趙會庚　權(quán)廣前　潘耀振　尹家俊

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·基礎(chǔ)研究·

Mdr1反義寡核苷酸聯(lián)合磁性載藥微球逆轉(zhuǎn)胰腺癌耐藥實驗研究

趙會庚權(quán)廣前潘耀振尹家俊

目的探討輻射促細胞轉(zhuǎn)染的多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)基因Mdr1反義寡核苷酸(ASON)逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞SW1990/Fu的耐藥效果。方法應用 RT-PCR方法和流式細胞儀，檢測2種不同的轉(zhuǎn)染方法對SW1990/Fu細胞的Mdr1-mRNA及其表達產(chǎn)物P-糖蛋白(P-gp)的調(diào)控情況。結(jié)果反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和流式細胞儀的結(jié)果顯示，聯(lián)合輻射的陽性脂質(zhì)體介導ASON組的SW1990/Fu細胞Mdr1-mRNA的表達水平及細胞膜糖蛋白(P-gp)的陽性率均明顯低于反義寡核苷酸(ASON)組(P<0.01)。結(jié)論輻射促轉(zhuǎn)染的Mdr1ASON聯(lián)合磁性載藥微球?qū)δ[瘤細胞具有較好的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

電離輻射;反義寡核苷酸;轉(zhuǎn)染;多藥耐;PEG-5-FU-MAMS

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.07.001

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1045～1049)

胰腺癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿，病情進展較快，病死率較高，西方國家的發(fā)病率為12.5/10萬，患者病死率超過97%[1]。在我國，胰腺癌呈上升趨勢，胰腺已成為癌癥死亡率中高居第五位的惡性腫瘤。目前，對胰腺癌的治療仍采取手術(shù)切除聯(lián)合化療的綜合治療。此外，胰腺癌的根治手術(shù)切除率僅15%～20%左右[2-3],五年的生存率也僅在4%左右[4-5]。臨床也表明單純的根治手術(shù)常伴有較高的復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，另需術(shù)后進一步輔助化療來提高患者的生存率。反義寡核苷酸(ASON)將成為治療惡性腫瘤的新型基因藥物，作為一種治療腫瘤的基因逆轉(zhuǎn)藥物，反義寡核苷酸(ASON)主要是通過堿基配對原則與靶基因結(jié)合，特異性與靶基因mRNA結(jié)合，阻斷其mRNA的翻譯，使該蛋白表達受阻。由于經(jīng)硫代修飾的反義寡核苷酸(ASON)在體內(nèi)有穩(wěn)定而較長的半衰期，能主動代謝，保持與Mdr1競爭結(jié)合，能提高化療的療效，從而達到治療腫瘤的目的[6]。

本課題是探討輻射及多藥耐藥(Mdr1)基因逆轉(zhuǎn)劑反義寡核苷酸(ASON)與新型磁性載藥微球化療藥物聯(lián)合作用治療胰腺癌，觀察其對胰腺癌療效。通過探討該方法的應用，觀察胰腺癌能否減少耐藥的產(chǎn)生以及藥物的毒性和不良反應，為臨床治療胰腺癌提供新的思路。

1　材料與方法

1.1細胞系

人胰腺癌sw1990/Fu，自制。

1.2主要試劑及儀器

5-FU(Acros,Belgium)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(Mdr1反義寡核苷酸)(上海生工生物工程有限公司)，磁性載藥微球(天津市倍思樂公司)，2xTaq PCR Master Mix (北京博邁德生物公司)，脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE2000(Invitrogen coporation，USA)，Anti-Human P-Glycoprotein(P-gp)(上海新肽生物科技有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Baxter,USA)，多功能倒置顯微鏡(尼康，日本)FACS Calibur型流式細胞儀(美國B.D公司)。

1.3實驗方法

構(gòu)建人胰腺癌細胞株SW1990用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，待細胞至生長對數(shù)期，細胞消化，傳代。連續(xù)傳代3次后，當細胞生長至瓶壁約80%面積時，改用含5-Fu的培養(yǎng)基培養(yǎng)，起始濃度為30 nmom/L,24 h后更換無藥物的細胞培養(yǎng)液，去除死亡的大部分細胞，以后每2天更換細胞培養(yǎng)基，待細胞與含藥物的培養(yǎng)基中穩(wěn)定的生長并鋪滿整個培養(yǎng)瓶，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，一瓶在含原濃度的5-Fu培養(yǎng)基繼續(xù)傳代培養(yǎng)，另一瓶逐漸增加5-Fu濃度至60 nmom/L。繼續(xù)如上培養(yǎng)，連續(xù)6個月左右，最后建立耐200 nmom/L的5-Fu的胰腺癌細胞株模型表示為SW1990/Fu。

實驗分組：磁性載藥微球微球的藥物濃度依次為3 μg/ml、6.25 μg/ml、12.5 μg/ml 25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml。

1.3.1對照組對數(shù)生長期的人胰腺癌細胞sw1990/Fu細胞經(jīng)胰酶消化后，離心、收集細胞用PBS重懸，1 500 rpm室溫離心5 min，棄上清，再次用PBS重懸后離心收集細胞,臺盼藍排斥實驗檢測活細胞力，細胞活力大于99%時稀釋成單細胞懸液,調(diào)整細胞濃度為1×107/ml,sw1990/Fu細胞按2×105個/瓶接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃飽和相對濕度的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后,每組實驗條件重復4個平行樣品，于48 h后收集細胞，提取細胞總的RNA。

1.3.2輻射組按對照組的方法重復4個平行樣品，2 Gy60Coγ照射后與48 h后收集細胞，提取細胞總的RNA。

1.3.3轉(zhuǎn)染組質(zhì)粒(Mdr1反義寡核苷酸)全硫代修飾堿基序列5′-CATCCCGACCTCGCGCTC-3′轉(zhuǎn)染步驟：按對照組的方法重復4個平行樣品，將Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，每瓶細胞用無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM I 230 μl稀釋20 μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫孵育5 min。用無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM I 250 μl稀釋8.0 μg Mdr1反義寡義苷酸,輕輕混勻.混合稀釋Lipofectamine 2000和稀釋的Mdr1反義寡核苷酸，輕輕混勻，室溫放置20 min使Mdr1反義寡核苷酸-Lipofectamine 2000復合物的形成。將培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基吸出，用無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM I洗兩次。逐滴加入500 μl脂質(zhì)體/DNA混合物到細胞培養(yǎng)瓶中，邊加邊輕輕混勻，置于37 ℃飽和相對濕度的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。6 h后，更換含有血清的培養(yǎng)基，置于37 ℃飽和相對濕度的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在48 h后收集細胞，提取細胞總的RNA。

1.3.4聯(lián)合組按對照組的方法重復4個平行樣品，2 Gy60Coγ照射后2 h后進行細胞轉(zhuǎn)染，其細胞的轉(zhuǎn)染方法同上說明。在48 h后收集細胞，提取細胞總的RNA。

1.4TRIZola方法提取細胞中總的RNA

向細胞培養(yǎng)瓶中加1 ml的Trizol后，室溫放置5 min,使其充分裂。轉(zhuǎn)入1.5 ml Eppedndorf管中(RNase-free)12 000 rpm 離心5 min,棄沉淀。向Eppedndorf管中加入200 μl氯仿，震蕩均勻后室溫放置15 min(禁用漩渦振蕩器，避免基因斷裂);4 ℃，12 000 rmp離心15 min。吸取上層水相至另一新的Eppedndorf管中(RNase-free),加入0.5 ml的異丙醇，使之充分混勻，常溫下放置10 min。4 ℃，12 000 rmp離心10 min,棄上清,RNA沉于管底。加入1 ml的75%乙醇(高壓的DEPC水配制)，溫和震蕩離心管懸浮沉淀。4 ℃，5 000 rmp離心5 min，棄上清。室溫晾干。溶于20 μlDEPC水中測OD值定量RNA的濃度。

1.5RT-PCR

在冰浴的無RNase得離心管加入以下成分：Total RNA 1 μg，Oligo(dT)182 μl；離心后向離心管中加入下列各組成分：5×M-MLV Buffer 4 μl，dNTPs 1 μl，Rnasin 0.5 μl，M-MLV 1 μl。42 ℃溫浴60 min；95 ℃加熱5 min 終止反應；-20 ℃保存(或直接PCR)。Mdr1基因引物(擴增片段 bp310)上游引物序列：5-ˊCCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3ˊ；下游引物序列:5-ˊGTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3ˊ。內(nèi)參β2MG基因引物(擴增片段bp120)上游引物序列:5-ˊCCA CTG AAA AAG ATG AGT AT-3ˊ下游引物序列 5-ˊCTT CAA CCT CCA TGA TGC TG-3ˊ10×PCR Buffer 10 μl。上游引物1 μl；下游引物1 μl；內(nèi)參上游引物 1 μl；內(nèi)參下游引物1 μl；RT反應產(chǎn)物 2 μl；Taq Polymerase 1 ul；ddH2O 3 μl；Total Volume 20 μl。PCR的反應條件：95 ℃ 5 min 50 ℃ 30sec 72 ℃ 1 min 反應后，混勻后稍離心，進行30個循環(huán)，然后72 ℃10 min完后4 ℃保溫。

1.6電泳鑒定

10×TAE(電泳緩沖液)取200 ml，溶解0.2 g瓊脂糖，電爐上煮沸后加入少量的EB(溴化乙錠)，使溶液顏色稍變淺紅即可。用透明膠封閉電泳板，待瓊脂糖溶液冷卻至溫熱時，倒入帶有梳子的電泳版中，冷卻后，拔出梳子。加樣：①PCR Marker II 5 μl 加入孔中；②PCR樣品1 μl樣品DNA；4 μl 10×Loading Buffer 混合均勻后依次加入相應的孔中；接通電源，電壓110 V 20 min進行電泳；凝膠成像儀成像檢測、拍照、定量。

1.7流式細胞儀檢測細胞膜糖蛋白(P-gp)陽性百分率

取出收集好的sw1990/Fu細胞，在顯微鏡下作細胞計數(shù)取出1×107個細胞于試管中；用臺盼藍染色計活細胞數(shù)，要求活細胞數(shù)>90%～95%；加入用PE標記的熒光素的抗體(P-gp)來標記細胞膜上的抗原，工作濃度是(1∶50)，同時加上陰性sw1990/FU細胞作對照管，混勻，室溫孵育20 min PBS洗滌2次，1 500 rpm 3 min，棄上清；用PBS洗滌兩次，棄上清用300 μl PBS重懸細胞，上機檢測計算陽性率。

1.8統(tǒng)計學分析

2　結(jié)果

2.1電泳分析

對實驗各組細胞中Mdr1的mRNA RT-PCR結(jié)果進行電泳分析，見圖1。

圖1　電泳圖

2.2Mdr1的mRNA RT-PCR結(jié)果定量實驗結(jié)果

經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)對各實驗組中的Mdr1的mRNA RT-PCR 結(jié)果進行分析顯示：①空白對照A組中Mdr1mRNA 的相對表達量為1.94±0.04；②實驗B組中Mdr1mRNA的相對表達量為1.83±0.07；③實驗聯(lián)合D組Mdr1mRNA 的相對表達量為0.68±0.10；④試驗轉(zhuǎn)染C組中Mdr1mRNA 的相對表達量為1.22±0.11。實驗聯(lián)合D組與對照A組相比，Mdr1mRNA的相對表達量降低了34.92% ；實驗轉(zhuǎn)染C組與對照組A組相比，Mdr1mRNA的相對表達量降低了56.78% 。單純對照組A與轉(zhuǎn)染C組、聯(lián)合D組之間差異有非常顯著，具有統(tǒng)計學意義(t=20.49，P<0.01、t=13.4,P<0.01)；而轉(zhuǎn)染C組與聯(lián)合組D之間，差異也有顯著性(t=15.15，P<0.05)。

2.3實驗各組細胞膜表面糖蛋白(P-gp)表達陽性率比較(圖2)

實驗各組細胞膜表面糖蛋白(P-gp)陽性率流式細胞儀檢測顯示，對照組、輻射組、聯(lián)合組、轉(zhuǎn)染組中各組細胞表面膜蛋白(P-gp)陽性率分別為(41.66±1.49)%、(38.41±1.95)%、(13.83±1.89)%、(23.16±1.7)% ?？梢钥闯觯瑢φ战M與轉(zhuǎn)染組間差異有非常顯著性，具有統(tǒng)計學意義(χ2=57.44 ，P<0.01)；對照組與聯(lián)合組間差異也有顯著性(χ2=106.79，P<0.05)；轉(zhuǎn)染組與聯(lián)合組間差異亦有顯著性(χ2=66.66 ，P<0.05)。而對照組與輻射組之間差異無顯著性(χ2=92.99，P>0.05)。

圖2　實驗各組細胞表面P-gp陽性百分率比較

3　討論

近年來,通過腫瘤體外藥物敏感性實驗指導抗癌藥物的個體化治療愈來愈受到重視，此外由于單純的化療藥物常常引起病人全身嚴重的毒性反應，同時又出現(xiàn)腫瘤細胞的耐藥性，從而影響到腫瘤治療的效果。腫瘤的多藥耐藥是指腫瘤細胞在接觸某1種抗癌化療藥物產(chǎn)生耐藥的同時，也對其它結(jié)構(gòu)和功能不同的藥物產(chǎn)生交叉性耐藥。在人類中，耐藥主要含有Mdr1和mdr22個基因，但只有Mdr1基因產(chǎn)生Mdr1[7]，介導多要耐藥。Mdr1基因編碼的糖蛋白(P-gp)是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白(ATP binding cassette,ABC)超家族成員之一，該膜蛋白嵌插于細胞膜上，跨膜區(qū)作為膜通道有利于物質(zhì)轉(zhuǎn)運，具有能量依賴的跨膜藥物外輸功能，可以將細胞內(nèi)藥物包括多種抗腫瘤藥物泵出胞外，使細胞內(nèi)藥物積聚濃度下降,產(chǎn)生耐藥[8]，大多數(shù)腫瘤以此為主要機制。Mdr1首先轉(zhuǎn)錄為mRNA后在經(jīng)過修飾后翻譯為具有活性的功能蛋白糖蛋白(P-gp),在這個過程中mRNA是個關(guān)鍵，阻斷這個環(huán)節(jié)可以減少翻譯為糖蛋白(P-gp)蛋白的絕對數(shù)量。大量的研究認為Mdr1及表達產(chǎn)物糖蛋白(P-gp)不但介導腫瘤細胞的多藥耐藥，而且還是臨床評價惡性腫瘤程度的一個生物學指標。Hirfumi等[9]在研究胰腺導管腺癌后認為糖蛋白(P-gp)表達不僅與腫瘤的生物侵襲性負相關(guān)，而且也是預后較好的一個獨立指標，因此檢測Mdr1及其表達蛋白糖蛋白(P-gp)具有重要意義。研究表明[10]Mdr1基因表達量越高,耐藥性越強,療效越差。隨著分子生物學的發(fā)展，檢測手段的增加，目前檢測Mdr1的方法主要是通過檢測Mdr1耐藥基因和mRNA及其表達的糖蛋白(P-gp)來確定。Mdr1基因檢測最常用的方法是Southern blot分子雜交技術(shù)，多數(shù)認為Mdr1基因擴增局限與體外藥物的篩選的耐藥細胞株，但由于Mdr1基因在體內(nèi)具有表達基因低、組織分布不均、表達的個體差異性等特點，降低了檢測Mdr1擴增程度的應用價值。而mRNA檢測最常用的方法是原位雜交(insitu hybridization,ISH)及RT-PCR。ISH可檢測Mdr1陽性細胞在腫瘤組織中的定位并可準確定量[11],其缺點是操作復雜及費用昂貴。此外由于mRNA 極易降解很難檢測,但隨著轉(zhuǎn)錄技術(shù)的發(fā)展，反轉(zhuǎn)錄RT-PCR(revese-tanscripition,PCR) 中文譯為逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應,此方法被廣泛應用科研及臨床。該技術(shù)是在PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上設(shè)計出的新技術(shù),該方法先將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再用聚合酶擴增,就能檢出少許細胞的總RNA稀少的mRNA,RT-PCR技術(shù)與其它方法相比,具有特異性高、準確性好、穩(wěn)定性強、靈敏度高及簡便快速的特點[12],是目前檢測多藥耐藥(MDR)基因較理想手段。此外檢測細胞膜糖蛋白(P-gp)可分為對其表達和功能進行評價，Western和免疫組化分析可用來評價糖蛋白(P-gp)的表達程度，以提高檢測敏感性和特異性。常用的抗體有MRK-16、MRK-17、UIC2及JBS-1等，但所有MAbs均存在不同的缺點，目前尚未制備出用于檢測P-gp表達的理想MAbs。通常流式細胞儀是檢測細胞膜糖蛋白(P-gp)及功能的主要方法，但多適合于血液系統(tǒng)組織標本，很難適合對實體腫瘤進行檢測。

本實驗檢測PEG-5-FU-MAMS新型化療藥物及其在恒定磁場，輻射、逆轉(zhuǎn)染劑在體外實驗通過對人胰腺癌sw1990/Fu mRNA表達的半定量分析及細胞膜糖蛋白(P-gp)在細胞內(nèi)的蛋白表達水平，探討各種實驗方法對多藥耐藥基因(Mdr1)及其表達的糖蛋白(P-gp)的有效性，從而為將來的胰腺癌的臨床治療與診斷提供有效的治療途徑。其中Mdr1mRNA表達豐度的半定量是根據(jù)同一細胞株中Mdr1與B-actin基因的RT-PCR產(chǎn)物進行比較，判斷Mdr1mRNA在細胞中表達豐度的高低[13]，在某種程度上反應多藥耐藥基因(Mdr1)轉(zhuǎn)錄為mRNA量的變化。藥耐藥基因(Mdr1)表達的產(chǎn)物細胞膜上的糖蛋白(P-gp)的檢測我們主要通過流式細胞儀檢測其含量。

通過mRNA的RT-PCR的半定量分析以及細胞膜上表達的糖蛋白(P-gp)的分析表明：多藥耐藥基因(Mdr1)逆轉(zhuǎn)劑反義寡核苷酸(ASON)聯(lián)合低劑量輻射及磁性載藥微球在一定的磁場下能顯著地減低多藥耐藥基因的表達，為臨床診斷治療胰腺癌多藥耐藥機制及逆轉(zhuǎn)劑和新型化療藥物提供有效依據(jù)。目前，基因逆轉(zhuǎn)劑反義寡核苷酸(ASON)及新型化療藥物磁性載藥微球在體外研究的較多，對于腫瘤的治療已經(jīng)得到證實，但兩者的聯(lián)合應用還未見報道，本實驗是通過兩者的聯(lián)合應用，在體外實驗觀察對應于胰腺癌耐藥細胞株SW1990/Fu的治療效果，輻射及反義寡核苷酸(ASON)與新型化療藥物的作用機理不盡相同，潘耀振等認為輻射也能促進轉(zhuǎn)染，輻射產(chǎn)生的氧自由基，可引起一系列細胞膜脂質(zhì)過氧化作用，不斷使細胞膜的膜磷脂平衡改變，使細胞膜的流動性、通透性增加、轉(zhuǎn)運功能異常。反義寡核苷酸(ASON)是通過陽性脂質(zhì)體介導作用，把反義寡核苷酸(ASON)片段轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)，與多藥耐藥(Mdr1)基因堿基序列互補，阻斷其多藥耐藥(Mdr1)基因細胞膜蛋白(P-gp)的表達[14]，由于細胞膜蛋白(P-gp)具有外排泵的活性，在一定程度上也阻斷細胞內(nèi)化療藥物的外排，使腫瘤細胞內(nèi)化療藥物濃度相對增加，從而達到化療藥物殺傷腫瘤細胞的作用，兩者的相互作用，使脂質(zhì)體介導的反義寡核苷酸片段(ASON)更易進入細胞內(nèi)，與DNA或RNA結(jié)合，效率增加，兩者具有一定的協(xié)同作用，相互促盡，提高了治療效果，使細胞膜蛋白(P-gp)的表達相對降低，我們通過逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)方法對多藥耐藥基因(Mdr1)轉(zhuǎn)錄為mRNA量的表達來檢測，細胞膜糖蛋白(P-gp)的表達通過流式細胞儀檢測得到證實，聯(lián)合治療能明顯降低兩者的相對表達量。這一結(jié)果為進一步動物實驗提供理論依據(jù)，也為臨床用藥提供一定的實驗理論依據(jù)，具有重要的應用前景。

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(編輯：吳小紅)

Reversal of Multidrug Resistance Antisense Oligodeoxynucletedes and PEG-5-FU-MAMS Towards Human Pancreatic Cell Line

ZHAOHuigeng,QUANGuangqian,PANYaozhen,etal.

AffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian,116001

ObjectiveTo investigate the reversal the multidrug resisitance(MDR) by MDR gene mdrl antisense oligodeoxynucletdes(ASON) and Polyethylene Glycol modified 5-Fluorouracil magnetic albumin miscrospheres(PEG-5-FU-MAMS) in the human pancreatic cancer cell line in SW1990/Fu.MethodsThe expression of Mdr1at mRNA level was examined by RT-PCR.Flow cytometry was used to demonstrated the positive rate the Mdr1gene product P-glucopretein(P-gp) in lipo-ASON treated cells with 2 different methods.ResultsThe inhibitory efficiency of lipo-ASON and ionizing radiation plus Polye-Thylene Glycol modified 5-Fluorouracil magnetic albumin miscrospheres(PEG-5-FU-MAMS) was higher than that without ionizing radiation(P<0.01).The IC50,The Mdr1RNA expression level,and P-gp positive rate of irradiated sw1990/Fu cells were all significantly lower than those of unirradiated cells(P<0.05).ConclusionThe reversal effect of Mdr1ASON and ionizing radiation plus Polyethy-lene Glycol modified 5-Fluorouracil magnetic albumin miscrospheres(PEG-5-FU-MAMS) is stronger on resistant cell than that of Mdr1ASON and Polyethylene Glycol modified 5-Fluorouracil magnetic albumin miscrospheres(PEG-5-FU-MAMS) alone.

Lonizing radition;Multidrug resistance;Antisense oligodeoxynuce-letides;Gene transfection;PEG-5-FU-MAMS;The pancreatic cancer

遼寧省自然科學基金項目(編號：201102006)

116001大連大學附屬中山醫(yī)院

尹家俊

R735.9

A

1001-5930(2016)07-1045-05

2015-08-21

2016-01-27)