朱云鳳，陳少瑜,2，郝佳波,2，吳濤,2

(1.云南省林業(yè)科學院，云南　昆明650201；2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室；國家林業(yè)局開放性重點實驗室云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育實驗室，云南　昆明650201)

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思茅松優(yōu)良無性系的聚類分析及精英無性系特異標記*

朱云鳳1，陳少瑜1,2，郝佳波1,2，吳濤1,2

(1.云南省林業(yè)科學院，云南昆明650201；2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室；國家林業(yè)局開放性重點實驗室云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育實驗室，云南昆明650201)

以85個思茅松優(yōu)良無性系為研究對象，通過RAPD分子標記方法對85個無性系的遺傳距離進行分析，構(gòu)建UPGMA聚類樹狀圖，探討85個無性系之間的遺傳關(guān)系，為雜交親本的選配和育種群體的多樣性評價提供科學依據(jù);此外，針對85個無性系中的33個精英無性系進行分析，探尋其特異標記，旨在為精英無性系的分子鑒別提供依據(jù)。研究結(jié)果表明，85個無性系可以劃分為遺傳差異較明顯的3大類群，同時發(fā)現(xiàn)2個能夠區(qū)分部分精英無性系的特異標記。

思茅松；精英無性系；遺傳多樣性；特異標記;RAPD分子標記法;UPGMA聚類樹狀圖

思茅松(Pinuskesiyavar.langbianensis)，常綠喬木，樹冠廣圓形；樹皮較薄，褐色，裂成龜甲狀薄塊片脫落；枝條每年生長2至數(shù)輪；屬喜溫熱型氣候的南亞熱帶松類[1]，是云南省四大用材樹種之一[2]。該樹種主要分布于我國云南麻栗坡、思茅、景東、寧洱、潞西，越南中、北部以及老撾等地。Gaussen等認為可用于紙漿材、坑木、枕木和采脂[3～4]，具有速生、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)脂和生態(tài)適應(yīng)性強等特點[5]。其分布面積占云南省林地面積的11%，擁有1×108m3的蓄積量[6～7]，在區(qū)域林業(yè)發(fā)展中占有舉足輕重的地位。

本課題組進行過思茅松DNA提取、引物篩選、RAPD-PCR體系建立、85個無性系的遺傳多樣性、7個居群的遺傳關(guān)系分析等研究[8]。本文在此基礎(chǔ)上進一步分析85個優(yōu)良無性系的遺傳關(guān)系，建立各無性系的指紋圖譜。通過遺傳多樣性、遺傳距離以及UPGMA聚類等的計算和分析，闡明各無性系在分子水平上的遺傳多樣性和遺傳變異情況，探討各無性系遺傳關(guān)系，為進一步的雜交提供依據(jù)。并通過對精英無性系指紋圖譜特異標記的分析，探討區(qū)分精英無性系的特異標記，以期從分子水平上對各精英無性系進行鑒別及早期選擇，為今后的良種選育提供分子學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

試驗材料采自云南省西雙版納自治州普文林場內(nèi)的思茅松優(yōu)樹匯集區(qū)[8]。85個思茅松無性系中包含有33個精英無性系，它們是通過半同胞子代測定，根據(jù)國家標準GB10013 88評選出的精英家系的母株[9]。這85個優(yōu)良無性系分別來自7個天然居群，它們分別是景東者后、墨江通關(guān)永馬、思茅蔓歇壩和思茅木乃河、景谷碧安、普洱一工段、普洱二工段。居群編號、各居群對應(yīng)無性系號、居群所在地以及無性系數(shù)量見表1。

1.2方法

DNA提取、RAPD-PCR擴增、引物篩選以及擴增結(jié)果電泳等采用的方法可詳見論文[8]，具體為采用Solarbio 試劑盒提取思茅松基因組DNA后，通過初篩和復篩，從120條引物中篩選出穩(wěn)定性強、多態(tài)性高的引物用于所有樣品的RAPD-PCR擴增，用篩選出的引物在最佳反應(yīng)體系和熱反應(yīng)程序下對所有無性系樣本進行RAPD-PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，照相，記錄結(jié)果。

本文在前文的基礎(chǔ)上用POPGENE32和MEGA2對85個無性系的遺傳關(guān)系進行聚類，并采用相關(guān)分析的方法探尋33個精英無性系的特異標記。通過對精英無性系指紋圖譜的比較，尋找能夠?qū)⒉糠志o性系和其它無性系區(qū)分開的的特異標記，引物及其特異標記位點的分析為優(yōu)良無性系的分子標記鑒別提供依據(jù)。

表1　85個優(yōu)良無性系及來源

相關(guān)分析的具體方法為：將85個無性系中的精英無性系記為“1”，其它無性系記為“0”，然后用軟件將該“0、1”數(shù)列與85個無性系每一個引物下的每一個位點的“0、1”數(shù)列分別進行相關(guān)分析，探尋與精英無性系相關(guān)的標記。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)的計算分析及作圖采用Excel 2003，相關(guān)數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析采用SPSS 19.0進行。

2　結(jié)果與分析

2.185個思茅松無性系的遺傳關(guān)系

用POPGENE32軟件對由85個無性系樣本的所有條帶的“0、1”矩陣進行分析，得到樣本間的遺傳距離I和Nei’s遺傳一致度D。結(jié)果顯示這85個無性系之間的遺傳距離范圍是0.051 3～0.679 9。其中遺傳距離最近的是景谷碧安居群的第6號和第7號無性系，遺傳距離最遠的是思茅曼歇壩居群的第16號無性系和思茅木乃河居群的第9號無性系。

基于遺傳距離I繪制聚類圖(見圖1)。從圖1中可以看出各無性系之間的遺傳關(guān)系。結(jié)果顯示，在遺傳距離約0.59以上，85個無性系大致可分為3個類群，其中類群Ⅰ主要由來自居群4、居群5和居群6的無性系組成；類群Ⅱ主要由來自居群7的無性系組成；類群Ⅲ在遺傳距離約0.56以上，又可分為3個亞類群，其中亞類群Ⅲ-A主要由來自居群2和居群4的無性系組成，Ⅲ-B主要由來自居群1和居群2的無性系組成，Ⅲ-C主要由來自居群1、居群2、居群4、居群5和居群7的無性系組成。

圖185個無性系的RAPD標記的聚類分析樹狀圖

Fig.1Dendrogram of RAPD markers of 85 clones

2.2關(guān)于精英無性系的特異標記

2.2.1相關(guān)分析

用SPSS軟件進行相關(guān)分析后共發(fā)現(xiàn)21個相關(guān)顯著性水平小于0.05的位點(見表2)。表2表明僅21個位點與是否為精英無性系存在相關(guān)關(guān)系，但是這21個位點對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)的最大絕對值僅0.387，眾所周知，相關(guān)系數(shù)的絕對值在0.3～0.5之間僅屬于低度相關(guān)，因此本次試驗所得的標記都難以有效區(qū)分全部精英無性系。

表2　基于0.05顯著性水平的相關(guān)分析

2.2.2部分區(qū)分的特異標記

在對所有的思茅松無性系指紋圖譜仔細地對比研究后發(fā)現(xiàn)2個反向標記，即有條帶為其它無性系，無條帶為某些精英無性系。它們分別是在復性溫度37℃和實驗所選的最佳反應(yīng)體系條件下(20μL體系：20～60ngDNA模板1.0uL，10μM引物1.0μL，2×Taq PCR MasterMix 10μL，無菌ddH2O 8.0μL)，利用引物B12(CCTTGACGCA)能夠?qū)⒕o性系1-5、1-6、1-8和1-9與其它無性系區(qū)分開；而利用引物F09(CCAAGCTTCC)能夠?qū)⒕o性系5-9、6-2、6-3和6-4與其它無性系區(qū)分開。具體的特異標記見表3和圖2和圖3(“1”表示有條帶，“0”表示無條帶)。

表3　精英無性系的特異標記

圖2　基于引物B12的特異標記

圖3　基于引物F09的特異標記

3　結(jié)論與討論

3.1遺傳關(guān)系可為進一步的雜交提供依據(jù)

由圖1可知，大多數(shù)來自相同居群的無性系聚在了一起，這是因為同一居群內(nèi)的思茅松由于空間距離較近，因此其基因交流也較為頻繁，所以這些無性系具有較小的遺傳差異，親緣關(guān)系較近。

但是也有少部分來自不同居群的無性系聚在了一起，這表明不同居群的無性系也存在親緣關(guān)系較近的情況，這可能與各無性系所在的天然居群之間存在一定程度的基因交流有關(guān)。通過地圖查詢可知，本次研究的7個居群均位于普洱市，且兩個相鄰居群間的直線距離最多不超過100km，考慮到思茅松的繁育系統(tǒng)特點，如風媒傳粉距離較遠，種子的可食用性，其散布可依賴動物或人類的活動，因此相隔一定距離的不同居群間存在一定程度的基因交流。其中，居群1和7中的無性系較多地聚在了一起，因此可以推測，居群1和7之間基因交流相對較頻繁，而從空間距離來看，這兩個居群所在行政區(qū)的空間直線距離也不超過20km。另外雖然居群3和空間7,居群1和6均地處同一行政區(qū)，但是它們遠不如居群1和7聚在一起的無性系多。這可能是由居群間的空間障礙造成的，如山川河流公路等在一定程度上阻礙了兩個居群間的基因交流。

由圖1可以看出各無性系之間的遺傳關(guān)系，并將85個無性系分為3個類群。依據(jù)此關(guān)系可以為育種時雜交親本的選配提供參考。例如，當根據(jù)需要選擇無性系6-9作為雜交的父本材料時，根據(jù)遠交優(yōu)勢的原理[10]，在選擇與之雜交的母本時，就應(yīng)該選擇與無性系6-9遺傳距離盡可能遠的無性系，即類群Ⅲ內(nèi)的各無性系，這樣雜交之后得到優(yōu)秀子代的可能性將會更大。

3.2精英無性系特異標記研究將為其分子鑒別提

供依據(jù)

常規(guī)的選育技術(shù)在林業(yè)研究和生產(chǎn)中周期較長、成本較高，因此由于能夠縮短選育周期、降低選育成本、提高選育效率，分子標記輔助選擇的應(yīng)用越來越廣泛[11]。RAPD標記技術(shù)因其操作簡便、反應(yīng)迅速、成本低和DNA用量少等優(yōu)點在動植物和微生物的遺傳多樣性檢測、品種鑒定、基因定位、構(gòu)建基因指紋圖譜、親緣關(guān)系分析和系統(tǒng)進化等方面被廣泛應(yīng)用[12～13]。應(yīng)用時主要是利用多個不同引物的RAPD-PCR反應(yīng)來尋找鑒別良種的特異性條帶，即特異標記或特異片段。例如張海霞等2006年發(fā)現(xiàn)了與黃瓜抗枯萎病相關(guān)的RAPD特異片段為S49-300，其引物堿基序列為CTCTGGAGAC，重組率為12.5%[14]，此外其它文獻也都發(fā)現(xiàn)了可以進行良種鑒別的特異片段[15～20]。

本研究未發(fā)現(xiàn)較為理想的能夠區(qū)分精英無性系的特異標記。但是用引物B12(CCTTGACGCA)對樣本進行RAPD-PCR反應(yīng)，若結(jié)果在400bp處有條帶則表明樣本為普通無性系，若無條帶，則表明樣本為精英無性系1-5、1-6、1-8或1-9中的1個；用引物F09(CCAAGCTTCC)對樣本進行RAPD-PCR反應(yīng)，若結(jié)果在750bp處有條帶則表明樣本為普通無性系，若無條帶，則表明樣本為精英無性系5-9、6-2、6-3或6-4中的1個。這可以為精英無性系的鑒定和早期選擇提供一些分子水平的借鑒。而理想的特異標記還有待進一步通過更多的RAPD引物篩選，其它分子標記手段或基因測序等方法來進行專門的研究。

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Genetic Analysis of Superior Clones and Specific Marker of Elite Clones of Pinus kesiya var.langbianensis

ZHU Yun-feng1,CHEN Shao-yun1,2,HAO Jia-bo1,2,WU Tao1,2

(1.Yunnan Academy of Forestry,Kunming Yunnan 650201,P.R.China;2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants;Yunnan Laboratory for Conservation of Rare,Endangered & Endemic Forest Plants,Public Key Laboratory of the State Forestry Administration,Kunming Yunnan 650201,P.R.China)

By collecting 85Pinuskesiyavar.langbianensisclones as materials,and using RAPD markers as method,the genetic distance was analyzed,and UPGMA were clustered in order to discover their genetic relationship and provide theoretical basis for diversity evaluation of hybrids and the breeding populations;The specific markers of 33 elite clones were also revealed for providing basis for molecular identification of elite clones.The results showed the 85 clones could be divided into 3 groups and 2 specific markers could be used to differentiate some of the elite clones.

Pinuskesiyavar.langbianensis;superior clones; genetic diversity;specific marker;RAPD;UPGMA

2015-09-25

國家發(fā)改委生物育種高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化專項“思茅松用材林良種高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范與研究”項目資助的重點實驗室開放項目“思茅松用材林優(yōu)良無性系分子遺傳分析”。

朱云鳳(1982-)，女，助理工程師，碩士，主要從事植物學和遺傳育種方面的研究。E-mail: kji-888@163.com

簡介：陳少瑜(1968-)，女，研究員，博士，主要從事樹木生理、林木遺傳研究。E-mail: sherry9872@163.com

S 791.259

A

1672-8246(2016)04-0141-06

doi:10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.04.024