Erk抑制劑組hAdMSC增殖的OD值降低，Caspase-3蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。結(jié)論IL-8在高糖環(huán)境下，通過(guò)Erk通路，發(fā)揮對(duì)hAdMSC的保護(hù)作用。

高糖；白細(xì)胞介素8；人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；Erk通路

研究發(fā)現(xiàn)，全球糖尿病患者人數(shù)目前約為3.22億人，到2035年將達(dá)到5.92億［1］。中國(guó)人口老齡化問(wèn)題日益嚴(yán)重，老年人糖代謝比較紊亂、機(jī)體功能減退，是糖尿病的好發(fā)人群［2］；高血糖會(huì)使體內(nèi)活性氧等自由基大量增多，活躍的自由基造成體內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，活性和功能降低［3］，進(jìn)而引發(fā)全身多種組織和器官發(fā)生嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥［4］。目前發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有來(lái)源廣泛、免疫低、多分化性等優(yōu)點(diǎn)，是治療糖尿病血管、神經(jīng)等復(fù)雜病變的首選種子細(xì)胞［5］。研究還發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境會(huì)對(duì)移植的細(xì)胞、體內(nèi)宿主細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷［6］，如何避免高糖損傷，是值得研究的科學(xué)問(wèn)題。

宮頸癌細(xì)胞在缺氧刺激下會(huì)大量表達(dá)白細(xì)胞介素8（Interleukin-8，IL-8），IL-8會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞歸巢和血管新生，達(dá)到抗缺氧的效果［7］，但是在糖尿病性高糖環(huán)境中，IL-8是否也會(huì)發(fā)揮抑制MSC損傷、促進(jìn)MSC增殖研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，本研究擬以人IL-8修飾人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，既發(fā)揮IL-8保護(hù)細(xì)胞抗高糖損傷的作用，又能促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞歸巢，對(duì)治療糖尿病等缺氧性疾病具有重要意義。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（human Adipose derived mesenchymal stem cells，hAdMSC）購(gòu)于武漢普諾賽生物公司，以色列Bioind公司生產(chǎn)的BI胎牛血清，青鏈霉素和α-MEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，人IL-8引物：正向5'-CTGGCTTATCTTACCATCAT-3'，反向5'-TCAAATACGGAGTGACGAA-3'，由大連寶生公司合成測(cè)序。DH5α大腸桿菌和P65質(zhì)粒由本教研室提供，LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，葡萄糖、MTT和PD98059均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，小鼠抗人IL-8和小鼠抗人Erk/磷酸化Erk（P-Erk）抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，人VEGF-ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司，Erk、P-Erk活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)置Cell Signaling公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙標(biāo)試劑盒購(gòu)置杭州碧云天生物公司，流式細(xì)胞分選儀（美國(guó)BD公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組hAdMSC用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；在α-MEM培養(yǎng)基中添加250 mmol/L葡萄糖為hAdMSC高糖培養(yǎng)基。在高糖模型下，無(wú)任何刺激者為對(duì)照組，僅轉(zhuǎn)染P65質(zhì)粒者為P65對(duì)照組，P65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人IL-8基因到hAd MSC為 IL-8轉(zhuǎn)染組，在 IL-8轉(zhuǎn)染組中添加50μmol/L PD98059為Erk抑制劑組，正常條件下培養(yǎng)MSC者為正常對(duì)照組。

1.2.2IL-8基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MSC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染一般步驟為：培養(yǎng)3×105hAdMSC，采用LipofectamineTM3000試劑盒將P65IL-8重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSC。培養(yǎng)2 d后，用含300μg/ml G418的α-MEM培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，2周后收集陽(yáng)性細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IL-8的MSC，利用蛋白免疫印跡法（Western blot）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定［8］。

1.2.3Western blot檢測(cè)人IL-8的表達(dá)裂解各組細(xì)胞，12 000 r/min，提取蛋白液，SAB法進(jìn)行蛋白定量；凝膠電泳60 min后；轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素薄膜；山羊血清封閉60min；再添加小鼠抗人IL-8（1∶150）等抗體，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶200）；ECL試劑等步驟檢測(cè)蛋白表達(dá)，Image-Pro Plus 6.0.1軟件分析各蛋白條帶的灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)灰度值，β-actin為內(nèi)參對(duì)照。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況按hAdMSC分組情況，96孔板的每孔內(nèi)接種2×104hAdMSC，用100μl的hAdMSC培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，0.01mmol/L PBS清洗，每孔加入20μl 5 mg/ml的MTT，孵育4 h后，添加100μl DMSO，充分振蕩，使用450 nm波長(zhǎng)測(cè)定每個(gè)樣品吸光度（OD值）。

1.2.5流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率按照實(shí)驗(yàn)分組情況，培養(yǎng)每組5×106hAdMSC，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞，0.01 mol/L PBS清洗，按照細(xì)胞凋亡雙標(biāo)試劑盒致使進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6VEGF蛋白含量和P-Erk/Erk蛋白活性檢測(cè)按照實(shí)驗(yàn)分組情況，培養(yǎng)5×107hAdMSC，0.01 mol/L PBS清洗，以含0.1%胎牛血清的hAdMSC高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)12 h，收集各組細(xì)胞的上清液，ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)VEGF含量，分別利用Erk/P-Erk活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組hAdMSC中P-Erk/Erk蛋白活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每次試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1IL-8的表達(dá)

P65對(duì)照組IL-8的表達(dá)與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與P65對(duì)照組比較，IL-8轉(zhuǎn)染組的IL-8蛋白相對(duì)含量提高1.679倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1和圖1。

2.2IL-8對(duì)hAdMSC增殖和凋亡的影響

高糖環(huán)境下，IL-8轉(zhuǎn)染組hAdMSC增殖的OD值是P65對(duì)照組的3.172倍，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而Erk抑制劑組的hAdMSC增殖的OD值則是IL-8組的0.571倍，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2A和表2；IL-8轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率是高糖對(duì)照組的0.365倍，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而Erk抑制劑組的細(xì)胞凋亡率則是IL-8組的1.296倍，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2B、2C和表2。

2.3各組hAdMSC的P-Erk/Erk和VEGF蛋白的表達(dá)

IL-8轉(zhuǎn)染組P-Erk/Erk相對(duì)灰度值是P65對(duì)照組的1.313倍（P＜0.01）；Erk抑制劑組P-Erk/Erk相對(duì)灰度值是IL-8轉(zhuǎn)染組的0.679倍（P＜0.01），見(jiàn)表3和圖3A、3B；IL-8轉(zhuǎn)染組VEGF蛋白含量是P65對(duì)照組的2.118倍（P＜0.01）；Erk抑制劑組VEGF蛋白含量是IL-8轉(zhuǎn)染組的0.338倍（P＜0.01），見(jiàn)表3和圖3C。

表1 各組hAdMSC表達(dá)的IL-8方差分析

圖1　hAdMSC的IL-8蛋白表達(dá)

圖2　IL-8對(duì)hAdMSC增殖和凋亡的影響

表2　各組hAdMSC增殖和凋亡的方差分析 （n=18，±s）

表2　各組hAdMSC增殖和凋亡的方差分析 （n=18，±s）

注：1）P65對(duì)照組與IL-8轉(zhuǎn)染組hAdMSC增殖的OD值比較，P＜0.01；2）IL-8轉(zhuǎn)染組與Erk抑制劑組hAdMSC增殖的OD值比較，P＜0.01；3）P65對(duì)照組與IL-8轉(zhuǎn)染組hAdMSC凋亡率的比較，P＜0.01；4）IL-8轉(zhuǎn)染組與Erk抑制劑組hAdMSC凋亡率的比較，P＜0.01

表3　各組hAdMSC的p-Erk/Erk相對(duì)灰度值和VEGF蛋白的方差分析 （n=24，±s）

注：1）P65對(duì)照組與IL-8轉(zhuǎn)染組P-Erk/Erk相對(duì)灰度值比較，P＜0.01；2）IL-8轉(zhuǎn)染組與Erk抑制劑組P-Erk/Erk相對(duì)灰度值比較，P＜0.01；3）P65對(duì)照組與IL-8轉(zhuǎn)染組VEGF蛋白含量比較，P＜0.01；4）IL-8轉(zhuǎn)染組與Erk抑制劑組VEGF蛋白含量比較，P＜0.01

圖3　IL-8對(duì)各組hAdMSC表達(dá)P-Erk/Erk、VEGF蛋白的影響

3　討論

糖尿病是嚴(yán)重的多系統(tǒng)多器官損傷的慢性疾病，YANG等在《N Engl J Med》撰文，認(rèn)為糖尿病及心、腎、腦等部位的并發(fā)癥是中國(guó)及其世界進(jìn)步和發(fā)展的嚴(yán)重阻礙因素之一［9］，雖然各國(guó)均投入大量的人力、物力和財(cái)力進(jìn)行糖尿病相關(guān)研究，但是，糖尿病及其并發(fā)癥仍然是棘手的醫(yī)學(xué)難題［9］。究其原因，主要是由于高血糖狀態(tài)造成體內(nèi)物質(zhì)代謝紊亂，氧自由基增多，血管神經(jīng)變性等改變［10］，因此，如果從內(nèi)在因素考慮糖尿病及其并發(fā)癥的形成和病理過(guò)程，有可能加大治療效果。

間充質(zhì)干細(xì)胞是一類存在于脂肪、骨髓和角膜等部位，具有多分化特性、多組織適應(yīng)性、多來(lái)源途徑的干細(xì)胞，由于其免疫性較低，移植MSC避免倫理問(wèn)題的糾紛，成為細(xì)胞治療的重要細(xì)胞［11］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，存在于人體脂肪組織的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，由于含量較多，易于獲得，因此成為組織工程首先考慮的種子細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，AdMSC可以有效地促進(jìn)血管新生，加速傷口愈合［12］，并發(fā)現(xiàn)，MSC表面表達(dá)多種趨化因子受體，CXCL12和CXC1等多種趨化因子，多招募MSC歸巢具有重要作用［13］。2014年Science雜志報(bào)道，傷口周圍巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞會(huì)釋放大量IL-8等趨化因子，IL-8起到招募血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞歸巢，加速細(xì)胞外基質(zhì)形成等作用，對(duì)傷口愈合具有積極作用［14］。但是，在糖尿病皮膚潰瘍組織周圍，由于高血糖導(dǎo)致細(xì)胞功能降低，IL-8等趨化因子釋放大量減少，致使糖尿病皮膚潰瘍遷延愈合甚至不愈合［14］。由此啟發(fā)，如果外源性給與IL-8，有可能誘導(dǎo)細(xì)胞歸巢，加速糖尿病并發(fā)癥修復(fù)的速度。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常環(huán)境下，培養(yǎng)的MSC上清液中可以表達(dá)IL-8，與P65對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓和骨膜等部位來(lái)源的MSC可以表達(dá)少量IL-8等因子［15］。進(jìn)行轉(zhuǎn)染IL-8的MSC上清液中IL-8含量增加，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。

研究發(fā)現(xiàn)，與P65對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染IL-8的hAdMSC能夠高效表達(dá) IL-8蛋白，IL-8轉(zhuǎn)染組hAdMSC的細(xì)胞增殖OD值明顯比缺氧對(duì)照組升高，IL-8轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率比缺氧對(duì)照組降低，這提示，高糖環(huán)境下，IL-8能夠與hAdMSC表面的CXCL1/2受體結(jié)合［15］，激活了相應(yīng)信號(hào)通路。本研究以PD98059阻斷Erk通路，發(fā)現(xiàn)Erk抑制劑組的細(xì)胞增殖OD值與凋亡率表達(dá)與IL-8轉(zhuǎn)染組均呈現(xiàn)反向關(guān)系，Erk蛋白在IL-8轉(zhuǎn)染組和Erk抑制劑組表達(dá)均較高；而與IL-8轉(zhuǎn)染組比較，Erk抑制劑組P-Erk蛋白表達(dá)明顯降低，證明IL-8通過(guò)Erk蛋白通路發(fā)揮對(duì)高糖誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。ELISA研究發(fā)現(xiàn)，IL-8轉(zhuǎn)染組VEGF蛋白表達(dá)均高于P65對(duì)照組，而Erk抑制劑組VEGF蛋白的表達(dá)則降低，這可能是由于IL-8與hAdMSC表面的受體結(jié)合，激活MAPK-Erk信號(hào)通路，導(dǎo)致VEGF基因表達(dá)，進(jìn)而使VEGF和IL-6表達(dá)升高［16］，當(dāng)然，IL-8也可以通過(guò)Akt通路促進(jìn)細(xì)胞活化［7］，相關(guān)機(jī)制還需要深入研究。

綜上所述，IL-8轉(zhuǎn)染的hAdMSC可以發(fā)揮抗高糖導(dǎo)致的MSC損傷，對(duì)hAdMSC具有保護(hù)性作用。下一步將擬用高效液相色譜技術(shù)確定IL-8刺激hAdMSC的有效分泌因子，并建立糖尿病皮膚潰瘍動(dòng)物模型，觀察IL-8聯(lián)合MSC對(duì)該動(dòng)物模型皮膚潰瘍愈合作用，為開發(fā)IL-8等趨化因子的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］GUARIGUATA L，WHITING D R，HAMBLETON I，et al.Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035［J］.Diabetes Res Clin Pract，2014，103（2）:137-149.

［2］李桂玲，李彩福.同伴支持教育對(duì)社區(qū)糖尿病老年人自我管理能力的干預(yù)效果評(píng)價(jià)［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2015（31）:98-99.

［3］DANGI-GARIMELLA S.A big step forward in treating chronic diabetic foot ulcers［J］.Am J Manag Care，2014，20（4）:E8.

［4］史麗，蘇勝偶，趙占勝，等.血糖波動(dòng)與糖尿病并發(fā)癥的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010，30（17）:2557-2559.

［5］SUN H，YANG H L.Calcium phosphate scaffolds combined with bone morphogenetic proteins or mesenchymal stem cells in bone tissue engineering［J］.Chin Med J（Engl），2015，128（8）:1121-1127.

［6］SARGENT J.Diabetes:functional impairment of bone marrow progenitor cells in diabetes mellitus［J］.Nat Rev Endocrinol，2014，10（7）:379.

［7］LIU L B，XIE F，CHANG K K，et al.Hypoxia promotes the proliferation of cervical carcinoma cells through stimulating the secretion of IL-8［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（2）:575-583.

［8］張劍凱，朱楚洪，糜建紅，等.鋅指蛋白A20基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志，2008，26（2）:163-165.

［9］YANG W，LU J，WENG J，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China［J］.N Engl J Med，2010，362（12）: 1090-1101.

［10］BERKOW J W，RICKETTS R L.Spontaneous diabetes mellitus in dogs［J］.J Am Vet Med Assoc，1965，146:1101-1105.

［11］STODDART M J.Mesenchymal stem cells as a source of repair cytokines:mesenchymal stem cells as the conductor［J］.J Am Acad Orthop Surg，2015，23（7）:452-453.

［12］PARK I S，CHUNG P S，AHN J C.Adipose-derived stromal cell cluster with light therapy enhance angiogenesis and skin wound healing in mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，462（3）: 171-177.

［13］SI X Y，LI J J，YAO T，et al.Transforming growth factor-beta1 in the microenvironment of ischemia reperfusion-injured kidney enhances the chemotaxis of mesenchymal stem cells to stromal cell-derived factor-1 through upregulation of surface chemokine（C-X-C motif）receptor 4［J］.Mol Med Rep，2014，9（5）:1794-1798.

［14］SUN B K，SIPRASHVILI Z，KHAVARI P A.Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds［J］.Science，2014，346（6212）:941-945.

［15］JANSEN E J，EMANS P J，GULDEMOND N A，et al.Human periosteum-derived cells from elderly patients as a source for cartilage tissue engineering［J］.J Tissue Eng Regen Med，2008，2（6）:331-339.

［16］KANOH S，TANABE T，RUBIN B K.Dapsone inhibits IL-8 secretion from human bronchial epithelial cells stimulated with lipopolysaccharide and resolves airway inflammation in the ferret［J］. Chest，2011，140（4）:980-990.

（張蕾編輯）

Protective effect of interleukin-8 on injury of human adipose derived mesenchymal stem cells induced by high glucose*

Lei Shen，F(xiàn)eng Sha，Quan Sun，Peng Zhang，Shi-zhu Sun，Xiao-dong Zhang，Li-jie Yao，Jing-ping Li
（Department of Anatomy，Qiqihar Medical School，Qiqihar，Heilongjiang 161006，China）

Objective To investigate the protective effect of interleukin-8（IL-8）on high glucose induced injury of human adipose derived mesenchymal stem cells（hAdMSC）induced by high glucose.Methods High glucose model with 250 mmol/l glucose medium was established.In IL-8 transfection group，human IL-8 gene was transfected into hAdMSC by p65 plasmid.In the control group，and P65 plasmid was transfected，and in Erk Inhibitor group，PD98059 was added into IL-8 transfection group.MTT cell proliferation assay，ELISA and flow cytometry was used to detect hAdMSC proliferation of the optical density（OD）or Caspase-3，Erk and VEGF protein.Results Compared with the p65 control group，OD of IL-8 transfection group was increased significantly and the proliferation of hAdMSC was increased，Caspase-3 protein expression was decreased，P＜0.01.Erk protein activity and VEGF protein in IL-8 transfected group were significantly higher than those in p65 control group，P＜0.01.But compared with the IL-8 group，OD of hAdMSC proliferation in Erk inhibitor group was decreased，expression of Caspase-3 protein was increased，P＜0.01.Conclusions In the high glucose environment，IL-8 plays a protective role for human adipose derived mesenchymal stem cells through the Erk signal pathway.

high glucose；interleukin-8；human adipose derived mesenchymal stem cells；Erk signal

R641

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.004

1005-8982（2016）16-0018-05

2015-12-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No：81541137）；黑龍江省教育廳指令科研課題（No：12541901）