孫航宇，歐小洪，孫薛蛟，曾麗蘭，王　歡，董登祥

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州　貴陽(yáng)　550025)

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18-β-甘草次酸衍生物的合成與體外抗HBV活性研究*

孫航宇，歐小洪，孫薛蛟，曾麗蘭，王歡，董登祥▲

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025)

本文合成18-β-甘草次酸衍生物4個(gè)，采用MT法測(cè)定其18-β-甘草次酸衍生物的抗HBV活性。再進(jìn)行樣品抑制HepG2.2.15細(xì)胞表達(dá)表面抗原(HBsAg)的測(cè)試。通過(guò)測(cè)試樣品GLY-1、GLY-5、GLY-9、GLY-10對(duì)HBsAg的分泌表達(dá)有一定的抑制作用。

18-β-甘草次酸衍生物，抗HBV，生物活性，糖化學(xué)

甘草是一味應(yīng)用極其廣泛的中藥材，具有補(bǔ)心脾氣、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥、緩和藥性等功效[1-2]。國(guó)內(nèi)外科研工作者已從甘草中分離了100多種黃酮類化合物、18種氨基酸、60多種三萜及香豆素類化合物、多種生物堿、雌性激素以及有機(jī)酸等[3-4]。其中有效成分18-β-甘草次酸具有抗炎、抗病毒(肝炎病毒、艾滋病毒、非典病毒等)、抗?jié)?、抗過(guò)敏、抗腫瘤等多方面的作用[5-6]。但是，該類藥物長(zhǎng)期服用可引起類醛固酮增多癥，從而導(dǎo)致水腫、高血壓、四肢癱瘓和低血鉀癥[7-8]。另外，也有報(bào)道甘草次酸對(duì)動(dòng)物甲狀腺有中度抑制和降低基礎(chǔ)代謝率的作用[9]。

水溶性差以及高濃度時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用制約了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。本文通過(guò)向18-β-甘草次酸引入基團(tuán)或糖片段，降低甘草次酸的副作用，改善甘草次酸的溶解性和可吸收性，進(jìn)而篩選出經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、高活性的18-β-甘草次酸類藥物便于臨床應(yīng)用。

1　儀器與試藥

Heidolph-4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、DF-Ⅱ集熱式磁力攪拌器、PSL-1800磁力攪拌低溫恒溫水槽、WFH-203B三用紫外分析儀、MA110電子天平。其余由貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥理與活性篩選中心提供。

18-β-甘草次酸、D-(+)-半乳糖、D-乳糖、D-葡萄糖、D-(+)-氨基葡萄糖鹽酸鹽；化學(xué)試劑為市售分析純；其余由貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥理與活性篩選中心提供。

2　方法

2.1合成路線(圖1)

圖1Fig.1

2.218-β-甘草次酸衍生物合成

以化合物18-β-甘草次酸為起始原料，經(jīng)乙酰化途徑，合成化合物3-O-乙?；?18-β-甘草次酸甲酯a。

2.2.1衍生物GLY-1合成

稱取80 mg(0.16 mmol)化合物 a 于圓底燒瓶中，加入4 mL Py和2 mL Ac2O，室溫?cái)嚢? h，經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完成，調(diào)pH至中性，用DCM萃取，再用無(wú)水MgSO4干燥，濃縮經(jīng)硅膠柱層析(Cy∶EtOAc = 2∶1)，得到化合物GLY-1。

波譜數(shù)據(jù)：ESI-MSm/z：549.3[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ(ppm)：5.67(s，1H，H-12)，4.58-4.47(m，1H，H-3)，3.69(s，3H，-COOCH3)，2.80(1H，H-9)，2.05(s，3H，-OOCCH3)，2.03-1.58(m，12H，H-21，H-18，H-19，H-2，H-19，H-1，H-7，H-22，H-6，H-5)，1.49-1.42(s，3H，20-CH3)，1.40 -1.27(m，11H，H-15，H-16，H-1，H-22，H-7，27-CH3，H-6，H-15，H-16)，1.19 -0.76(m，15H，25、26、28、23、24-CH3)；13C-NMR(101 MHz，CDCl3)δ(ppm)：200.12(C-11)，176.94(C-30)，171.03(C-18)，169.28(-COOCH3)，128.45(C-12)，80.60(C-3)，61.69(C-9)，54.98(C-5)，51.79(-COOCH3)，48.39(C-18)，45.38(C-8)，44.03(C-20)，43.16(C-14)，41.02(C-19)，38.75(C-4)，38.02(C-1)，37.71(C-10)，36.90(C-22)，32.66(C-7)，31.82(C-17)，31.10(C-21)，29.68(C-29)，28.41(C-16)，28.02(C-28)，26.40(C-15)，23.54(C-27)，23.31(C-2)，21.32(C-23，C-24)，18.64(-OOCCH3)，17.35(C-6)，16.67(C-25)，16.41(C-26).

2.2.2衍生物GLY-5合成

以D-吡喃葡萄糖為起始原料，經(jīng)全乙?；炔襟E，合成中間體片段2，3，4，6-四-O-乙?；?1-O-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亞胺酸酯 b 。

稱取100 mg(0.20 mmol)化合物 b 和147 mg(0.30 mmol)化合物 a 與圓底燒瓶中，加入適量的DCM使其溶解，冰水平衡10 min后加入30 μL的BF3·Et2O，經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完成，調(diào)pH至中性，用DCM萃取，再用無(wú)水MgSO4干燥，濃縮經(jīng)硅膠柱層析(Cy∶EtOAc = 1∶1)，得到化合物 c ，取化合物 c 加入約5 mL MeOH溶液使其溶解，再緩慢加入新制的MeONa溶液，保持反應(yīng)體系在PH = 11～13之間，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完成，調(diào)PH = 6，濃縮過(guò)柱純化，得化合物GLY-5。

波譜數(shù)據(jù)：ESI-MSm/z：669.3[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ(ppm)：5.54(s，1H，H-12)， 4.29(d，J = 8.1 Hz，1H，H-1’)，3.82-3.18(m，10H，H-6’，H-5’，H-2’，H-3’，H-4’，H-2’，3’，4’，6’-OH)，3.71-3.66(s，3H，-COOCH3)，2.73-2.62(m，1H，H-3)，2.44(s，1H，H-9)，2.14(2H，H-21)，1.96(1H，H-18)，1.84(m，2H，H-19)，1.73(m，2H，H-2)，1.61 -1.35(m，7H，H-1，H-7，H-22，H-6)，1.35-1.18(m，6H，H-29，H-5，H-15)，1.18-1.09(m，9H，H-28，H-25，H-26)，1.07-1.02(m，5H，H-16，H-27)，0.89(m，1H，H-6)，0.86(s，3H，H-23)，0.81(s，3H，H-24)；13C-NMR(101 MHz，CD3OD)δ(ppm)：202.59(C-11)，178.58(C-30)，172.61(C-13)，128.94(C-12)，107.33(C-1’)，90.38(C-3)，76.33(C-5’)，75.14(C-3’)，73.10(C-2’)，70.21(C-4’)，63.15(C-6’)，62.33(C-9)，56.48(C-5)，52.33(-COOCH3)，48.35(C-18)，46.74(C-8)，45.30(C-20)，44.58(C-19)，42.48(C-14)，42.31(C-4)，40.52(C-1)，40.23(C-10)，38.98(C-22)，38.07(C-7)，33.78(C-17)，32.96(C-21)，31.98(C-29)，29.13(C-16)，28.50(C-28)，27.54(C-15)，27.33(C-27)，27.05(C-2)，23.80(C-23，C-24)，19.25(C-6)，18.43(C-25)，16.98(C-26).

2.2.3衍生物GLY-9合成

以D-乳糖為起始原料，經(jīng)全乙?；炔襟E，合成中間體片段2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙?；?1-O-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亞胺酸酯d。

以D-乳糖為起始原料，經(jīng)全乙?；?、硫苷化等步驟，合成中間體片段對(duì)甲基-苯基-S-(2，6-二-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-2，3，6-三-O-芐基-D-吡喃葡萄糖苷e。

以化合物d和化合物e為起始原料，DCM為溶劑，TMSOTf為催化劑，合成中間體片段對(duì)甲基-苯基-S-[2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，6-二-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基]-(1→4)-2，3，6-三-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖苷f(shuō)。

稱取100 mg(0.06 mmol)化合物f和35 mg(0.07 mmol)化合物a與圓底燒瓶中，再加入27 mg NIS和100 mg 4? Ms，加入適量的DCM使其溶解，冰水平衡10 min后加入1.0 μL的TfOH，經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完成，調(diào)PH至中性，用DCM萃取三次，再用無(wú)水MgSO4干燥，濃縮經(jīng)硅膠柱層析(Cy∶EtOAc = 2∶1)，得到化合物g，取化合物g加入5 mL MeOH溶液使其溶解，再緩慢加入新制的MeONa溶液，保持反應(yīng)體系在PH = 11～13之間，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完成，調(diào)PH = 6左右，濃縮過(guò)柱純化，得化合物GLY-9。

波譜數(shù)據(jù)：ESI-MSm/z：1605.7[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ(ppm)：δ 7.52 -7.13(25H，Ar-H)，5.68(s，1H，H-12)，5.14- 4.97(2H，H-1’，H-1’’)，4.95- 4.89(2H，H-1’’’，H-1’’’’)，4.78-4.37(10H，Ph-CH2-)，4.37- 4.23(2H，H-5’，H-5’’)，4.06-3.99(1H，H-5’’’)，3.94 -3.84(4H，H-3’’，H-6’’’，H-6’’’’，H-5’’’’)，3.84 -3.76(3H，H-2’’’，H-3’’’，H-2’’’’)，3.76-3.15(25H，-COOCH3，H-6’，H-6’’，H-3’’，2’’’，3’’’，6’’’，2’’’’，3’’’’，4’’’’，6’’’’-OH，H-2’，H-3’，H-6’’’，H-6’’’’，H-3’’’’，H-4’’’’，H-2’’，H-4’，H-4’’，H-4’’’)，2.82-2.66(1H，H-3)，2.39(1H，H-9)，2.19-1.76( 6H，H-21，H-18，H-19，H-2)，1.76-1.15(17H，H-22，H-1，H-7，H-6，H-2，H-5，H-15，H-29，H-16)，1.13(s，3H，H-27)，1.07-0.79(9H，H-25，H-26，H-28)，0.56(s，3H，H-23)，0.47(s，3H，H-24)；13C-NMR(101 MHz，CD3OD)δ(ppm)：δ 202.41(C-11)，178.55(C-30)，172.54(C-13)，141.46 - 127.57(31C，Ar-C，C-12)，106.61 - 94.96(C-1’，C-1’’，C-1’’’，C-1’’’’)，90.28(C-3)，84.80(C-3’)，84.31(C-4’’)，83.35(C-4’’’)，82.12(C-2’)，81.19(C-2’’)，81.07 - 78.46(C-5’’’’，C-5’’’)，78.07(C-4’)，77.10(C-5’)，76.81(C-3’’’’)，75.64 - 72.92(10C，C-3’’，C-2’’’，C-5’’，C-2’’’’，C-3’’’，5個(gè)Ph-CH2-)，72.92 - 71.81(C-4’’’’)，71.19-69.65(C-6’，C-6’’)，62.55(C-6’’’)，62.53(C-6’’’’)，61.65(C-9)，56.79(C-5)，52.34(-COOCH3)，48.36(C-18)，46.75(C-8)，45.27(C-20)，44.57(C-19)，42.48(C-14)，42.28(C-4)，40.03(C-1)，39.54(C-10)，38.96(C-22)，38.18(C-7)，33.78(C-17)，32.94(C-21)，31.95(C-29)，29.15(C-16)，28.80(C-28)，28.52(C-15)，27.73 - 27.58(C-27)，27.42(C-2)，24.08(C-23)，23.84(C-24)，19.29(C-6)，18.61(C-25)，17.22(C-26).

2.2.4衍生物GLY-10合成

以D-吡喃半乳糖為起始原料，經(jīng)全乙?；⒘蜍栈炔襟E，合成中間體片段對(duì)甲基-苯基-S-2，6-二-O-芐基-D-吡喃半乳糖苷h。

以化合物d和化合物h為起始原料，DCM為溶劑，TMSOTf為催化劑，合成中間體片段對(duì)甲基-苯基-S-[2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基]-(1→4)-2，6-二-O-芐基-D-吡喃半乳糖苷i。

以化合物i和化合物a為起始原料，GLY-10的合成方法跟GLY-9相同。

波譜數(shù)據(jù)：ESI-MSm/z：1173.5[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ(ppm)：δ 7.52 -7.13(10H，Ar-H)，5.62(s，1H，H-12)，5.26(d，1H，H-1’)，5.26-4.99(2H，H-1’’，H-1’’’)，4.80 -4.35(4H，Ph-CH2-)，4.26-3.96(2H，H-5’，H-5’’)，3.96-3.84(1H，H-3’)，3.84-3.77(2H，H-6’’，H-6’’’)，3.75-3.12(24H，H-5’’’，H-2’’，H-2’’’，H-3’’，H-6’’，6’’’，3’，2’’，3’’，2’’’，3’’’，4’’’-OH，H-6’，H-6’’’，H-3’’’，H-4’’’，H-2’，H-4’，H-4’’，-COOCH3)，2.78-2.63(1H，H-3)，2.39(1H，H-9)，2.19-1.76( 6H，H-21，H-18，H-19，H-2)，1.76-1.15(17H，H-22，H-1，H-7，H-6，H-2，H-5，H-15，H-29，H-16)，1.13(s，3H，H-27)，1.07-0.79(9H，H-25，H-26，H-28)，0.56(s，3H，H-23)，0.47(s，3H，H-24)；13C-NMR(101 MHz，CD3OD)δ(ppm)：δ 202.61(C-11)，178.63(C-30)，172.70(C-13)，139.91-127.37(13C，Ar-C，C-12)，109.97- 105.22(3C，C-1’，C-2’’，C-3’’’)，92.18(C-3)，83.70-81.05(2C，C-4’，C-4’’)，80.86- 80.08(3C，C-2’，C-5’’’，C-5’’)，77.04(C-3’’’)，76.59 -74.58(7C，C-3’，C-2’’，C-5’，C-2’’’，C-3’’，2×Ph-CH2-)，72.7771.16(C-4’’’)，70.84(C-6’)，63.65-62.88(2C，C-6’’，C-6’’’)，61.26(C-9)，56.79(C-5)，52.34(-COOCH3)，48.36(C-18)，46.75(C-8)，45.27(C-20)，44.57(C-19)，42.48(C-14)，42.28(C-4)，40.03(C-1)，39.54(C-10)，38.96(C-22)，38.18(C-7)，33.78(C-17)，32.94(C-21)，31.95(C-29)，29.15(C-16)，28.80(C-28)，28.52(C-15)，27.73-27.58(C-27)，27.42(C-2)，24.08(C-23)，23.84(C-24)，19.29(C-6)，18.61(C-25)，17.22(C-26).

2.3活性測(cè)定

首先用MTT法評(píng)價(jià)樣品在預(yù)設(shè)濃度下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制程度，確定合適的樣品濃度，再進(jìn)行樣品抑制HepG2.2.15細(xì)胞表達(dá)表面抗原(HBsAg)的測(cè)試。通過(guò)計(jì)算樣品對(duì)HBsAg表達(dá)的抑制率來(lái)評(píng)價(jià)樣品活性。

計(jì)算公式：

1)樣品對(duì)細(xì)胞活力的抑制率(%)= [(對(duì)照組的OD值-樣品組的OD值)/ 對(duì)照組的OD值]×100

2)樣品對(duì)表面抗原的抑制率(%)=[(對(duì)照組的OD值-樣品組的OD值)/ 對(duì)照組的OD值]×100

2.4測(cè)定結(jié)果(表1)

表1　篩選結(jié)果Tab.1　screening results

注：活性實(shí)驗(yàn)由貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥理與活性篩選中心完成。

3　結(jié)果和討論

化合物GLY-1、GLY-5、GLY-9、GLY-10的體外抗HBV活性見(jiàn)表1。樣品GLY-1、GLY-5、GLY-9、GLY-10對(duì)HBsAg的分泌表達(dá)有弱的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外抗HBV活性評(píng)價(jià)雖然表現(xiàn)出抑制作用較弱，與商品化拉米夫定有一定的差距，但是初步實(shí)驗(yàn)只能說(shuō)明體外的活性作用稍弱?？紤]到糖苷在體內(nèi)的降解過(guò)程中還會(huì)在不同時(shí)段和部位釋放出具有藥理活性的苷元，我們還將進(jìn)一步將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)分析體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)的關(guān)系、釋藥時(shí)間及體內(nèi)代謝情況對(duì)活性的影響來(lái)說(shuō)明。本文對(duì)進(jìn)一步研究提供了一定的研究基礎(chǔ)。

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Synthesis of 18-β-glycyrrhetinic acid derivatives and their anti-HBV activity in vitro*

SUN Hangyu，OU Xiaohong，SUN Xuejiao，ZENG Lilan，WANG Huan，DONG Dengxiang▲

(GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine，Guiyang，Guizhou550025，China)

Four 18-β-glycyrrhetinic acid derivatives were synthesized by carbohydrate chemistry modification，and the anti-HBV activities of these compounds were determined by MTT method.Their inhibition abilities on HepG2.2.15 cells expressing HBsAg were tested.The results showed that GLY-1、GLY-5、GLY-9、GLY-10 have certain inhibitory effect on the secretory expression of HBsAg.

18-β-glycyrrhetinic acid derivatives，anti-HBV，bioactivity，carbohydrate chemistry

R979.9

A

1003-6563(2016)04-0001-04

2016-06-07；

2016-06-14

黔科合院士站(2014)4013；省長(zhǎng)基金(2070201-040-070857)。

孫航宇(1989-)，男，在讀碩士，研究方向：中藥、民族藥化學(xué)及新藥研究。

▲董登祥(1962-)，男，副教授，研究方向：藥物化學(xué)。