張曉暉，蘇思思，王文雅，袁其朋，李　強(qiáng)

（1北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029；2清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京 100084）

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性激素三孢酸在類胡蘿卜素生產(chǎn)菌三孢布拉氏霉中的合成代謝研究進(jìn)展

張曉暉1，蘇思思1，王文雅1，袁其朋1，李強(qiáng)2

（1北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029；2清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京 100084）

類胡蘿卜素是重要的精細(xì)化學(xué)品，三孢布拉氏霉是發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素的常用菌種。近年來研究者對(duì)影響三孢布拉氏霉類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響因素做了大量的研究，結(jié)果顯示三孢酸是最重要的影響因子之一。本文根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，從發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素的研究現(xiàn)狀、三孢酸類化合物的結(jié)構(gòu)及其生理功能、三孢酸合成途徑研究及三孢酸合成途徑中的分子機(jī)制等幾個(gè)方面做了綜述報(bào)告。

三孢酸；三孢布拉氏霉；類胡蘿卜素；毛霉目真菌；β-胡蘿卜素

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151591

三孢酸是1，1，3-三甲基-2-（3-甲基辛基）環(huán)己烷的不飽和氧化衍生物，是二萜類或類胡蘿卜素降解時(shí)產(chǎn)生的倍半萜類物質(zhì)，為三孢布拉氏霉、布拉克須霉（Phycomyces blakesleanus）和高大毛霉（Mucor mucedo）等毛霉目真菌的性激素［4］，具有誘導(dǎo)菌體分化、刺激孢子形成及調(diào)控類胡蘿卜素合成等生理功能［5］。三孢布拉氏霉產(chǎn)三孢酸的能力遠(yuǎn)大于其他毛霉目真菌，因此成為研究三孢酸代謝的模式菌株。在發(fā)酵開始或中途加入純化或未純化的外源性三孢酸，可以顯著提高類胡蘿卜素產(chǎn)量［6］，作為一種發(fā)酵促進(jìn)劑，三孢酸分離提取和生物合成的研究引起了廣泛關(guān)注［7］。三孢酸的生物合成是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，涉及到多種代謝產(chǎn)物并且伴隨有菌體生理和形態(tài)上的變化，其代謝途徑的探明對(duì)提高類胡蘿卜素產(chǎn)量有重要意義。目前三孢酸代謝途徑的研究主要集中在國(guó)外，國(guó)內(nèi)對(duì)這一領(lǐng)域的研究報(bào)道相對(duì)較少，本文總結(jié)分析了近幾年的相關(guān)研究，著重報(bào)道了三孢酸代謝途徑的最新研究進(jìn)展。

1　三孢布拉氏霉發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素的研究概況

1.1產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物種類

微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)天然類胡蘿卜素的發(fā)展方向，目前在這方面研究最多的色素有β-胡蘿卜素（β-carotene）、番茄紅素（lycopene）和蝦青素（astaxanthin）等?？衫玫奈⑸锓N類包括細(xì)菌、藻類、真菌和酵母菌，其中真菌的生產(chǎn)代表菌種是三孢布拉氏霉［8］和布拉克須霉［9］，細(xì)菌有紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）［10］，酵母有深紅酵母（Rhodotorula glutinis）［11］，微藻類有杜氏藻類（Dunaliella）［12］。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，一些本身不產(chǎn)色素的微生物，如大腸桿菌（Escherichia coli）［13］和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）［14］等，通過基因工程改造后也可用于生產(chǎn)類胡蘿卜素。關(guān)于產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物種類及相關(guān)色素產(chǎn)量的研究，Chandi等［8］和Barredo［15］的綜述中已做了較為詳細(xì)的歸納和總結(jié)，本文不再詳述。

用于生產(chǎn)類胡蘿卜素的4類微生物（細(xì)菌、藻類、真菌和酵母菌）在生產(chǎn)中各有利弊，如在工業(yè)生產(chǎn)中的提取色素階段，酵母菌破壁難度要大于其他3種微生物［16］；而杜氏藻類的發(fā)酵時(shí)間偏長(zhǎng)（10 d以上）且在發(fā)酵過程中需要嚴(yán)格控制鹽度和光照兩個(gè)條件［12］；利用細(xì)菌生產(chǎn)類胡蘿卜素需要解決遺傳穩(wěn)定性的問題；而三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵過程相對(duì)復(fù)雜，需要（+）/（-）菌分別培養(yǎng)然后再混合色素才可以大量積累，但是三孢布拉氏霉具有生長(zhǎng)迅速、生物量大、類胡蘿卜素產(chǎn)量高（4～5 g·L-1）等明顯優(yōu)勢(shì)［8］，因而可以作為工業(yè)菌種且已應(yīng)用于類胡蘿卜素的規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)中。

1.2影響三孢布拉氏霉類胡蘿卜素產(chǎn)量的因素

圖1　三孢酸對(duì)類胡蘿卜素和麥角固醇合成的調(diào)控Fig.1　Scheme of regulation of carotenoid and ergosterol synthesis

三孢布拉氏霉是工業(yè)上生產(chǎn)類胡蘿卜素的主要菌種，自1960年以來，研究者陸續(xù)對(duì)影響三孢布拉氏霉類胡蘿卜素產(chǎn)量的因素開展了廣泛研究，在Lampila等［17］和Bhosale［18］的綜述中已對(duì)這些因素做了較為詳細(xì)的總結(jié)。雖然影響三孢布拉氏霉類胡蘿卜素產(chǎn)量的因素眾多，但最終可歸納為兩大類：環(huán)境因素（包括光照、氧氣、pH、溫度等）和添加物（包括金屬鹽、三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物、抗氧化劑、氧載體、表面活性劑和性激素三孢酸等）［18-23］。研究和實(shí)踐表明，在優(yōu)化好的培養(yǎng)基中添加一些化合物對(duì)于促進(jìn)發(fā)酵和提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量具有事半功倍的效果。迄今研究者還在不斷探索和合成新的化合添加物，且發(fā)現(xiàn)在眾多化合物中，三孢酸對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量影響最大（可使類胡蘿卜產(chǎn)量增加349%）［19］。目前對(duì)三孢酸能大幅刺激類胡蘿卜素合成的詳細(xì)機(jī)制尚不十分清楚，Thomas等［24］的研究表明三孢酸可能是通過影響類胡蘿卜素代謝途徑中的一個(gè)或幾個(gè)酶的合成來發(fā)揮作用。Sun等［25-27］利用代謝組、蛋白組和實(shí)時(shí)定量PCR等技術(shù)，綜合分析了三孢酸對(duì)三孢布拉氏霉菌轉(zhuǎn)錄、翻譯和代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，發(fā)現(xiàn)三孢酸對(duì)于霉菌的影響是全面的（對(duì)糖酵解、三羧酸循環(huán)支路、脂肪酸合成等多種代謝途徑均有影響），而非只影響類胡蘿卜素合成代謝；在類胡蘿卜素合成途徑中，三孢酸對(duì)hmgR的轉(zhuǎn)錄基本沒有影響，卻增強(qiáng)了ipi、carG、carRA和carB的轉(zhuǎn)錄（增強(qiáng)9～33 倍），而isoA和erg9轉(zhuǎn)錄水平的變化依賴于三孢酸的添加量（圖1），這些結(jié)果表明三孢酸可能是通過刺激相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控三孢布拉氏霉類胡蘿卜素的合成。

2　三孢酸類化合物（trisporoid）的結(jié)構(gòu)及其功能

β-胡蘿卜素裂解產(chǎn)生3個(gè)片段化合物：C18、C15和C7化合物［參見圖4（a）］，其中三孢酸類化合物（trisporoid）屬于C18家族，含有18～19個(gè)碳原子，包括一個(gè)14個(gè)碳原子的主碳鏈［28］。三孢酸及其代謝途徑中的所有中間產(chǎn)物總稱為三孢酸類化合物，從分子結(jié)構(gòu)來看，三孢酸類化合物中包含有醇類、酮類、酸類及酯類等物質(zhì)，目前能夠分離得到的主要有三孢酮（trisporin）、三孢醇（trisporol）、三孢醇甲酯（methyltrisporate）、三孢酸（trisporic acid）、4-二氫三孢醇甲酯（4-dihydromethyltrisporate）和4-二氫三孢酸（4-dihydrotrisporic acid）等，其中4-二氫三孢酸是一個(gè)新分離到的物質(zhì)，該物質(zhì)的來源、代謝流向及生理作用均未有研究。這些物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，遵循圖2中的結(jié)構(gòu)通式，當(dāng)C1、C4位置上的取代基（分別為X1和X4）不同時(shí)，物質(zhì)的種類不同，具體見表1［29］。后來發(fā)現(xiàn)，每種物質(zhì)又有多種衍生物，基于目前分離得到的三孢酸類化合物的分子結(jié)構(gòu)，研究者認(rèn)為衍生物可分為A、B、C、D、E 5種，目前分離得到的三孢酮的衍生物有B、C兩種，三孢醇的有B、C兩種，4-二氫三孢醇甲酯的也有B、C兩種，三孢醇甲酯的有B、C、E 3種，三孢酸的有A、B、C、D、E 5種，而4-二氫三孢酸只分離到B型衍生物［30-32］。衍生物屬于哪種類型由C2、C3和C13位置上的官能團(tuán)（Y1、Y2和Y3）決定，具體見表2。

表1　R三孢酸類化合物的結(jié)構(gòu)Table 1 Trisporoid structure

圖2　三孢酸類化合物的結(jié)構(gòu)通式Fig.2　General structure of trisporoid

表2　R三孢酸類化合物的衍生物的結(jié)構(gòu)Table 2　Structure of trisporoid derivatives

雖然三孢酸類化合物的結(jié)構(gòu)相似，但功能卻不盡相同，生理活性也大小不一。Schachtschabel等［30］研究發(fā)現(xiàn)，三孢酸B、C能夠誘導(dǎo)高大毛霉（+）/（-）菌產(chǎn)生孢子，三孢醇甲酯和4-二氫三孢醇甲酯只對(duì)（-）菌有活性，而三孢酮B、C只對(duì)高大毛霉（+）菌起作用。Yamuna等［31］研究了三孢酸類化合物對(duì)β-胡蘿卜素合成的影響，結(jié)果顯示影響的大小隨著真菌種屬、生長(zhǎng)階段的不同而不同，且（-）菌對(duì)于三孢酸類化合物的刺激比（+）菌敏感；同時(shí)在其研究中還發(fā)現(xiàn)，三孢酸B是高大毛霉類胡蘿卜素合成的最佳刺激劑，而對(duì)三孢布拉氏霉來說最佳刺激劑為4-二氫三孢酮C；三孢酮B、三孢酮C和D'orenone對(duì)高大毛霉及三孢布拉氏霉β-胡蘿卜素的合成的影響都很小；4-二氫三孢酮C和4-二氫三孢醇甲酯C只對(duì)三孢布拉氏霉（-）菌類胡蘿卜素的合成有刺激效果，而三孢酸C、三孢醇甲酯B對(duì)高大毛霉（-）菌的刺激效果比較大。細(xì)胞中三孢酸類化合物的各種衍生物的含量會(huì)隨著生理狀態(tài)、環(huán)境條件的改變而發(fā)生變化，但有一個(gè)大致的變化范圍，例如在三孢布拉氏霉中C、B、A 3種類型的衍生物含量變化范圍分別為55%～87%、12%～39%和16%左右，在真菌中D、E型衍生物的含量通常很少［32］。此外各種衍生物的生理活性大小也不同，一般認(rèn)為B類衍生物的活性要大于C類衍生物的活性，C類的活性又比A類的大，D、E的活性相對(duì)來說最小，這可能與它們?cè)隗w內(nèi)的含量多少有一定關(guān)系。

3　三孢酸的合成代謝途徑

三孢酸首次引起關(guān)注是作為一個(gè)代謝中間產(chǎn)物，可以極大刺激類胡蘿卜素的合成，隨后Gooday等［5］發(fā)現(xiàn)三孢酸還可以作為性激素誘導(dǎo)孢子形成。由于三孢酸的重要生理作用，研究者對(duì)三孢酸的代謝途徑進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的研究，其研究進(jìn)程大致可以分成兩個(gè)階段，第1個(gè)階段（1964～2000年）主要探究了三孢酸的合成機(jī)制［（+）/（-）菌協(xié)作合成機(jī)制］及提出了一個(gè)代謝途徑框架（圖3）；第2個(gè)階段（2000年至今）主要是對(duì)前一時(shí)期提出的代謝框架做了修正和補(bǔ)充（圖4），增補(bǔ)了一些新的三孢酸代謝中間產(chǎn)物，如β-apo-12′-carotenal和D'orenone等。

3.1三孢酸的發(fā)現(xiàn)及其代謝途徑的初步研究

1964年，Prieto等［33］在三孢布拉氏霉的混合培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了一系列能夠刺激β-胡蘿卜素合成的酸性化合物，稱作β-因子，后來命名為三孢酸。在隨后的1～2年相繼在其他真菌如布拉克須霉、高大毛霉等的混合培養(yǎng)基中也分離得到該物質(zhì)［34］。三孢酸只有在（+）/（-）菌混合培養(yǎng)時(shí)才可以大量合成，單獨(dú)培養(yǎng)的（+）/（-）菌幾乎不合成三孢酸，因?yàn)槿咚岬暮铣尚枰?）/（-）菌協(xié)作完成。之所以存在這種機(jī)制，是因?yàn)槿咚岷铣赏緩街械囊恍┟甘牵?）菌或者（-）菌所特有的，因而（+）/（-）菌會(huì)各自合成一些特有的前體物質(zhì)，然后通過物質(zhì)擴(kuò)散作用，使得這些特異性前體物在（+）/（-）菌之間得以交換，最終完成三孢酸的合成。

圖3　早期的三孢酸合成途徑Fig.3　TSA cooperative biosynthetic pathway at early stage

此外，這一時(shí)期另一個(gè)較大的研究成果就是三孢酸初始前體物質(zhì)的確定。研究表明三孢酸合成的初始前體物質(zhì)是β-胡蘿卜素，主要有以下3方面證據(jù)：第一，放射性同位素（14C）標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示，三孢酸主要來源于β-胡蘿卜素；第二，β-胡蘿卜素合成的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成三孢酸；第三，混合培養(yǎng)基中添加二苯胺（可以阻斷β-胡蘿卜素的合成）后，三孢布拉氏霉菌中的三孢酸合成受阻［34］。在證實(shí)β-胡蘿卜素為三孢酸合成的初始前體物質(zhì)后，關(guān)于β-胡蘿卜素的裂解方式也進(jìn)行了大量研究。這一時(shí)期一直認(rèn)為β-胡蘿卜素是在C15-C15′處對(duì)稱裂解，生成視黃醛（C20-retinal），視黃醛進(jìn)一步反應(yīng)生成β-C18-ketone（圖3），而后證實(shí)這一推測(cè)有誤［35］。

圖4　改進(jìn)后的三孢酸合成代謝途徑Fig.4　Modified cooperative biosynthetic pathway of TSANote： Cooperative biosynthetic pathway illustrates the production of trisporoids. Metabolic pathway in Fig.4（a） could occur in both （+） and （-） mating types while pathway in Fig.4（b） could reflect cooperative biosynthesis which need （+）/（-） mating types exchange intermediate metabolite. Dashed arrows in Fig.4 represent reactions that have not been studied clearly； ①②③④⑤⑥ represent reactions of enzymatic catalysis.

由于只有在（+）/（-）菌混合培養(yǎng)時(shí)才可以合成大量的三孢酸，而單獨(dú)培養(yǎng)的（+）菌或者（-）菌是否也可以合成三孢酸最初研究者不是很清楚。直到1973年，Sutter等［36］證實(shí)在無任何（-）菌因素的刺激下，單獨(dú)培養(yǎng)的（+）菌也可以合成0.1%（指占三孢布拉氏霉（+）/（-）菌混合培養(yǎng)5 d后產(chǎn)生的三孢酸的百分比）的三孢酸，而單獨(dú)培養(yǎng)的（-）菌幾乎不合成三孢酸（＜ 0.0001%）。但是相對(duì)（+）菌，（-）菌對(duì)三孢酸的刺激更加敏感，添加三孢酸后（-）菌類胡蘿卜素的產(chǎn)量是（+）菌的6倍；此外還發(fā)現(xiàn)在（+）/（-）菌混合培養(yǎng)時(shí)，如果（-）菌的接種量大，相應(yīng)的類胡蘿卜素產(chǎn)量也高，具體原因尚未研究清楚，可能是因?yàn)椋?）菌中一些相關(guān)的酶的活性更高［3］。

在這一時(shí)期，Sutter等［3，34，36］、Austin等［4］對(duì)三孢酸代謝途徑及其中間產(chǎn)物做了大量的研究，認(rèn)為三孢酸按照?qǐng)D3的路線合成，包含以下要點(diǎn)：① 三孢酸合成代謝途徑的初始物質(zhì)為β-胡蘿卜素，其在C15-C15'處對(duì)稱裂解生成視黃醛；② 在三孢酸代謝途徑中，（+）菌和（-）菌體內(nèi)都能合成的最后一個(gè)物質(zhì)是4-二氫三孢酮；③ 4-二氫三孢酮下游代謝的進(jìn)行需要（+）/（-）菌彼此交換特定的中間產(chǎn)物（如三孢酮、4-二氫三孢醇甲酯等），通過（+）/（-）菌協(xié)作完成三孢酸的合成。4-二氫三孢醇甲酯只能在（+）菌體內(nèi)合成，三孢酮只能在（-）菌體內(nèi)合成。（+）菌合成的4-二氫三孢醇甲酯需擴(kuò)散到（-）菌體內(nèi)進(jìn)而轉(zhuǎn)化成三孢醇甲酯，而（+）菌合成三孢醇的前體是來源于（-）菌的三孢酮［37-38］。

3.2三孢酸代謝途徑的完善和發(fā)展

前期的研究給出了三孢酸合成代謝途徑的基本框架（圖3），但是代謝途徑中的一些細(xì)節(jié)問題尚未研究清楚，例如β-胡蘿卜素的裂解方式、分離得到的部分化合物在代謝途徑中的具體定位等。2000年后，研究者利用同位素標(biāo)記法、質(zhì)譜分析法等對(duì)三孢酸合成代謝的細(xì)節(jié)進(jìn)行了深入研究，補(bǔ)充和完善了已有的合成代謝框架，改進(jìn)后的合成路線見圖4。

2002年，Gessler等［39］通過向β-胡蘿卜素的乳濁液（向溶解有β-胡蘿卜素的己烷液中滴加Tween-20制得）中添加破碎菌體提取物（從混合培養(yǎng)的三孢布拉氏霉菌菌絲中分離得到），32℃下反應(yīng)4 h后，對(duì)該反應(yīng)液進(jìn)行色譜和質(zhì)譜分析，得到兩種β-胡蘿卜素代謝產(chǎn)物，分別是異隱黃素（isocryptoxanthine）和D'orenone（圖4）。當(dāng)以視黃醛代替β-胡蘿卜素為底物進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)時(shí)，不能得到相關(guān)產(chǎn)物，這表明視黃醛很可能不是三孢酸代謝途徑的中間產(chǎn)物。將β-胡蘿卜素置于可產(chǎn)生超氧陰離子自由基的黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素更傾向于在分子式的一側(cè)斷鍵而非以往認(rèn)為的對(duì)稱裂解，這進(jìn)一步證明了視黃醛未參與三孢酸代謝。此外，Gessler認(rèn)為β-胡蘿卜素有兩種裂解途徑（圖4）：（1）β-胡蘿卜素的C4位羥基化形成異隱黃素，異隱黃素進(jìn)一步不對(duì)稱裂解生成三孢酸的前體；（2）另一種裂解途徑為β-胡蘿卜素先裂解生成D'orenone，D'orenone進(jìn)一步裂解而進(jìn)入三孢酸代謝途徑，后來發(fā)現(xiàn)在D'orenone之前還存在中間物質(zhì)β-apo-12′-carotenal。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在菌體內(nèi)主要進(jìn)行的是β-胡蘿卜素的氧化裂解反應(yīng)（生成D'orenone的反應(yīng)），羥基化反應(yīng)（形成異隱黃素的反應(yīng)）速率很?。?9］。在后來的研究中，相繼在（+）/（-）菌混合培養(yǎng)基中分離得到C18、C15和C7片段化合物［圖4（a）］，因此推測(cè)β-胡蘿卜素的斷鍵位置可能在C13-C14和C11′-C12′處，其中三孢酸及其合成中間代謝產(chǎn)物全部來源于C18化合物，目前有關(guān)C15和C7化合物的生理作用尚不清楚。

2008年，Doreen等［29］用同位素標(biāo)記法，對(duì)三孢酸的合成途徑進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，首次證明D'orenone是三孢酸合成的前體物質(zhì)。Doreen等使用重氫標(biāo)記三孢酸的前體并分別加入到單獨(dú)和混合培養(yǎng)的三孢布拉氏霉（+）/（-）菌培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)3、6、9、12、24、48 h后，對(duì)培養(yǎng)基中的代謝物成分及結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析研究。依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Doreen對(duì)原有的三孢酸合成途徑做了以下幾方面的修正（圖4）：（1）β-胡蘿卜素裂解后的第一個(gè)產(chǎn)物是D'orenone而非視黃醛，而后Yamuna等［31］證明第一個(gè)產(chǎn)物是β-apo-12'-carotenal；（2）（+）/（-）菌都能合成的最后一個(gè)三孢酸的前體是三孢醇，而非4-二氫三孢酮；（3）三孢醇氧化成三孢醇甲酯的反應(yīng)只能在（+）菌體內(nèi)進(jìn)行，而三孢醇甲酯皂化生成三孢酸的反應(yīng)在（+）/（-）菌體內(nèi)都可進(jìn)行，只是二者的反應(yīng)速率不同，（-）菌中的反應(yīng)速率顯著高于（+）菌；（4）在（+）/（-）菌的混合培養(yǎng)基內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)被重氫標(biāo)記的4-二氫三孢醇甲酯，因此推測(cè)該物質(zhì)可能沒有參與三孢酸的合成代謝；（5）三孢醇甲酯生成三孢酸的反應(yīng)不可逆；（6）對(duì)三孢酮生成三孢醇、三孢醇甲酯生成三孢酸的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究表明，（-）菌中這兩步反應(yīng)的反應(yīng)速率要明顯高于（+）菌。

Yamuna等［31］在高產(chǎn)β-胡蘿卜素的大腸桿菌中導(dǎo)入類胡蘿卜素氧化酶基因，研究β-胡蘿卜素在氧化酶作用下的裂解機(jī)制，通過分析大腸桿菌細(xì)胞提取物的成分，他們發(fā)現(xiàn)了新物質(zhì)β-apo-12′-carotenal（C25）并證明其為β-胡蘿卜素裂解的第一個(gè)產(chǎn)物；隨后，β-apo-12′-carotenal在C13-C14位置斷鍵，生成D'orenone和一個(gè)C7化合物［圖4（a）］。目前，對(duì)D'orenone生成下一物質(zhì)的反應(yīng)機(jī)制還不了解，推測(cè)有兩種可能［圖4（a）反應(yīng)③］：C11-C12位的雙鍵打開，D'orenone生成另一種酮（ketone）；或者碳環(huán)C4位羥基化形成4-hydroxy-β-C18-ketone，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成4-二氫三孢酮［29，40］。

盡管，Gessler等［39］、Doreen等［29］、Yamuna等［31］的研究豐富和發(fā)展了三孢酸的合成代謝途徑，但是仍有許多問題沒有解決，如4-二氫三孢醇甲酯的來源問題尚不清楚。開始研究者認(rèn)為4-二氫三孢醇甲酯是（+）菌的一個(gè)特異性產(chǎn)物，來源于4-二氫三孢酮（圖3）［38］。然而在Doreen的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向培養(yǎng)基中添加重氫標(biāo)記的三孢酸前體時(shí)，代謝產(chǎn)物4-二氫三孢醇甲酯中并不含有放射性標(biāo)記，此外還發(fā)現(xiàn)4-二氫三孢醇甲酯生成三孢酸的速率非常低，這些現(xiàn)象均表明4-二氫三孢醇甲酯幾乎不參與三孢酸的合成且可能不是β-胡蘿卜素的裂解產(chǎn)物［29］。4-二氫三孢醇甲酯可能由β-胡蘿卜素的氧化衍生物異隱黃素降解而來［圖4（b）］，β-胡蘿卜素的非酶催化氧化裂解結(jié)果以及超氧陰離子降低β-胡蘿卜素氧化酶活性的事實(shí)均為以上猜想提供了證據(jù)。因此，4-二氫三孢醇甲酯在三孢酸合成中到底起什么作用還需要進(jìn)一步的探究。

4　三孢酸生物合成途徑中相關(guān)基因的克隆及其分子調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

近年來，隨著研究的深入三孢酸合成代謝途徑得到不斷的豐富和完善，但是對(duì)該過程的分子調(diào)控機(jī)制的研究卻相對(duì)滯后，只對(duì)三孢酸合成途徑中少數(shù)幾個(gè)酶的基因進(jìn)行了克隆和功能探索。毛霉目真菌具有相似的三孢酸合成途徑，除三孢布拉氏霉外，目前對(duì)米根霉（Rhizopus oryzae）、高大毛霉和布拉克須霉中三孢酸的合成也有研究，發(fā)現(xiàn)相關(guān)酶的功能十分相似。目前，克隆得到的酶基因有β-胡蘿卜素氧化酶（β-carotene oxygenase）基因tsp3/tsp4、4-二氫三孢酮脫氫酶（4-dihydrotrisporin dehydrogenase）基因tsp2、4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶（4-dihydromethyltrisporate dehydrogenase）基因tsp1和AcaA酶基因acaA等，這些酶的基因及功能參見圖4（a）和表3。

β-胡蘿卜素氧化酶是一個(gè)保守酶，其功能在物種間的差異很小，催化β-胡蘿卜素在C11'-C12'處斷鍵，生成C25和C15兩個(gè)片段化合物，其中C25化合物（β-apo-12′-carotenal）進(jìn)入三孢酸合成途徑［圖4（a）］。最早發(fā)現(xiàn)的β-胡蘿卜素氧化酶來自三孢布拉氏霉菌，被命名為TSP3，但是發(fā)現(xiàn)存在多種β-胡蘿卜素氧化產(chǎn)物，因此推測(cè)應(yīng)該有多種β-胡蘿卜素氧化酶存在［31］。米根霉中β-胡蘿卜素氧化酶TSP4的發(fā)現(xiàn)，更確認(rèn)了這種推測(cè)［41］。目前對(duì)這兩種酶的結(jié)構(gòu)、活性、底物特異性以及催化產(chǎn)物的了解還很少，但是對(duì)其編碼基因tsp3和tsp4的轉(zhuǎn)錄及調(diào)控有一些研究。Anke等［41］的研究顯示，三孢布拉氏霉在三孢酸誘導(dǎo)的最初1 h內(nèi)，tsp3表達(dá)量迅速增加，比對(duì)照高出500倍，但1 h后，tsp3基因表達(dá)量開始逐漸減少，最終只保持一個(gè)低水平的表達(dá)。這說明三孢酸的合成過程存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，初期表現(xiàn)為正向反饋調(diào)節(jié)，后期則為負(fù)反饋調(diào)節(jié)，目前尚無參與這些過程的調(diào)控因子的報(bào)道。Sun等［26］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向三孢布拉氏霉（+）/（-）菌混合培養(yǎng)基中添加三孢酸時(shí)，tsp4的轉(zhuǎn)錄水平幾乎不發(fā)生改變，而tsp3的轉(zhuǎn)錄水平明顯上升；因此，推測(cè)TSP3的作用主要是催化三孢酸前體物質(zhì)的形成，觸發(fā)三孢酸合成過程；TSP4主要是在（+）/（-）菌接合的早期發(fā)揮作用，可能參與了（+）/（-）菌菌絲的相互識(shí)別。

AcaA也是一個(gè)氧化酶，催化三孢酸生物合成的第2步反應(yīng)，使得C25化合物在C13-C14位置斷鍵，生成D'orenone［圖4（a）］。Humberto等［40］發(fā)現(xiàn)須霉屬真菌的79747、77754、64508、76627和58172等5個(gè)基因可能是與類胡蘿卜素氧化裂解相關(guān)的基因，并證明在須霉屬真菌中79747號(hào)基因編碼β-胡蘿卜素氧化酶，且將其命名為carS；carS是與三孢布拉氏霉tsp3同源的基因，二者基因功能相似（翻譯產(chǎn)物都是β-胡蘿卜素氧化酶），只是在不同真菌種屬中的命名不同而已；77754號(hào)基因的編碼產(chǎn)物也是一個(gè)氧化酶，在β-胡蘿卜素氧化酶之后發(fā)揮作用，被稱作acaA。將含carS和acaA基因的載體分別導(dǎo)入產(chǎn)β-胡蘿卜素的大腸桿菌中來表達(dá)CarS和AcaA，發(fā)現(xiàn)只有CarS有活性，而AcaA完全沒有活性；但將carS和acaA先后放在一個(gè)操縱子中且由同一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控時(shí)，發(fā)現(xiàn)不僅CarS有活性，AcaA也有活性，由此推測(cè)AcaA在CarS之后發(fā)揮活性，因此acaA是三孢酸合成代謝途徑中的第2個(gè)活性基因。分離純化的酶蛋白AcaA可使類胡蘿卜素裂解產(chǎn)物C25、C27及C30等化合物進(jìn)一步降解，但不能降解C20和C22兩個(gè)片段化合物，說明C25化合物是AcaA最短的環(huán)化底物；同時(shí)AcaA不能降解β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素及蝦青素，這進(jìn)一步證明了AcaA是三孢酸代謝途徑中的第二個(gè)酶。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究發(fā)現(xiàn)acaA的轉(zhuǎn)錄不受（+）/（-）菌混合培養(yǎng)的影響，目前關(guān)于AcaA的結(jié)構(gòu)及調(diào)控方式均未有太多的研究報(bào)道［31］。

表3　R三孢酸代謝途徑中的酶Table 3　Enzymes in pathway of TSA biosynthesis

4-二氫三孢酮脫氫酶由基因tsp2編碼，分子雜交結(jié)果顯示，tsp2是一個(gè)單拷貝基因。4-二氫三孢酮脫氫酶是一個(gè)短鏈酶，含有一個(gè)NADP+輔因子，催化4-二氫三孢酮C4位的羥基氧化生成三孢酮，在（-）菌體內(nèi)具有較高的活性。Northern雜交分析顯示，tsp2在高大毛霉（+）菌的所有生長(zhǎng)階段都有轉(zhuǎn)錄，但是在高大毛霉（-）菌中，在生長(zhǎng)后期才開始轉(zhuǎn)錄。三孢酸的刺激會(huì)增加高大毛霉（-）菌4-二氫三孢酮脫氫酶的活性，但是tsp2的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有發(fā)生變化，由此說明4-二氫三孢酮脫氫酶酶活性的調(diào)控方式是翻譯后修飾，而非通過調(diào)控相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)酶活性。研究推測(cè)4-二氫三孢酮脫氫酶除了在三孢酸代謝中起催化氧化作用外，還有可能在（+）/（-）菌混合培養(yǎng)初期起識(shí)別彼此的作用［42-44］。

依賴NADP+的4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶是一個(gè)醛酮類還原酶，可以催化4-二氫三孢醇甲酯生成三孢醇甲酯。4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶的編碼基因?yàn)閠sp1，目前已經(jīng)克隆并表征了高大毛霉、灰綠犁頭霉（Absidia glauca）和三孢布拉氏霉（+）/（-）菌的tsp1基因，后來在布拉克須霉和雅致枝霉（Thamnidium elegans）中也相繼發(fā)現(xiàn)了該基因的存在［45］。高大毛霉（-）菌中的tsp1基因的編碼區(qū)長(zhǎng)度為2406～3445，內(nèi)含子的起始位置為2746，堿基數(shù)量為74bp；（+）菌的tsp1基因除了131和639位的胸腺嘧啶變?yōu)榘奏ぁ?46位胞嘧啶變成胸腺嘧啶外，其余部分與（-）菌的tsp1基因序列高度一致，（+）/（-）菌的tsp1基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)完全相同。tsp1的轉(zhuǎn)錄和翻譯均不受三孢酸的影響，但是三孢酸對(duì)4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶的活性影響較大，在沒有三孢酸刺激的情況下，高大毛霉（+）/（-）菌中的4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶幾乎沒有活性；其中（-）菌在添加三孢酸初期，4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶仍幾乎無活性，80 min后才開始表現(xiàn)出高的活性，這一現(xiàn)象說明4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶活性受到一些未知機(jī)制的調(diào)控［42，45］。

4-二氫三孢酮脫氫酶和4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶都是依賴NADP+的脫氫酶，但它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象有很大差異，二者的底物特異性都很低；4-二氫三孢醇甲酯脫氫酶含有一個(gè)TIM-桶裝結(jié)構(gòu)（TIM-barrel），4-二氫三孢酮脫氫酶含有一個(gè)羅斯曼折疊結(jié)構(gòu)（Rossman fold）；二者的相同之處是活性中心均含有酪氨酸和賴氨酸殘基［42］。

在毛霉目真菌中，除了三孢酸合成途徑中的基因外，一些與三孢酸合成及調(diào)控相關(guān)的基因也被分離出來，如性別決定基因（sexM/sexP）［46］、光誘導(dǎo)基因（crgA）［47］及尿嘧啶合成酶基因（pyrG）［48］等，這些基因?qū)M(jìn)一步了解三孢酸合成代謝的分子機(jī)制有重要意義。其中性別決定基因sexM/sexP與三孢酸合成的調(diào)控有密切聯(lián)系，sexM/sexP控制著毛霉目真菌的有性生殖，該基因含有一段編碼HMG-轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列，序列右側(cè)為一個(gè)RNA解旋酶基因，左側(cè)為一個(gè)磷酸丙糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因［46］。該基因在（+）菌中被命名為sexP，在（-）菌中被命名為sexM，二者均為單拷貝基因。當(dāng)布拉克須霉（+）/（-）菌混合培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)sexM/sexP的轉(zhuǎn)錄水平均大幅增加，推測(cè)可能是因?yàn)槭艿搅巳咚犷惢衔锏拇碳?，但是具體作用機(jī)制還不清楚。對(duì)高大毛霉的研究發(fā)現(xiàn)，三孢酸類化合物對(duì)sexP的調(diào)控作用要比sexM小得多。目前已表征了高大毛霉中sexM/sexP的結(jié)構(gòu)［49］，sexP和sexM的基因產(chǎn)物SexP和SexM的生理作用可能是誘導(dǎo)接合菌的性別分化。研究發(fā)現(xiàn)SexM蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的101～106（QQRRKY）位處是一段細(xì)胞核定位序列，這使得SexM蛋白不需要其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)就可以直接進(jìn)入到細(xì)胞核中，但目前對(duì)于SexP在細(xì)胞中的定位還不了解。

5　存在問題與展望

發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素符合營(yíng)養(yǎng)健康的消費(fèi)理念，具有廣闊的商業(yè)前景。但目前在擴(kuò)大生產(chǎn)上仍然面臨著諸多問題，其中最嚴(yán)峻的就是生產(chǎn)菌種產(chǎn)量低。近年來，通過培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化、發(fā)酵工程技術(shù)的運(yùn)用，使菌種的產(chǎn)量有了極大的提高，但仍不能滿足工業(yè)化的需求。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程越來越多地運(yùn)用到了育種技術(shù)中，使得菌種得到進(jìn)一步優(yōu)化。三孢布拉氏霉菌具有生長(zhǎng)迅速、生物量大、類胡蘿卜素產(chǎn)量高（4～5 g·L-1）等明顯優(yōu)勢(shì)，成為進(jìn)入規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)類胡蘿卜素的主要微生物；但由于三孢布拉氏霉菌類胡蘿卜素合成途徑復(fù)雜、遺傳轉(zhuǎn)化困難，目前對(duì)其基因功能、代謝調(diào)控、遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究還較少，有待于深入研究。

三孢酸是影響三孢布拉氏霉類胡蘿卜素產(chǎn)量的一個(gè)重要影響因素，其生物合成途徑還有許多待完善的地方，如代謝途徑中的許多基因還沒有找到、一些中間代謝物質(zhì)還沒有被發(fā)現(xiàn)、一些酶的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)還有待深入研究。迄今，三孢酸代謝途徑中僅僅鑒定出了4種酶，這主要是由于絲狀真菌的基因組結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，利用傳統(tǒng)技術(shù)克隆基因步驟煩瑣、工作強(qiáng)度大、存在一定的技術(shù)難度。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，依據(jù)全基因組的序列信息克隆基因大大降低了基因克隆的難度和工作量。近期，美國(guó)JGI（Jointed Genome Institute）公布了布拉克須霉全基因組的序列分析結(jié)果［50］，利用布拉克須霉的基因組數(shù)據(jù)可以對(duì)比克隆三孢布拉氏霉菌中的同源基因，布拉克須霉的全基因組序列分析信息為三孢布拉氏霉菌中三孢酸合成代謝及其調(diào)控機(jī)制的研究提供了有利條件。

三孢酸合成代謝的研究有利于更好地調(diào)控三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。此外三孢酸調(diào)控類胡蘿卜素合成機(jī)制的闡明，對(duì)提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素及其他萜烯類化合物的產(chǎn)量有重要意義。但是目前關(guān)于三孢酸對(duì)類胡蘿卜素合成的具體調(diào)控機(jī)理尚不清楚，Sun等［25-27］認(rèn)為三孢酸是通過刺激類胡蘿卜素合成途徑中相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控類胡蘿卜素的合成；Thomas等［24］認(rèn)為三孢酸是通過影響類胡蘿卜素代謝途徑中的相關(guān)酶的合成來發(fā)揮調(diào)控作用，但具體作用位點(diǎn)是哪幾個(gè)酶還未研究清楚。

References

［1］ BERNARDO D R， DANIEL W B， MARIA A Z C. Technological aspects of β-carotene production ［J］. Food and Bioprocess Technology， 2011， 4： 693-701.

［2］ KAMLA M， JAYANTI T， SNEH G. Microbial pigments： a review ［J］. International Journal of Microbial Resource Technology， 2012， 1（4）：361-366.

［3］ SUTTER R P， RAFELSON M E. Separation of β-factor synthesis from stimulated β-carotene synthesis in mated cultures of Blakeslea trispora ［J］. Journal of Bacteriology， 1968， 95（2）： 426-432.

［4］ AUSTIN D G， BU'LOCK J D， WINSTANLEY D J. Trisporic acid biosynthesis and carotenogenesis in Blakesleea trispora ［J］. Biochemical Journal， 1969， 113（3）： 34.

［5］ GOODAY G W， CARLILE M J. The discovery of fungal sex hormones（Ⅲ）： Trisporic acid and its precursors ［J］. Mycologist， 1997，11（3）： 126-130.

［6］ 徐軍偉， 徐芳， 袁其朋. 三孢酸結(jié)構(gòu)類似物對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的影響 ［J］. 北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)， 2007， 34（2）：134-137. XU J W， XU F， YUAN Q P. Effect of abscisic acid related compounds on lycopene production by Blakeslea trispora ［J］. Journal of Beijing University of Chemical Technology， 2007， 34（2）： 134-137.

［7］ 師艷秋， 辛秀蘭， 袁其朋. 發(fā)酵促進(jìn)劑在三孢布拉霉生產(chǎn)番茄紅素中的應(yīng)用 ［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2012， 38（1）：133-136. SHI Y Q， XIN X L， YUAN Q P. The fermentation accelerant on lycopene production by Blakeslea trispora ［J］. Food and Fermentation Industries， 2012， 38（1）： 133-136.

［8］ CHANDI G K， GILL B S. Production and characterization of microbial carotenoids as an alternative to synthetic colors： a review［J］. International Journal of Food Properties， 2011， 14（3）： 503-513.

［9］ BINA J M， LUIS M S. New mutants of Phycomyces blakesleeanus for β-carotene production ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1997， 63（9）： 3657-3661.

［10］ WANG G S， HARTMUT G， KHALED A A， et al. High-level production of the industrial product lycopene by the photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2012， 78（20）： 7205-7215.

［11］ HERNáNDEZ-ALMANZA A， MONTA?EZ-SáENZ J， MARTíNEZáVILA C， et al. Carotenoid production by Rhodotorula glutinis YB-252 in solid-state fermentation ［J］. Food Bioscience， 2014， 7：31-36.

［12］ BEN-AMOTZ A. New mode of Dunaliella biotechnology： two-phase growth for β-carotene production ［J］. Journal of Applied Phycology，1995， 7（1）： 65-68.

［13］ SUN T， MIAO L T， LI Q Y， et al. Production of lycopene by metabolically-engineered Escherichia coli ［J］. Biotechnology Letters，2014， 36（7）： 1515-1522.

［14］ XIE W P， YE L D， LV X M， et al. Sequential control of biosynthetic pathways for balanced utilization of metabolic intermediates in Saccharomyces cerevisiae ［J］. Metabolic Engineering， 2015， 28： 8-18.

［15］ BARREDO J L. Microbial carotenoids from bacteria and microalgae［J］. Methods in Molecular Biology， 2012， 892： 133-141.

［16］ 張闖， 張玉蒼， 何連芳. 不同微生物生產(chǎn)類胡蘿卜素的研究現(xiàn)狀［J］. 食品研究與開發(fā)， 2011， 32（2）： 180-183. ZHANG C， ZHANG Y C， HE L F. Comparative study on microbial production of carotenoids ［J］. Food Research and Development， 2011，32（2）： 180-183.

［17］ LAMPILA L E， WALLEN S E， BULLERMAN L B. A review of factors affecting biosynthesis of carotenoids by the order Mucorales［J］. Mycopathologia， 1985， 90： 65-80.

［18］ BHOSALE P. Environmental and cultural stimulants in the production of carotenoids from microorganisms ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2004， 63（4）： 351-361.

［19］ SATYA D， MODI V V， JANI U K. Chemical regulators of carotenogenesis by Blakeslea trispora ［J］. Phytochemistry， 1980，19（5）： 795-798.

［20］ KONSTADINA N， TRIANTAFYLLOS R. Oxidative stress response and morphological change of Blakeslea trispora induced by butylated hydroxytoluene during carotene production ［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2010， 160： 2415-2423.

［21］ XU F， YUAN Q P， ZHU Y. Improved production of lycopene and β-carotene by Blakeslea trispora with oxygen-vectors ［J］. Process Biochemistry， 2007， 42： 289-293.

［22］ SEON-WON K， WEON-TAEK S， YOUNG-HOON P. Enhanced production of β-carotene from Blakeslea trispora with Span 20 ［J］. Biotechnology Letters， 1997， 19（6）： 561-562.

［23］ GOVIND N S， AMIN A R， MODI V V. Stimulation of carotenogenesis in Blakeslea trispora by cupric ions ［J］. Phytochemistry， 1982， 21（5）： 1043-1044.

［24］ THOMAS D M， HARRIS R C， KIRK J T O， et al. Studies on carotenogenesis in Blakeslea trispora （Ⅱ）： The mode of action oftrisporic acid ［J］. Phytochemistry， 1967， 6（3）： 361-366.

［25］ SUN J， LI H， YUAN Q P. Metabolic regulation of trisporic acid on Blakeslea trispora revealed by a GC-MS-based metabolomic approach ［J］. PLoS ONE， 2012， 7（9）： 443-452.

［26］ SUN J， LI H， SUN X X， et al. Trisporic acid stimulates gene transcription of terpenoid biosynthesis in Blakeslea trispora ［J］. Process Biochemistry， 2012， 47（12）： 1889-1893.

［27］ SUN J， SUN X X， TANG P W， et al. Molecular cloning and functional expression of two key carotene synthetic genes derived from Blakeslea trispora into E. coli for increased β-carotene production ［J］. Biotechnology Letters， 2012， 34（11）： 2077-2082.

［28］ BARRERO A F， MAR H M， PILAR A， et al. A minor dihydropyran apocarotenoid from mated cultures of Blakeslea trispora ［J］. Molecules， 2012， 17（11）：12553-12559.

［29］ DOREEN S， ANJA D， KLAUS-DIETER M， et al. Cooperative biosynthesis of trisporoids by the （+） and （-） mating types of the zygomycete Blakeslea trispora ［J］. ChemBioChem， 2008， 9（18）：3004-3012.

［30］ SCHACHTSCHABEL D， SCHIMEK C， W?STEMEYER J， et al. Biological activity of trisporoids and trisporoid analogues in Mucor mucedo （-） ［J］. Phytochemistry， 2005， 66（11）： 1358-1365.

［31］ YAMUNA S， KERSTIN K， WILHELM B， et al. Early and late trisporoids differentially regulate β-carotene production and gene transcript levels in the Mucoralean fungi Blakeslea trispora and Mucor mucedo ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2013，79（23）： 7466-7475.

［32］ VERESHCHAGINA O A， TERESHINA V M. Trisporoids and carotenogenesis in Blakeslea trispora ［J］. Microbiology， 2014， 83（5）：438-449.

［33］ PRIETO A， SPALLA C， BIANCHI M. Biosynthesis of β-carotene by strains of Choanephoraceae ［J］. Chemistry and Industry， 1964， 13：551-551.

［34］ SUTTER R P. Trisponic acid synthesis in Blakeslea trispora ［J］. Science， 1970， 168（3939）： 1590-1592.

［35］ BU'LOCK J D， JONES B E， TAYLOR D， et al. Sex hormones in Mucorales. The incorporation of C20and C18precursors into trisporic acids ［J］. Journal of General Microbiology， 1974， 80（1）： 301-306.

［36］ SUTTER R P， CAPAGE D A， HARRISON T L. Trisporic acid biosynthesis in separate plus and minus cultures of Blakeslea trispora：identification by Mucor assay of two mating-type-specific components ［J］. Journal of Bacteriology， 1973， 114（3）： 1074-1082.

［37］ BU'LOCK J D， JONES B E， WINSKILL N. The apocarotenoid system of sex hormones and prohormones in Mucorales ［J］. Pure and Applied Chemistry， 1976， 47： 191-202.

［38］ SCHACHTSCHABEL D， BOLAND W. Efficient generation of a trisporoid library by combination of synthesis and biotransformation［J］. The Journal of Organic Chemistry， 2007， 72（4）： 1366-1372.

［39］ GESSLER N N， SOKOLOV A V， BELOZERSKAYA T A. Initial stages of trisporic acid synthesis in Blakeslea trispora ［J］. Applied Biochemistry and Microbiology， 2002， 38（6）： 536-543.

［40］ HUMBERTO R M， CERDá-OLMEDO E， AL-BABILI S. Cleavage oxygenases for the biosynthesis of trisporoids and other apocarotenoids in Phycomyces ［J］. Molecular Microbiology， 2011， 82（1）： 199-208.

［41］ ANKE B， MAREIKE R， KORNELIA S， et al.Cleavage of β-carotene as the first step in sexual hormone synthesis in zygomycetes is mediated by a trisporic acid regulated β-carotene oxygenase ［J］. Fungal Genetics and Biology， 2007， 44： 1096-1108.

［42］ ELLENBERGER S， SCHUSTER S， W?STEMEYER J. Correlation between sequence， structure and function for trisporoid processing proteins in the model zygomycete Mucor mucedo ［J］. Journal of Theoretical Biology， 2013， 320： 66-75.

［43］ SCHIMEK C， W?STEMEYER J. Carotene derivatives in sexual communication of zygomycete fungi ［J］. Phytochemistry， 2009， 70：1867-1875.

［44］ JANA W， OLAF S， ANKE B， et al. 4-Dihydrotrisporindehydrogenase， an enzyme of the sex hormone pathway of Mucor mucedo： purification， cloning of the corresponding gene， and developmental expression ［J］. Eukaryotic Cell， 2009， 8（1）： 88-95.

［45］ CHRISTINE S， ANNETT P， KORNELIA S， et al. 4-Dihydromethyltrisporate dehydrogenase， an enzyme of sex hormone pathway in Mucor mucedo， is constitutively transcribed but its activity is differently regulated in （+） and （-） mating types ［J］. Fungal Genetics and Biology， 2005， 42： 804-812.

［46］ JANA W， ANKE B， MELANIE K， et al. The mating-related loci sexM and sexP of the zygomycetous fungus Mucor mucedo and their transcriptional regulation by trisporoid pheromones ［J］. Microbiology，2012， 158： 1016-1023.

［47］ QUILES-ROSILLO M D， RUIZ-VáZQUEZ R M， VICTORIANO G，et al. Light induction of the carotenoid biosynthesis pathway in Blakeslea trispora ［J］. Fungal Genetics and Biology， 2005， 42（2）：141-153.

［48］ QUILES-ROSILLO M D， RUIZ-VáZQUEZ R M， VICTORIANO G，et al. Cloning， characterization and heterologous expression of the Blakeslea trispora gene encoding orotidine-5′-monophosphate decarboxylase ［J］. FEMS Microbiology Letters， 2003， 222（2）： 229-236.

［49］ ALEXANDER I， FELICIA J W， ANNA F， et al. Identification of the sex genes in an early diverged fungus ［J］. Nature， 2008，451：193-196.

［50］ http：//genome.jgi.doe.gov/.

Advances in sexual hormone trisporic acid biosynthesis in carotenoids producing Blakeslea trispora

ZHANG Xiaohui1， SU Sisi1， WANG Wenya1， YUAN Qipeng1， LI Qiang2
（1College of Life Science and Technology， Beijing University of Chemical Technology， Beijing 100029， China；2Department of Chemical Engineering， Tsinghua University， Beijing 100084， China）

Given that carotenoids are important fine chemicals， the Blakeslea trispora is receiving increasing attention since its higher industrial production of carotenoids. Numerous factors could affect the carotenoids production in Blakeslea trispora， among which the trisporic acid is one of the uttermost importance. In the present paper， the advances of biosynthesis of trisporic acid were reviewed， including summary of carotenoids production by fermentation， structure and biological function of trisporoids， biosynthetic pathway of trisporic acid and molecular biology of trisporic acid biosynthesis.

trisporic acid； Blakeslea trispora； carotenoids； Mucorales fungi； β-carotene

引　言

類胡蘿卜素（carotenoids）是一種天然著色劑，具有增強(qiáng)免疫力、清除自由基、抗氧化等功能，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)［1］。生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法有化學(xué)合成法、分離提取法和微生物發(fā)酵法，隨著消費(fèi)者對(duì)營(yíng)養(yǎng)、天然產(chǎn)品的需求，微生物源類胡蘿卜素逐漸受到廣大消費(fèi)者青睞［2］。自然界中，能合成類胡蘿卜素的微生物種類很多，目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)類胡蘿卜素最常用的菌種是三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）。三孢布拉氏霉屬于毛曲霉目、藻狀菌綱，是一種雌雄異體、具有（+）/（-）菌性別之分的絲狀真菌。單獨(dú)培養(yǎng)的三孢布拉氏霉（+）/（-）菌只能合成少量的類胡蘿卜素，混合培養(yǎng)時(shí)其類胡蘿卜素產(chǎn)量可提高10～15倍［3］，因?yàn)榛旌吓囵B(yǎng)時(shí)可以生成一種促進(jìn)類胡蘿卜素合成的刺激因子——三孢酸（trisporic acid，TSA）。

date： 2015-10-20.

WANG Wenya， wangwy@mail.buct.edu.cn；YUAN Qipeng， Yuanqp@mail.buct.edu.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China （21176018， 21576153） and the National High Technology Research and Development Program of China （2012AA02A701， 2015AA021001）.

Q 81

A

0438—1157（2016）05—1654—11

2015-10-20收到初稿，2015-12-13收到修改稿。

聯(lián)系人：王文雅，袁其朋。第一作者：張曉暉（1989—），女，碩士研究生。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21176018，21576153）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA02A701，2015AA021001）。