趙 黎， 朱萌華， 金 娟， 龔建光， 李一文， 何 強(qiáng)

(浙江省人民醫(yī)院腎臟病科，浙江杭州310014)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

腎活檢冰凍切片不同儲存條件對免疫熒光結(jié)果的影響*

趙 黎， 朱萌華， 金 娟， 龔建光， 李一文， 何 強(qiáng)△

(浙江省人民醫(yī)院腎臟病科，浙江杭州310014)

目的:探討腎活檢組織冰凍切片儲存溫度對免疫熒光結(jié)果的影響。方法:選擇2015年1月～2015年6月浙江省人民醫(yī)院腎臟病科腎臟活檢標(biāo)本100例，將同一腎穿組織同時(shí)切兩套切片分別儲存于－70℃低溫冰箱和－12℃冷凍切片機(jī)內(nèi)，其中儲存于－70℃低溫冰箱的切片作為實(shí)驗(yàn)組，儲存于－12℃冷凍切片機(jī)內(nèi)的切片作為對照組，次日用直接免疫熒光法檢測免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)、補(bǔ)體(C3、C4和C1q)及纖維蛋白原，間接免疫熒光法檢測Ⅳ型膠原a3和a5鏈，熒光顯微鏡下觀察定性及半定量結(jié)果。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組3+～4+IgG 16例，對應(yīng)的對照組IgG均為1+～2+，陽性強(qiáng)度明顯弱于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組3+～4+ a3 99例，對照組1+～2+a3 92例，陰性8例;實(shí)驗(yàn)組3+～4+a5 99例，對照組1+～2+a5 92例，陰性8例，對照組陽性強(qiáng)度減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組4+IgA 15例，3+IgA 19例，3+IgM 15例，2+IgM 11例，4+C3 13例，3+C3 12例，相對應(yīng)的對照組陽性強(qiáng)度沒有明顯減弱，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)論:腎活檢冰凍切片免疫熒光結(jié)果受切片儲存溫度影響大，其中對IgG和Ⅳ型膠原免疫熒光陽性強(qiáng)度影響更大，建議腎臟活檢組織冰凍切片置于－70℃低溫冰箱儲存。

儲存溫度;腎臟活檢;免疫熒光;冰凍切片

免疫熒光技術(shù)對腎臟疾病的診斷及其分類具有極其重要的作用，在腎活檢病理診斷中的地位是其它組織化學(xué)、電子顯微鏡檢查等無法替代的。應(yīng)用冰凍切片進(jìn)行免疫熒光檢查，被認(rèn)為是腎活檢免疫病理檢查的重要方法［1-2］。本研究收集我科2015年1月～2015年6月腎臟活檢標(biāo)本100例，行直接免疫熒光法檢測免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)、補(bǔ)體(C3、C4和C1q)和纖維蛋白原，間接免疫熒光法檢測Ⅳ型膠原a3和a5鏈，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料和方法

1 一般材料

浙江省人民醫(yī)院腎臟病科腎臟活檢組織100例，同一組織恒溫冰凍切片同時(shí)切兩套片，4 μm厚，分別儲存于－70℃低溫冰箱和－12℃冷凍切片機(jī)內(nèi)備用。

2 試劑

直接法兔抗人熒光抗體IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q和纖維蛋白原，間接法I抗單克隆鼠抗人Ⅳ 型膠原a3抗體和a5抗體(Eurodiagnostica);II抗FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(北京中杉公司)。0.01 mol/L(pH 7.2～7.4)PBS緩沖液(北京中杉公司);甘油(浙江惠康藥業(yè)公司)。

3 儀器

CM3050冷凍切片機(jī)、DM2500熒光顯微鏡及數(shù)碼攝像系統(tǒng)(Leica)。

4 免疫熒光步驟

4.1 直接法檢測IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q和纖維蛋白原 實(shí)驗(yàn)組冰凍切片－70℃低溫冰箱儲存，對照組冰凍切片－12℃冷凍切片機(jī)儲存次日取出，在室溫下風(fēng)干;PBS沖洗3 min 2次;滴加兔抗人的熒光抗體 IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q和纖維蛋白原(1∶40稀釋);37℃水浴箱孵育60 min;PBS沖洗3 min 2次;甘油封片;熒光顯微鏡下觀察。

4.2 間接法檢測Ⅳ型膠原 切片分組處理后滴加單克隆鼠抗人Ⅳ型膠原a3抗體(1∶30)，檢測a5鏈時(shí)先滴加尿素處理10 min，PBS沖洗后再滴加a5抗體(1∶40);37℃水浴箱孵育120 min;PBS沖洗3 min 2 次;滴加 II抗 FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG抗體(1∶50);37℃水浴箱孵育30 min;PBS沖洗3 min 2 次;甘油封片;熒光顯微鏡下觀察。

5 結(jié)果判定

熒光顯微鏡下觀察腎組織熒光強(qiáng)度。觀察每張切片的有效腎小球數(shù)，以及IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q、纖維蛋白原、a3和a5熒光抗體的沉積部位，即腎小球的毛細(xì)血管壁、系膜區(qū)、腎小囊基底膜、間質(zhì)血管壁及間質(zhì)細(xì)胞等;觀察熒光抗體沉積的特點(diǎn)并根據(jù)視野內(nèi)熒光的強(qiáng)度進(jìn)行半定量評分:低倍鏡下未見熒光、高倍鏡下似可見熒光為陰性(－);低倍鏡下似可見熒光，高倍鏡下可見熒光為弱陽性(+);低倍鏡下明顯可見熒光，高倍鏡下清晰可見熒光為陽性(++);低倍鏡下清晰可見熒光，高倍鏡下熒光耀眼為較強(qiáng)陽性(+++);低倍鏡下熒光耀眼，高倍鏡下熒光刺眼為強(qiáng)陽性(++++)［3］。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

等級資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

腎臟活檢標(biāo)本共100例，其中實(shí)驗(yàn)組3+～4+ IgG 16例，對應(yīng)的對照組IgG均為1+～2+，陽性強(qiáng)度明顯弱于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Expression of IgG (directimmunofluorescence，×400).A:－70℃ condition;B:－12℃ condition.圖1 IgG實(shí)驗(yàn)組和對照組結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組3+～4+a3 99例，對照組1+～2+a3 92例，陰性8例，見圖2。

Figure 2.Expression of type IV collagen a3 chain(indirect immunofluorescence，×400).A: －70℃ condition; B:－12℃ condition.圖2 a3實(shí)驗(yàn)組和對照組結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組3+～4+a5 99例，對照組1+～2+a5 92例，陰性8例，對照組陽性強(qiáng)度減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)，見圖3。

實(shí)驗(yàn)組4+IgA 15例，3+IgA 19例，3+IgA 15例，2+IgA 11例，4+C3 13例，3+C3 12例，對照組陽性強(qiáng)度無明顯變化，見表1。

C4、C1q和纖維蛋白原兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

Figure 3.Expression of type IV collagen a5 chain(indirect immunofluorescence，×400).A: －70℃ condition; B:－12℃ condition.圖3 a5實(shí)驗(yàn)組和對照組結(jié)果

討論

腎穿刺活檢組織冰凍切片免疫熒光染色特異性強(qiáng)、敏感性高，染色步驟簡單，節(jié)省時(shí)間，定位準(zhǔn)確，強(qiáng)度易于判讀，是一種最簡便、快速的方法［1］，在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。但是，熒光染色結(jié)果受到多種因素的影響，如組織離體時(shí)間、切片保存溫度、切片保存時(shí)間、熒光抗體效價(jià)等［4-8］，其中抗原的保存是否完整直接影響免疫熒光結(jié)果，而保存溫度成為關(guān)鍵，尤其是腎活檢標(biāo)本體積較小，受保存溫度影響更大。

表1 腎活檢冰凍切片不同儲存條件對免疫熒光結(jié)果影響的比較Table 1.Comparison of the effects of different storage conditions on the immune fluorescence results in frozen sections of renal biopsy

本實(shí)驗(yàn)100例腎活檢標(biāo)本中，儲存于－12℃冷凍切片機(jī)內(nèi)的對照組冰凍切片次日染色的熒光結(jié)果顯示16例IgG陽性程度均減弱，99例Ⅳ型膠原a3鏈和a5鏈陽性程度也均減弱，證實(shí)不同儲存溫度對免疫熒光結(jié)果影響明顯，可能的原因?yàn)閮Υ嬗冢?2℃冷凍切片機(jī)內(nèi)的對照組冰凍切片由于受到冷凍切片機(jī)每天自動除霜程序的進(jìn)行導(dǎo)致切片機(jī)內(nèi)的溫度上升，達(dá)不到－12℃的儲存條件，因此導(dǎo)致冰凍切片抗原的丟失，以往我們的經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在冷凍切片機(jī)內(nèi)保存的切片出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，也提示了該可能原因，因此，不建議將冰凍切片保存在冷凍切片機(jī)里過夜或更久時(shí)間，而應(yīng)該將切片保存于低溫冰箱內(nèi)。既往研究表明，冰凍切片要求腎穿刺后數(shù)小時(shí)內(nèi)即完成免疫熒光染色檢測，若時(shí)間過長，高溫可能導(dǎo)致腎組織自溶影響結(jié)果判斷［9］。因此，所取標(biāo)本應(yīng)于當(dāng)日或次日切片，若當(dāng)日不切片，應(yīng)置于－70℃的冰箱或液氮罐內(nèi)保存［10］，當(dāng)日切好的片子也應(yīng)及時(shí)置于－70℃的冰箱保存。本次研究進(jìn)一步表明儲存于－12℃冷凍切片機(jī)內(nèi)的冰凍切片導(dǎo)致抗原丟失，影響免疫熒光結(jié)果，建議置于－70℃低溫冰箱儲存，以保持抗原活性，防止抗原移位或丟失。

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(責(zé)任編輯:林白霜，羅 森)

Effect of different storage temperatures on immunofluorescence results in frozen sections of kidney biopsies

ZHAO Li，ZHU Meng-hua，JIN Juan，GONG Jian-guang，LI Yi-wen，HE Qiang

(Department of Nephrology，Zhejiang Provincial People’s Hospital，Hangzhou 310014，China.E-mail:strong_he@163.com)

AIM:To investigate the effect of storage temperature in renal biopsy tissue frozen section on immunofluorescence results.METHODS:One hundred renal biopsy samples of Zhejiang Province People’s Hospital from January to June，2015 were enrolled.Two sets of cutting slices were stored in－70℃ low temperature refrigerator as experimental group and in－12℃ freezing cryostat as control group.The immunoglobulins(IgG，IgA and IgM)and complements(C3，C4 and C1q)as well as fibrinogen were detected with direct immunofluorescence in the next day.The typeⅣcollagen a3 and a5 chains were also detected by indirect immunofluorescence，and the qualitative and semi-quantitative results were observed under the fluorescence microscope.RESULTS:There were 16 cases of 3+～4+IgG in the experimental group，while the corresponding IgG was all 1+～2+in control group，significantly weaker than that in experimental group.There were 99 cases of 3+～4+a3 and 3+～4+a5 in experimental group，white there were 92 cases of 1+ ～2+a3/a5 and 8 cases negative in control group.The positive intensity was decreased in control group with statistical difference between the 2 groups(P＜0.05).There were 15 cases of 4+IgA，19 cases of 3+IgA，15 cases of 3+IgM，11 cases of 2+IgM，13 cases of 4+C3，and 12 cases of 3+C3 in experimental group.The control group were similar to the results of experimental group，and no difference between the 2 groups was observed.CONCLUSION:The immunofluorescence results of renal biopsy frozen sections are highly affected by the section storage temperature，which has greater influence on the immunofluorescence positive intensity of IgG and typeⅣcollagen.The renal biopsy frozen section should be stored in－70℃ low temperature refrigerator.

Storage temperature;Renal biopsy;Immunofluorescence;Frozen section

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.032

1000-4718(2016)07-1342-03

2016-01-08

2016-04-02

省科技廳重大專項(xiàng)(No.2014C03047-2);省部共建項(xiàng)目(No.WKJ2013-2-002)

△Tel:0571-85893689;E-mail:strong_he@163.com