譚　霖，楊　鑫，龍　瀅，徐秋萍

(黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州　凱里　556000)

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黔東南州產(chǎn)青錢柳黃酮類成分的含量測(cè)定研究

譚霖，楊鑫，龍瀅，徐秋萍

(黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州凱里556000)

建立高效液相色譜法測(cè)定青錢柳中槲皮素、山柰素的含量，并測(cè)定黔東南州不同產(chǎn)地青錢柳中槲皮素、山柰素的含量。高效液相色譜法，色譜柱Symmetry C18(5 μm，150×4.6 mm，Waters)；流動(dòng)相：甲醇-0.4 %磷酸溶液(50；50)；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μl。經(jīng)實(shí)驗(yàn)得知黔東南州不同產(chǎn)區(qū)的青錢柳中槲皮素、山柰素含量存在一定的差異，槲皮素的含量范圍大概為0.663 2～0.814 7 mg / g；山柰素的含量范圍大概為0.587 1～0.715 5 mg / g。

青錢柳，槲皮素，山柰素，高效液相色譜儀

錢柳[Cyclocarpaliurus(Batal.)Iljinskaja]又名青錢李、搖錢樹等，雙子葉植物綱[Dicotyledneae]胡桃科[juglangdaceae]青錢柳屬植物。廣泛分布于江西、浙江、江蘇、福建、臺(tái)灣、湖北、四川、貴州等地的海拔420～2 500 m的山區(qū)、溪谷或石灰?guī)r山地。青錢柳為落葉大喬木，高10～30 m，髓部薄片狀；奇數(shù)羽狀復(fù)葉，小葉7～9枚。革質(zhì)橢圓形，上面有盾狀腺體，下面網(wǎng)脈明顯，邊緣有細(xì)鋸齒；樹皮灰色，枝條黑褐色，具灰黃色皮孔：芽密被銹褐色盾狀著生的腺體。雌雄同株，雄柔荑花序2～4條成一束集生在短總梗上，雌柔荑花序單獨(dú)頂生。果序軸長(zhǎng)25～30 cm，上有一串串的果實(shí)，果實(shí)革質(zhì)有水平圓盤狀翅，頂端有4枚宿存花被片及花柱，似銅錢，具觀賞價(jià)值。花期4-5月，果期7-9月。根系比較發(fā)達(dá)，主側(cè)根多分布于40～80 cm的土層中[1]。長(zhǎng)期以來，民間采其嫩葉制茶實(shí)用，該茶具有生津止渴、清熱解暑、降壓強(qiáng)心及延年益壽的作用，具有調(diào)節(jié)血脂，降低血糖，增強(qiáng)免疫等功能，抗氧化防衰老的作用[2]。研究表明：其中含有豐富的藥用成分，如多糖、黃酮、酚類、植物蛋白(小肽)、皂苷、香豆精、生物堿、甾體、萜類、苷類、有機(jī)酸、胡蘿卜素、維生素E、咖啡因等和一些人體必需的微量元素。黃酮類成分為青錢柳中報(bào)道較多的一類化學(xué)成分，主要有槲皮素、異槲皮苷、山奈酚、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖、山奈酚-3-O-β-D吡喃葡萄醛酸苷槲、皮素-3-氧-α-L-鼠李糖苷等[3]。本實(shí)驗(yàn)通過建立HPLC法測(cè)定黔東南州不同產(chǎn)地青錢柳槲皮素、山柰素的含量，研究得出黔東南州地區(qū)產(chǎn)青錢柳槲皮素、山柰素的含量范圍，為青錢柳的進(jìn)一步研究提供了一定的參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

儀器：UItimate3000(DGLC)Chromeleon HPLC儀(賽默飛科技(中國)有限公司)、色譜柱SymmetryC18(5 μm，150×4.6 mm，Waters公司生產(chǎn))、EA-240電子天平(梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司)、KQ-500DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司；工作頻率：40 kHz，功率：250 W)、XMTD-240數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(常州市諾基儀器有限公司)、SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(常州普天儀器制造有限公司)等。

試劑：鹽酸(分析純)、甲醇(色譜純、分析純)、磷酸(分析純)；水為哇哈哈純凈水。

對(duì)照品：槲皮素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)100081-200406)、山柰素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所提供， 110861-201209)。

供試品：黔東南州劍河縣產(chǎn)2批(劍河1、劍河2)、雷山縣產(chǎn)2批(雷山1、雷山2)、施秉縣產(chǎn)2批(施秉1、施秉2)，共6個(gè)批次。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1提取溶劑的考察

根據(jù)青錢柳槲皮素、山柰素的理化性質(zhì)，分別選取甲醇、25 %鹽酸溶液—甲醇(1∶6)作為提取溶劑，考察最佳提取溶劑。分別取本品粉末約1.0 g(過3號(hào)篩)各平行2份共4份，其余按1.4項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定，每份平行進(jìn)兩針。平均含量結(jié)果見表1。

表1　不同提取溶劑的平均含量Tab.1　the average content of different extraction solvents

通過表1結(jié)果表明用甲醇提取槲皮素、山柰素的平均含量最高且溶劑方便直接取用不需要配制。故選擇25 %鹽酸溶液—甲醇(1∶6)作為提取溶劑。

1.2.2提取時(shí)間的考察

分別取本品粉末約1.0 g(過3號(hào)篩)各平行2份共6份，精密稱定，并加25 %鹽酸溶液—甲醇(1∶6)的混合溶液40 mL，分別置于80 ℃水浴加熱回流20 min、30 min、40 min，取出，并都迅速冷卻至室溫；轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用甲醇5 mL洗滌回流瓶，洗液并入同一量瓶中并加入甲醇稀釋至刻度；搖勻；濾過；取續(xù)濾液；過0.45 μL微孔濾膜，即得。其余按1.4項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定，每份平行進(jìn)兩針。平均含量結(jié)果見表2。

表2　不同提取時(shí)間的平均含量Tab.2　The average content of different extraction time

上述結(jié)果表明，隨著回流時(shí)間的增加，槲皮素、山柰素的提取量也逐漸增加，但是80 ℃水浴回流30 min和40 min的含量差異不大，所以選擇80 ℃水浴回流30 min。

1.3色譜條件的優(yōu)化

1.3.1流動(dòng)相的優(yōu)化

根據(jù)資料顯示，槲皮素、山柰素的HPLC含量測(cè)定的流動(dòng)相一般有：甲醇-0.4 %磷酸溶液(60∶40)；甲醇-0.4 %磷酸溶液(50∶50)；甲醇-0.4 %磷酸溶液(43∶57)。經(jīng)過研究者在自身擁有的條件下研究摸索：流動(dòng)相為甲醇-0.4 %磷酸溶液(60∶40)時(shí)槲皮素、山柰素目標(biāo)峰的保留時(shí)間過短，出峰時(shí)間過早，均在10 min以內(nèi)；流動(dòng)相為甲醇-0.4 %磷酸溶液(43∶57)時(shí)槲皮素、山柰素目標(biāo)峰的保留時(shí)間又太過于長(zhǎng)，出峰時(shí)間太晚在20 min之后了。故選擇嘗試做流動(dòng)相為甲醇-0.4 %磷酸溶液(50∶50)，其余按1.4項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定(圖1)。

圖1　流動(dòng)相為甲醇-0.4 %磷酸溶液(50∶50)Fig.1　mobile phase of methanol to 0.4 % phosphoric acid solution(50∶50)

由色譜圖得出：槲皮素、山柰素目標(biāo)峰的保留時(shí)間適中，出峰時(shí)間在15 min以內(nèi)，分離效果好。故選擇流動(dòng)相為甲醇-0.4 %磷酸溶液(50∶50)為最佳流動(dòng)相。

為了檢測(cè)前后峰的名稱，故選擇按“1.4色譜條件”進(jìn)樣10 μL，對(duì)槲皮素對(duì)照品進(jìn)行定位，見圖2。

圖2　槲皮素定位圖Fig.2　quercetin location map

由色譜圖可以得出第一個(gè)峰為槲皮素，第二個(gè)峰為山柰素。

1.3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

根據(jù)查閱資料文獻(xiàn)顯示，槲皮素、山柰素在360 nm處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm[4]。

1.4色譜條件及溶液制備

1.4.1色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.4 %磷酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；柱溫30 ℃；理論板數(shù)按槲皮素、山柰素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

1.4.2對(duì)照品溶液的制備

取干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品0.010 01 g(97.3 %)、山柰素0.010 22 g(93.2 %)，分別于25 mL量瓶中定容至刻度，搖勻，得0.389 6 mg / mL的原槲皮素對(duì)照品溶液、0.381 0 mg / mL原山柰素對(duì)照品溶液。再分別取1.0 mL的原槲皮素對(duì)照品溶液及原山柰素對(duì)照品溶液，于同一25 mL的量瓶中定容至刻度，搖勻，得到含槲皮素15.584 μg / mL及含山柰素15.24 μg / mL的混合對(duì)照品溶液。

1.4.3供試品溶液的制備

取本品粉末約1.0 g(過3號(hào)篩)，精密稱定，加25 %鹽酸溶液—甲醇(1∶6)的混合溶液40 mL，置于80 ℃水浴上加熱回流30 min，取出，迅速冷卻至室溫；轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用甲醇5 mL洗滌回流瓶，洗液并入同一量瓶中并加入甲醇稀釋至刻度；搖勻；濾過；取續(xù)濾液；過0.45 μL微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.4.4測(cè)定法

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算槲皮素、山柰素的含量。

2　分析方法驗(yàn)證

2.1線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL，按1.4項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每份平行進(jìn)兩針。注入液相色譜儀，記錄色譜圖，并以混合對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計(jì)算。槲皮素線性回歸方程為：y= 63.226x+0.005 27，相關(guān)系數(shù)r=0.999 86；線性關(guān)系考察結(jié)果、標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。山柰素線性回歸方程為：y=66.168x-0.028 83，相關(guān)系數(shù)r=0.999 94；線性關(guān)系考察結(jié)果、標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖3　槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　quercetin standard curve

圖4　山柰素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　kaempferia galanga standard curve

由上述測(cè)定結(jié)果表明槲皮素進(jìn)樣量在0.028 9～0.173 4 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；山柰素進(jìn)樣量在0.029 9～0.179 4 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按1.4項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，以峰面積計(jì)算RSD(%)。樣品色譜圖及測(cè)定結(jié)果分別見圖5及表3。

圖5　青錢柳樣品色譜圖Fig.5　samples of cyclocarya paliurus chromatograms

由色譜圖可看出樣品中含有山柰素和槲皮素。

表3　精密度試驗(yàn)Tab.3　precision test

從表中可看出槲皮素和山奈素的精密度(RSD)均小于2.0 %，結(jié)果表明，本方法精密度好。

2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取劍河地區(qū)青錢柳(劍河1)粉末(過3號(hào)篩)，平行制備6份，按1.4項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，RSD以平均含量計(jì)算，槲皮素RSD =1.1 %，山柰素RSD =0.58 %。測(cè)定結(jié)果見表4。

表4　重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Tab.4　repetitive experiments

由表4可知該方法的重現(xiàn)性良好。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中的第一份供試液于0、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h時(shí)間點(diǎn)，按1.4項(xiàng)色譜條件測(cè)定槲皮素、山柰素峰面積，進(jìn)行RSD以平均含量計(jì)算。槲皮素平均峰面積值為9.194 2 ，RSD為1.3 %；山柰素平均峰面積值為7.472 4，RSD為1.3 %。結(jié)果見表5。

表5　穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab.5　stability test

由上述測(cè)定結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

3　不同產(chǎn)地樣品的測(cè)定

精密稱取黔東南州3個(gè)不同產(chǎn)地的6批青錢柳樣品約1.0 g(過3號(hào)篩)，按1.4項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。色譜疊加圖及測(cè)定結(jié)果分別見圖6和表6。

圖6　六種不同批次樣品色譜疊加圖Fig.6　six different batches sample chromatographic overlay chart 表6　樣品測(cè)定結(jié)果 Tab.6　samples determination results

樣品批號(hào)稱樣量/g槲皮素含量/(mg/g)山柰素含量/(mg/g)劍河11.00040.66320.5871劍河21.00080.66820.5831雷山11.00030.73460.6415雷山21.00090.72410.6393施秉11.00040.81470.7155施秉21.00130.80960.7049

4　結(jié)果與討論

通過對(duì)黔東南州3個(gè)不同產(chǎn)地6個(gè)不同批次的青錢柳中槲皮素、山柰素進(jìn)行含量測(cè)定；結(jié)果表明，黔東南州地區(qū)青錢柳中槲皮素的含量范圍大概為0.663 2 mg / g～0.814 7 mg / g；山柰素的含量范圍大概為0.587 1 mg / g～0.715 5 mg / g。其中，同一產(chǎn)地的不同批次的青錢柳中槲皮素、山柰素含量均有細(xì)小的差異，不同產(chǎn)地間青錢柳中槲皮素、山柰素含量存在著較為明顯的差異。因此為保證質(zhì)量應(yīng)注意產(chǎn)地和批次。本次沒有對(duì)樣品的生長(zhǎng)環(huán)境、干燥方法和具體采收時(shí)間進(jìn)行考察，這幾個(gè)因素對(duì)樣品的質(zhì)量有一定的影響。

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Determination of the content of flavonoids inCyclocaryapaliurusgrown in Qiandongnan

TAN Lin，YANG Xin，LONG Ying，XU Qiuping

(QiandongnanFoodandDrugInspectionandTestingCenter，Kaili556000，China)

In this study，we developed a method for the determination of the content of quercetin and kaempferol in Cyclocarya paliurus by HPLC，and determined the content of quercetin and kaempferol in Cyclocarya paliurus grown in different places in Qiandongnan.The experimental scheme was as follows：chromatography column Symmetry C18(5 um，150×4.6 mm，Waters)，methanol / 0.4 % phosphoric acid solution(50，50)as mobile phase，detection wavelength of 360 nm，column temperature at 30 ℃，flow rate at 1.0mL·min-1，sample volume of 10 μl.The results showed that the content of quercetin and kaempferol in Cyclocarya paliurus grown in different places were different.The content of quercetin was within the range of 0.663 2～0.814 7 mg / g，and the content of kaempferol was within the range of 0.587 1～0.715 5 mg / g.

Cyclocaryapaliurus，quercetin，kaempferol，high performance liquid chromatograph

R284.1

A

1003-6563(2016)04-0077-05

2014-04-13；

2016-04-18

譚霖，男，苗族，貴州省天柱縣人，本科，就職于黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，研究領(lǐng)域：中藥學(xué)，研究方向：中藥材質(zhì)量。