楊加鵬 李光劍 黃云超 葉聯(lián)華 周永春 趙光強(qiáng) 雷玉潔 陳小波 王昆 陳穎 戴春 張艷軍

云南宣威地區(qū)是中國(guó)肺癌的點(diǎn)狀高發(fā)區(qū)。據(jù)2013年流行病學(xué)調(diào)查[1]顯示，宣威地區(qū)肺癌發(fā)病率居高不下。據(jù)既往研究[2]表明，該地區(qū)女性的肺癌發(fā)生與使用煙煤充當(dāng)生活燃料密切相關(guān)。煙煤燃燒產(chǎn)物中富含可吸入細(xì)顆粒物以及苯并芘等有害物質(zhì)。吸入肺部的無(wú)機(jī)細(xì)顆粒常常造成氧化損傷甚至激活核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor κB,NF-κB）通路。NF-κB在人體免疫、炎癥、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等方面發(fā)揮著重要作用[3]。這些有害物質(zhì)可以通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)共同構(gòu)成腫瘤的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME），誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）與氧化損傷共同作用，損傷DNA，對(duì)腫瘤的發(fā)生起到了促進(jìn)作用。本研究通過(guò)研究宣威肺癌患者術(shù)后病理組織的超微結(jié)構(gòu)以及組織中NF-κB信號(hào)激活以及下游產(chǎn)物表達(dá)情況，進(jìn)而探討該地區(qū)肺癌的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2013年12月-2014年11月在昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的宣威地區(qū)患者35例，男性19例，女性16例；年齡為（57.09±8.79）歲；非宣威地區(qū)肺癌手術(shù)患者13例，男性8例，女性5例；年齡（52.00±7.57）歲；并確診為肺腺癌的病理標(biāo)本（癌、癌旁組織、正常肺組織）（包括蠟塊、凍存組織）。術(shù)前一天抽取靜脈血，留取晨尿。實(shí)驗(yàn)試劑主要有：maxvisionTM免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司150804448F）細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒（華美生物），NF-κB p65（CST D14E12），iNOS（GENE TEX 821502059），8-OHdG抗體（SANTA CRUZ 11014），8-OHdG ELISA檢測(cè)試劑盒（江萊生物KB12002）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 紫外分光光度計(jì)（Beckman,USA）；電泳儀（EPS 301,USA）；凝膠成像系統(tǒng)（UVP,USA）；電子顯微鏡（Olympus,Japan）；普通顯微鏡（Laica,German）等。

1.3 方法

1.3.1 電子顯微鏡檢測(cè) 術(shù)后取1 mm×1 mm×1 mm肺臟組織塊，立即用4%戊二醛固定，0.1 mol/L二甲砷酸緩沖液沖洗2遍，1%四氧化餓固定，再經(jīng)緩沖液沖洗，逐級(jí)丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂浸透，包埋，超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色。透射電鏡觀察肺臟線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化，透射電子顯微鏡觀察宣威地區(qū)肺組織超微結(jié)構(gòu)以及無(wú)機(jī)雜質(zhì)的賦存；做能譜分析的病理切片不做鉛染色和鈾染色。

1.3.2 細(xì)胞因子檢測(cè) 抽取術(shù)前患者以及正常成年人的靜脈血，完全凝血后，1,500 rpm，離心15 min，含量用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）測(cè)定。

1.3.3 免疫組化檢測(cè)以及判斷標(biāo)準(zhǔn) 大鼠抗人NF-κB p65濃縮型抗體，iNOS抗體，SP免疫組化染色按試劑盒說(shuō)明書NF-κB p65工作濃度為1:200、iNOS工作濃度為1:100。所有切片均采用微波修復(fù)抗原，一抗4℃冰箱溫盒內(nèi)過(guò)夜，顯色。用已知陽(yáng)性片做對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。免疫組化染色結(jié)果判斷，NF-κB p56、iNOS免疫組化染色以細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性，用雙盲法，結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個(gè)方面計(jì)算NF-κB p56、iNOS免疫組化染色評(píng)分：染色結(jié)果判定參照1996年全國(guó)免疫組化技術(shù)與診斷標(biāo)準(zhǔn)化專題研討會(huì)意見(jiàn)：＜25%的細(xì)胞著色，陰性（-）；25%-50%的細(xì)胞著色，弱陽(yáng)性（+）；51%-70%的細(xì)胞著色，中度陽(yáng)性（++）；＞70%的細(xì)胞著色，強(qiáng)陽(yáng)性（+++），本實(shí)驗(yàn)中只統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性與陰性結(jié)果。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測(cè)NF-κB p65和iNOS的表達(dá) 分別取對(duì)免疫組化中有NF-κB p65和iNOS陽(yáng)性表達(dá)的宣威和非宣威地區(qū)各患者進(jìn)行Western blot檢測(cè)，精確稱取備用的肺癌、癌旁組織、正常組織0.1 g經(jīng)勻漿離心后取上清液，考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)核蛋白濃度，并調(diào)整核蛋白濃度為5 μg/μL，置于-80℃保存?zhèn)溆?。每泳道?0 μL提取蛋白以及內(nèi)參GAPDH，用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離，電轉(zhuǎn)至固相支持體硝酸纖維素濾膜上，分別按程序加入NF-κB p65、iNOS一抗和二抗、發(fā)光試劑發(fā)光、顯影[4]。

1.3.5 DNA氧化損傷的檢測(cè) 肺癌病理組織以及尿液中8-OHdG的賦存情況，SP免疫組化染色按試劑盒說(shuō)明書8-OHdG工作濃度為（1:100）。所有切片均采用微波修復(fù)抗原，一抗4℃冰箱溫盒內(nèi)過(guò)夜，顯色。用已知陽(yáng)性片做對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。然后取尿液5 mL，1,500 rpm離心取上清后用ELISA法檢測(cè)8-OHdG的含量；自動(dòng)生化儀測(cè)尿液中的肌酐（creatinine,Cr）含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，各細(xì)胞因子、8-OHdG值比較采用t檢驗(yàn)，NF-κB P65、iNOS免疫組化結(jié)果分析采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織的超微結(jié)構(gòu)變化情況 在宣威肺癌的病理組織中，發(fā)現(xiàn)在肺泡II型細(xì)胞（圖1A、圖1B）、巨噬細(xì)胞中可見(jiàn)到納米級(jí)無(wú)機(jī)物被溶酶體吞噬（圖1C），且不容易消化和清除。對(duì)無(wú)機(jī)物進(jìn)行元素分析，含有硅成分（圖1D、圖1E）；其他地區(qū)的肺組織中未見(jiàn)明顯的無(wú)機(jī)雜質(zhì)沉積。

2.2 各地區(qū)的肺癌患者血清中細(xì)胞因子的表達(dá)情況 宣威地區(qū)患者血清中白介素（interleukin,IL）-1β［（31.50±19.16）pg/mL］較其他地區(qū)肺癌患者［（11.33±6.94）pg/mL］高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

2.3 各地區(qū)的肺癌患者組織中的NF-κB p65的表達(dá)情況在宣威地區(qū)肺癌患者中，NF-κB p65蛋白主要表達(dá)與癌組織的胞核染色（圖2），宣威肺癌患者陽(yáng)性27例，陰性8例；非宣威肺癌患者陽(yáng)性3例，陰性10例；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 各地區(qū)的肺癌患者組織中的iNOS的表達(dá)情況 在宣威地區(qū)肺癌患者中，iNOS蛋白主要表達(dá)與癌組織的胞核染色（圖3），宣威肺癌患者陽(yáng)性30例，陰性5例；非宣威肺癌患者陽(yáng)性6例，陰性7例；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 不同地區(qū)肺癌患者的肺組織中NF-κB p65和iNOS的表達(dá)情況 宣威肺癌與其他地區(qū)肺癌患者的術(shù)后病理組織中癌組織有NF-κB p65和iNOS表達(dá)，較非宣威地區(qū)明顯升高（圖4A）；癌旁和正常組織之間未見(jiàn)明顯差異（圖4B）。

2.6 宣威肺癌患者病理組織和尿液中8-OHdG的賦存情況 在宣威肺癌組織中檢測(cè)到8-OHdG以胞核染色為主，多為強(qiáng)陽(yáng)性（圖5），宣威肺癌患者尿液中的8-OhdG（40.124±8.597）ng/mgCr與其他地區(qū)患者（25.673±7.986）ng/mgCr相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖6）。

3 討論

云南宣威地區(qū)肺癌發(fā)病率居高不下，研究當(dāng)?shù)胤伟┌l(fā)病機(jī)制成為熱點(diǎn)和難點(diǎn)。既往研究表明，當(dāng)?shù)胤伟└甙l(fā)，可能與使用劣質(zhì)的燃煤作為生活燃料相關(guān)，燃煤在熱力作用下釋放出可吸入細(xì)顆粒物（fine particulate matter,PM2.5）、多環(huán)芳烴類（polycyclic aromatic hydrocarbon,PAH）等有害物質(zhì)。這些有害物中大部分為無(wú)機(jī)顆粒物，可能會(huì)被吸入肺內(nèi)并沉積下來(lái)。本研究通過(guò)對(duì)當(dāng)?shù)胤伟┗颊叩男g(shù)后標(biāo)本進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，在癌旁組織中的巨噬細(xì)胞、肺泡II型細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)物被溶酶體吞噬，且不容易消化和清除。對(duì)無(wú)機(jī)物進(jìn)行元素分析，含有Si成分。在其他地區(qū)肺癌患者癌旁組織中，未見(jiàn)到類似無(wú)機(jī)物沉積。肺泡II型細(xì)胞在肺損傷，炎癥等過(guò)程中起著重要的作用，多數(shù)肺癌起源于II型肺泡細(xì)胞[5]。且II型肺泡細(xì)胞有部分干細(xì)胞的特性，在肺損傷的修復(fù)中起重要作用[6]。所以，II型肺泡細(xì)胞內(nèi)的雜質(zhì)可能對(duì)肺癌的發(fā)生起到某種作用。此外一些物質(zhì)雖然被吞噬細(xì)胞吞噬，由于自身難以被消化，所以被長(zhǎng)期以次級(jí)溶酶體存在下去，也可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害作用。在氧化應(yīng)激條件下，肺內(nèi)沉積物可能參與NF-κB/IκB復(fù)合物的活化[7]。Lin等[8]研究表明，暴露于二氧化硅納米顆粒人類支氣管肺泡細(xì)胞毒性呈劑量依賴性，其細(xì)胞毒性與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。此外，氧化劑通過(guò)二氧化硅粒子和活化細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞和肺損傷的產(chǎn)生；炎性細(xì)胞因子也可以調(diào)控TNF-α、IL-1β、TGF-β的表達(dá)增加，激活MAP激酶途徑、NF-κB信號(hào)通路[9]。此外，二氧化硅粒子可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生RNS和NO，也可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞的凋亡[10]。無(wú)機(jī)灰塵的吸入可以導(dǎo)致下呼吸道的慢性炎癥[11]。而炎性細(xì)胞參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展[12]。大氣顆粒物（PM）已與肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，甚至可能導(dǎo)致DNA氧化性損傷，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)生[13]。Dagher研究[14]結(jié)果表明，在體外短期暴露于PM2.5可誘導(dǎo)L132細(xì)胞凋亡。無(wú)機(jī)顆粒一方面通過(guò)氧化損傷等作用造成細(xì)胞直接損傷；另一方面造成一些慢性炎癥，與炎癥細(xì)胞及因子共同構(gòu)成腫瘤微環(huán)境；導(dǎo)致NF-κB的信號(hào)激活，從而在宣威肺癌的發(fā)病中起到了一定的促進(jìn)作用。

圖1 宣威肺癌患者中肺組織的超微結(jié)構(gòu)與能譜圖。A：肺泡II型細(xì)胞；B：肺泡II型細(xì)胞中的溶酶體吞噬雜質(zhì)；C：巨噬細(xì)胞中的雜質(zhì)；D：肺組織內(nèi)的雜質(zhì)；E：肺組織內(nèi)的雜質(zhì)行能譜分析，有硅元素。Fig 1 Ultrastructure of lung tissue in Xuanwei lung cancer patients and energy spectrum.A：alveolar type II cells；B：iveolar type II cells lysosomal phagocytic impurities；C：macrophages impurities；D：impurities in the lung tissue；E：line spectra analysis of lung tissue,silicon element.

表1 不同地區(qū)血清中細(xì)胞因子的表達(dá)情況（pg/mL）Tab 1 Cytokine expression levels in different areas (pg/mL)

圖2 不同組織間NF-κB p65表達(dá)情況（SP法）。A：宣威肺癌患者正常組織NF-κB p65的表達(dá)情況（×100）；B：宣威肺癌患者癌旁組織NF-κB p65的表達(dá)情況（×100）；C：宣威肺癌患者肺癌組織NF-κB p65的表達(dá)情況（×200）；D：非宣威肺癌患者正常組織NF-κB p65的表達(dá)情況（×100）；E：非宣威肺癌患者癌旁組織NF-κB p65的表達(dá)情況（×100）；F：非宣威肺癌患者正常組織NF-κB p65的表達(dá)情況（×100）。Fig 2 Expression of NF-κB between different organizations (SP methods).A：Xuanwei lung cancer patients with normal tissue expression of NF-κB p65 (×100)；B：Xuanwei lung cancer adjacent tissue expression of NF-κB p65 (×100)；C：Xuanwei lung cancer tissue expression of NF-κB p65 (×200)；D：Un-Xuanwei lung cancer patients with normal tissue expression of NF-κB p65 (×100)；E：Un-Xuanwei lung cancer adjacent tissue expression of NF-κB p65 (×100)；F：Un-Xuanwei lung cancer tissue expression of NF-κB p65 (×100).NF-κB： nuclear factor κB.

圖3 不同組織間iNOS表達(dá)情況（SP法）。A：宣威肺癌患者正常組織iNOS的表達(dá)情況（×100）；B：宣威肺癌患者癌旁組織iNOS的表達(dá)情況（×100）；C：宣威肺癌患者肺癌組織iNOS的表達(dá)情況（×200）；D：非宣威肺癌患者正常組織iNOS的表達(dá)情況（×100）；E：非宣威肺癌患者癌旁組織iNOS的表達(dá)情況（×100）；F：非宣威肺癌患者正常組織INOS的表達(dá)情況（×100）。Fig 3 Expression of iNOS between different organizations (SP methods).A：Xuanwei lung cancer patients with normal tissue expression of iNOS(×100)；B：Xuanwei lung cancer adjacent tissue expression of iNOS (×100)；C：Xuanwei lung cancer tissue expression of iNOS；D：Un-Xuanwei lung cancer patients with normal tissue expression of iNOS (×100)；E：Un-Xuanwei lung cancer adjacent tissue expression of iNOS (×100)；F：Un-Xuanwei lung cancer tissue expression of iNOS (×100).iNOS：inducible nitric oxide synthase.

圖4 不同組織間NF-κB p65和iNOS的表達(dá)情況。A：宣威肺癌各組織的NF-κB p65和iNOS的Western blot結(jié)果；B：非宣威地區(qū)肺癌各組織的NF-κB p65和iNOS的Western blot結(jié)果。Fig 4 Expression of NF-κB p65 and iNOS between different organizations.A：Expression of NF-κB p65 and iNOS between different organizations in xuanwei lung cancer patients；B：Expression of NF-κB p65 and iNOS between different organizations in Un-xuanwei lung cancer patients.

圖5 不同組織間8-OHdG表達(dá)情況（SP法）。A：宣威肺癌患者正常組織8-OHdG的表達(dá)情況（×100）；B：宣威肺癌患者癌旁組織8-OHdG的表達(dá)情況（×100）；C：宣威肺癌患者肺癌組織8-OHdG的表達(dá)情況（×200）；D：非宣威肺癌患者正常組織8-OHdG的表達(dá)情況（×100）；E：非宣威肺癌患者癌旁組織8-OHdG的表達(dá)情況（×100）；F：非宣威肺癌患者正常組織8-OHdG的表達(dá)情況（×100）。Fig 5 Expression of 8-OHdG between different organizations (SP methods).A：Xuanwei lung cancer patients with normal tissue expression of 8-OhdG (×100)；B：Xuanwei lung cancer adjacent tissue expression of 8-OhdG (×100)；C：Xuanwei lung cancer patients with cancer tissue expression of 8-OhdG (×200)；D：Un-Xuanwei lung cancer patients with normal tissue expression of 8-OhdG (×100)；E：Un-Xuanwei lung cancer adjacent tissue expression of 8-OhdG (×100)；F：Un-Xuanwei lung cancer patients with cancer tissue expression of 8-OhdG (×100).

本研究提示，宣威地區(qū)的患者中的血液中IL-1β較其他地區(qū)患者高。研究[15]表明：IL-1β在胃癌的發(fā)病中起著重要的作用。Zienolddiny[16]研究發(fā)現(xiàn)：IL-1β基因多態(tài)性與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。外界的刺激物、IL-1β表達(dá)與NF-κB通路之間形成正反饋調(diào)節(jié)[17]。當(dāng)?shù)胤伟┗颊哐錓L-1β較高，一方面反映了該地區(qū)肺癌的發(fā)病可能受到外界的特殊刺激，另一方面，這些刺激也會(huì)激活信號(hào)通路并共同構(gòu)成腫瘤微環(huán)境，對(duì)腫瘤的發(fā)生起到促進(jìn)作用。此外，IL-1β可能成為環(huán)境相關(guān)肺癌的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)：宣威肺癌患者的術(shù)后病理組織中有NF-κB p65和iNOS蛋白表達(dá)，各組織間呈差異性表達(dá)。NF-κB最常見(jiàn)的形式是由p50與p65亞基組成的異二聚體，靜息狀態(tài)下，NF-κB與抑制因子IκB單體偶聯(lián)，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在外界多種因素刺激下，IκB磷酸化后降解，NF-κB得以釋放并移入核內(nèi)與靶基因序列上特定的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)或調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)iNOS的過(guò)量表達(dá)[18]。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB能誘導(dǎo)iNOS的蛋白質(zhì)的表達(dá)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，形成8-OHdG[19]。有研究[20]表明在人體內(nèi)微環(huán)境下，NF-κB與細(xì)胞因子相互調(diào)節(jié)促進(jìn)人膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。NF-κB作為關(guān)鍵性的多中心調(diào)節(jié)因子，也可以導(dǎo)致iNOS的表達(dá)。高表達(dá)的iNOS產(chǎn)生高濃度的NO，NO可通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致DNA損傷。一氧化氮的產(chǎn)生與心肌肌絲和DNA的氧化損傷有關(guān)[21,22]。Kankaanranta研究[23]表明：外源性與內(nèi)源性化合物產(chǎn)生RNS促進(jìn)了細(xì)胞癌變。Zhao等[24]研究表明：活性氧產(chǎn)生和所得慢性氧化應(yīng)激過(guò)程中。羅云敬等[25]研究表明，iNOS是通過(guò)表達(dá)NO，形成在一氧化氮（NO·）和超（O2-·）的反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)氧化劑過(guò)氧亞（ONOO-），最終導(dǎo)致DNA的損傷。Burney研究[26]表明：過(guò)氧亞（ONOO-）誘導(dǎo)的DNA損傷，8-OHdG可以作為該種損傷的特異性指標(biāo)。Speranza研究[27]表明：在肺癌中iNOS催化生產(chǎn)NO，分子濃度升高可以轉(zhuǎn)換為高活性化合物，激活NF-κB信號(hào)通路，可誘導(dǎo)慢性炎癥，從而增加細(xì)胞轉(zhuǎn)化癌癥風(fēng)險(xiǎn)。NF-κB通路一方面誘導(dǎo)iNOS的合成；另一方面誘導(dǎo)慢性炎癥，為DNA損傷提供了必要的條件。

本研究表明：宣威地區(qū)肺癌患者的肺癌組織以及癌旁組織中，有不同程度的氧化損傷。這是基因突變導(dǎo)致腫瘤的學(xué)說(shuō)基礎(chǔ)。研究表明：DNA鏈斷裂主要是脫氧核糖遭到羥自由基攻擊破壞，磷酸二酯鍵的斷裂或堿基的破壞或脫落[28]。Wu等[29]研究表明：活性氮（RNS）攻擊細(xì)胞核和線粒體內(nèi)的DNA，從而產(chǎn)生8-OHdG，其已成為檢測(cè)和研究DNA損傷的常用指標(biāo)。8-OHdG是自由基誘導(dǎo)DNA氧化損傷的主要形式之一，并因此被廣泛用于氧化應(yīng)激和癌變研究中[30]。宣威地區(qū)肺癌組織以及尿液中的8-OHdG升高，提示該地區(qū)肺癌發(fā)病與DNA損傷相關(guān)。

綜上所述，在宣威地區(qū)肺癌高發(fā)的背后，環(huán)境有害物以及NF-κB-iNOS信號(hào)通路激活可能起到了促進(jìn)肺癌形成的作用。本研究從宣威肺癌高發(fā)區(qū)的肺癌標(biāo)本入手，探究了當(dāng)?shù)胤伟┌l(fā)生的特征以及NF-κB的激活以及iNOS的表達(dá)情況。目前對(duì)肺部無(wú)機(jī)物是否造成其他損傷以激活其他信號(hào)通路目前還有待探索，對(duì)信號(hào)通路的起始、激活的位點(diǎn)、以及驗(yàn)證有待進(jìn)一步研究。希望本研究為宣威當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境污染的控制以及肺癌的防治提供理論依據(jù)。